方法論記事

RNAシーケンシング解析によりEML造血前駆細胞における自己再生および分化を調節する重要な要因の同定

DOI：

10.3791/52104

⸱

2014年11月11日

 ,  ,  , 
1The Vivian L. Smith Department of Neurosurgery, Center for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Texas Health Science Center, The University of Texas Graduate School of Biomedical Sciences at Houston

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNAシークエンシングおよびバイオインフォマティクス解析は、マウスEMLcellsのリン、CD34 +およびリン-CD34-亜集団において有意にかつ差次的に発現する転写因子を同定した。これらの転写因子は、自己再生リン-CD34 +を、部分的に分化したリン-CD34-細胞との間の切り替えを決定する際に重要な役割を果たしている可能性がある。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

造血幹細胞（HSC）は、白血病やリンパ腫などの多くの疾患において、患者の造血系を再構築するために、移植治療のために臨床的に使用されている。 HSCの自己再生および分化を制御するメカニズムを解明することは研究および臨床用途のためのHSCのアプリケーションのために重要である。しかし、によりインビトロで増殖することができないことにHSCを大量に得ることができない。このハードルを克服するために、我々は、この研究のためのモデル系として、マウス骨髄由来の細胞株、EML（赤血球、骨髄、およびリンパ球）細胞株を使用した。

RNAシークエンシング（RNA-配列）がますます遺伝子発現研究のためのマイクロアレイを置き換えるために使用されてきた。ここではEML細胞の自己再生および分化の調節において潜在的な主要因を調査するためにRNA-配列技術を使用する具体的な方法を報告する。このホワイトペーパーで提供されるプロトコルは、3つの部分に分かれています。最初のパーtはどのように文化のEML細胞と独立したLIN-CD34 +およびLIN-CD34-細胞に説明しています。プロトコルの第2の部分は、トータルRNA調製およびハイスループット配列決定のための後続のライブラリー構築のための詳細な手順を提供しています。最後の部分は、RNA配列データ解析のための方法を説明し、リン、CD34 +およびリン-CD34-細胞との間の差次的に発現する転写因子を同定するためにデータを使用する方法について説明します。最も有意に差次的に発現される転写因子はEML細胞の自己再生および分化を制御する潜在的な重要な調節因子であると同定された。本稿の議論のセクションでは、この実験の成功パフォーマンスのための主要なステップを強調表示します。

要約すると、本論文では、EML細胞中で自己複製と分化の潜在的な調節因子を同定するために、RNA-配列技術を使用する方法を提供しています。特定された主要な要因は、in vitroおよびiの下流の機能解析に供されているn個の生体内。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

造血幹細胞は、成体骨髄ニッチに主に存在する稀な血液細胞である。これらは、血液および免疫系1を補充するために必要な細胞の産生を担う。幹細胞の種類としては、HSCは、自己再生および分化の両方が可能である。 HSCの運命決定を制御するメカニズムの解明、自己複製または分化のどちらかに向かって、血液疾患の研究や臨床使用量2のためのHSCの操作に貴重なガイダンスを提供します。研究者が直面する問題の一つは、HSCが維持され、非常に限られた範囲でインビトロで増殖することができることである。その子孫の大部分は、部分的に文化2で分化されている。

ゲノムワイドスケールでの自己再生および分化の過程を制御する重要な調節因子を同定するために、我々は、モデル系としてマウス原始造血前駆細胞株EMLを使用した。目細胞株は、マウス骨髄3,4から導出された。異なる成長因子を供給すると、EML細胞は、in vitroで 5 において赤血球、骨髄、およびリンパ系細胞に分化することができる。重要なことに、この細胞株は、幹細胞因子（SCF）を含む培地中で大量に増殖させることができ、それでもそれらの多能性を維持する。 EML細胞は、自己再生リン-SCA + CD34 +表面マーカーCD34およびSCA 6に基づいて、部分的に分化したリン-SCA-CD34-細胞の亜集団に分けることができる。短期HSCのと同様に、SCA + CD34 +細胞は、自己複製が可能である。 SCFで処理した場合、LIN-SCA + CD34 +細胞は急速に林-SCA + CD34 +およびLIN-SCA-CD34-細胞の混合集団を再生成し、6を増殖し続けることができます。つの集団は、形態学的に類似しており、c-キットmRNAおよびタンパク質6の同様のレベルを有する。リン-SCA-CD34-細胞はIL-3の代わりに、SCF 3を含有する培地中で増殖させることが可能である。 UnveilingのEML細胞の運命決定に重要な調節因子は、造血時の初期発生の移行における細胞および分子メカニズムのより良い理解を提供します。

