RNAシーケンシング解析によりEML造血前駆細胞における自己再生および分化を調節する重要な要因の同定

サマリー

RNAシークエンシングおよびバイオインフォマティクス解析は、マウスEMLcellsのリン、CD34 +およびリン-CD34-亜集団において有意にかつ差次的に発現する転写因子を同定した。これらの転写因子は、自己再生リン-CD34 +を、部分的に分化したリン-CD34-細胞との間の切り替えを決定する際に重要な役割を果たしている可能性がある。

要約

造血幹細胞（HSC）は、白血病やリンパ腫などの多くの疾患において、患者の造血系を再構築するために、移植治療のために臨床的に使用されている。 HSCの自己再生および分化を制御するメカニズムを解明することは研究および臨床用途のためのHSCのアプリケーションのために重要である。しかし、によりインビトロで増殖することができないことにHSCを大量に得ることができない。このハードルを克服するために、我々は、この研究のためのモデル系として、マウス骨髄由来の細胞株、EML（赤血球、骨髄、およびリンパ球）細胞株を使用した。

RNAシークエンシング（RNA-配列）がますます遺伝子発現研究のためのマイクロアレイを置き換えるために使用されてきた。ここではEML細胞の自己再生および分化の調節において潜在的な主要因を調査するためにRNA-配列技術を使用する具体的な方法を報告する。このホワイトペーパーで提供されるプロトコルは、3つの部分に分かれています。最初のパーtはどのように文化のEML細胞と独立したLIN-CD34 +およびLIN-CD34-細胞に説明しています。プロトコルの第2の部分は、トータルRNA調製およびハイスループット配列決定のための後続のライブラリー構築のための詳細な手順を提供しています。最後の部分は、RNA配列データ解析のための方法を説明し、リン、CD34 +およびリン-CD34-細胞との間の差次的に発現する転写因子を同定するためにデータを使用する方法について説明します。最も有意に差次的に発現される転写因子はEML細胞の自己再生および分化を制御する潜在的な重要な調節因子であると同定された。本稿の議論のセクションでは、この実験の成功パフォーマンスのための主要なステップを強調表示します。

要約すると、本論文では、EML細胞中で自己複製と分化の潜在的な調節因子を同定するために、RNA-配列技術を使用する方法を提供しています。特定された主要な要因は、in vitroおよびiの下流の機能解析に供されているn個の生体内。

概要

造血幹細胞は、成体骨髄ニッチに主に存在する稀な血液細胞である。これらは、血液および免疫系^1を補充するために必要な細胞の産生を担う。幹細胞の種類としては、HSCは、自己再生および分化の両方が可能である。 HSCの運命決定を制御するメカニズムの解明、自己複製または分化のどちらかに向かって、血液疾患の研究や臨床使用量²のためのHSCの操作に貴重なガイダンスを提供します。研究者が直面する問題の一つは、HSCが維持され、非常に限られた範囲でインビトロで増殖することができることである。その子孫の大部分は、部分的に文化²で分化されている。

ゲノムワイドスケールでの自己再生および分化の過程を制御する重要な調節因子を同定するために、我々は、モデル系としてマウス原始造血前駆細胞株EMLを使用した。目細胞株は、マウス骨髄^3,4から導出された。異なる成長因子を供給すると、EML細胞は、in vitroで ⁵ において赤血球、骨髄、およびリンパ系細胞に分化することができる。重要なことに、この細胞株は、幹細胞因子（SCF）を含む培地中で大量に増殖させることができ、それでもそれらの多能性を維持する。 EML細胞は、自己再生リン-SCA + CD34 +表面マーカーCD34およびSCA ⁶に基づいて、部分的に分化したリン-S....

プロトコル

1. EML細胞培養およびシステムおよび磁気細胞ソーティングの使用LIN-CD34 +およびLIN-CD34-細胞の分離蛍光を活性化細胞選別法

1. 幹細胞因子コレクションのベビーハムスター腎臓（BHK）細胞培養培地の調製：
   1. 37℃の細胞培養インキュベーター中、5％CO ₂で25cm ²のフラスコ（ 表1）、10％FBSを含むDMEM培地中で培養BHK細胞。
   2. 細胞が80まで成長する場合 - 90％コンフルエンス、10mlのPBSで細胞を1回洗浄します。単層に0.25％トリプシンEDTA溶液5ミリリットルを加え、細胞が剥離されるまで、室温（RT）で1-5分間細胞をインキュベート。
   3. ピペットで上下ソリューション優しく細胞の塊を分割する。トリプシン活性を停止するために、フラスコに完全DMEMを5ml追加します。 RTで5分間200×gでの遠心分離によって細胞を収集します。
   4. 培地を除去し、新鮮BHK細胞培養培地10ml中に細胞ペレットを再懸濁する。
   転送2新しい75cm ²のフラスコにステップ1.1.4からの細胞懸濁液mlのフラスコに新鮮なBHK細胞培養培地の48ミリリットルを追加します。
2. 培地を培養2日BHK細胞を収集。 0.45μmのフィルターを通過する媒体。さらに使用するまで-....

結果

リン- CD34 +およびCD34-リン-EML細胞において差次的に発現される遺伝子を分析するために、我々は、RNA配列の技術を使用した。 図1は、手順のワークフローを示している。磁気細胞選別による系統陰性細胞の単離後、我々は、LIN-SCA + CD34 +およびFACSアリアを使用してLIN-SCA-CD34-細胞を分離した。リン富化EML細胞を、抗CD34、抗のSca1および系統カクテル抗体で染色した。唯一のリニア細胞はのSca1及びCD34発現の分析のためにゲートした。二つの集団（SCA + CD34 +およびSCA-CD34- EML細胞）をFACS分析（ 図^2）6によって観察することができた。

細胞分離の後、我々は、それぞれCD34 +およびCD34-細胞からトータルRNAを抽出し、RNAの質を分析した。 RNA-配列データの精度は、主にRNA-配列ライブラリーの品質に依存して、総RNAの品質は、高品質のライブラリーを調製するために不可欠である。高品質のRNAサンプルは1〜OD 2.......

ディスカッション

哺乳動物のトランスクリプトームは^、34〜38は非常に複雑です。 RNA-配列技術はまた、遺伝子発現解析のための他の方法に勝る多くの利点を有する新規な転写産物の検出および一塩基変化の検出など 、トランスクリプトーム解析の研究においてますます重要な役割を果たしている。冒頭で述べたように、マイクロアレイのハイブリダイゼーションのアーチファクトを克服する新規の転写物のde novoを識別するために使用することができる。 RNAシークエンスの1つの制限は、サンガー配列と比較し、相対短い読み取り長である。しかし、シークエンシング技術の急速な改善と、長さが絶えず増加してお読みください。本稿では、マウスのEM​​L細胞の自己再生および分化に潜在的な重要な調節因子を特定するためにこの技術を使用する詳細な方法を提供する。

このプロトコルの最初の重要なステップは、EML細胞培養である。 EMLは、造血前駆細胞株であり、それはあり得るがSCFを大量に増殖させた。 EML細胞の培養条件は通常の不死化細胞株よりも多くの注意が必要です。細胞.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Antibiotic-Antimycotic	Invitrogen	15240-062	BHK cell culture
Anti-Mouse CD34 FITC	eBioscience	11-0341-81	FACS sorting
Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) PE	eBioscience	12-5981-81	FACS ソーティング
APC マウス系統抗体カクテル	BD Biosciences	558074	FACS ソーティング
BD FACSAria Cell Sorter	BD Biosciences	特別オファーsysmtem	FACSの選別
コーニング™細胞培養処理フラスコ 75 cm2	Corning incorporated	430641	Cell culture
Corning™細胞培養処理フラスコ 25 cm2	Corning incorporated	430639	細胞培養
デオキシリボヌクレアーゼ I, Amplification Grade	Invitrogen	18068-015	ライブラリー調製
DMEM	Invitrogen	11965-092	BHK 細胞培養
DPBS	Gibco	14190	細胞培養
HI FBS	Invitrogen	16140071	BHK細胞培養
馬 血清	Invitrogen	16050-122	EML 細胞培養
IMDM	HyClone	SH30228.02	EML 細胞培養
L-グルタミン	Invitrogen	25030-081	細胞培養
系統 細胞枯渇キット、マウス	Miltenyi Biotec	130-090-858	系統陰性細胞の単離
NanoVue Plus 分光光度計	GE Healthcare	28-9569-62	品質管理
Thermo Scientific™ナプコ&トレード;8000 Water-Jacketed CO2 インキュベーター	Thermo Scientific	15-497-002	細胞培養
ペニシリン-ストレプトマイシン	Invitrogen	15140-122	EML 細胞培養
TRIzol®試薬	Invitrogen	15596-018	RNA exraction
TruSeq™RNAサンプル調製キットv2 -セットB (48 rxn)	Illumina	RS-122-2002	ライブラリ調製
2100 電気泳動 バイオアナライザー 機器	Agilent	G2939AA	品質管理
0.25% トリプシン-EDTA	Gibco	25200	細胞培養
0.45 µm シリンジフィルター	Nalgene	190-2545	細胞培養