自己複製リン-SCA + CD34 +および部分的に分化リン-SCA-CD34-細胞との間の根本的な分子の違いを調べるために、我々は、差次的に発現される遺伝子を同定するために、RNA配列を使用した。転写因子は、細胞の運命を決定する上で重要であるように、特に、我々は、転写因子に焦点を当てる。 RNA-seqがゲノム7,8から転写されたRNAをプロファイリングし、定量化するために、次世代シーケンシング（NGS）技術の能力を利用して最近開発されたアプローチです。簡単に述べると、トータルRNAは、ポリ選択と初期template.The RNAテンプレートは次いで逆転写酵素を用いてcDNAに変換されるように、断片化されている。 cDNAライブラリーを構築するために、無傷の、非分解RNAを用いて、完全長のRNA転写物をマッピングするために重要である。 PURのためシークエンシングの姿勢は、特定のアダプター配列は、cDNAの両端に付加される。そして、ほとんどの場合、cDNA分子は、PCRによって増幅され、ハイスループット様式で配列決定した。

シーケンシング後、得られたは参照ゲノムとトランスクリプトームデータベースに整列させることができる読み取ります。数は、参照遺伝子のマップがカウントされ、この情報は、遺伝子発現のレベルを推定するために使用できることを読み取る。読み込みは、非モデル生物9にトランスクリプトームの研究を可能にする、参照ゲノムなしデノボ組み立てることができる。 RNA-seqの技術は、スプライスアイソフォーム10-12、新規な転写物13および14の遺伝子融合を検出するために使用されてきた。タンパク質をコードする遺伝子の検出に加えて、RNA-配列はまた、新規に検出し、そのような18の非コードRNA 15,16、マイクロRNA 17は、siRNA などの長い非コードRNAの転写レベルを分析するために使用され得る。なぜなら、tの彼は、この方法の精度は、単一ヌクレオチド変異19,20の検出に利用されている。

RNA-配列技術の出現の前に、マイクロアレイは、遺伝子発現プロファイルを分析するために使用される主要な方法であった。予め設計されたプローブは、マイクロアレイスライド21を形成するように合成し、続いて固体表面に付着される。 mRNAを抽出し、cDNAに変換される。逆転写プロセスの間に、蛍光標識されたヌクレオチドは、cDNAに組み込まれ、cDNAはマイクロアレイスライドにハイブリダイズさせることができる。特定の場所から収集された信号の強度は、そのスポット21上の特異的プローブに結合したcDNAの量に依存する。 RNA-配列技術と比較して、マイクロアレイはいくつかの限界がある。 RNA-配列技術は、その使用が制限されるとき、比較的高いバックグラウンドレベルで新規な転写物を検出することが可能であるが、まず、マイクロアレイは、遺伝子アノテーションの既存の知識に依存している葛ね発現レベルが低い。による背景信号が飽和し、マイクロアレイの精度は両方の高度に発現される遺伝子と低い7,22のため制限され、一方でまた、RNA-配列技術は、検出（8000倍）7の非常に高いダイナミックレンジを有する。最後に、マイクロアレイプローブは、一つのサンプル23内の異なる転写物の相対発現レベルを比較した場合、結果はあまり信頼性を高めるそれらのハイブリダイゼーションの効率、が異なる。 RNA-配列がマイクロアレイに比べて多くの利点を有するが、そのデータ分析は複雑である。これは、多くの研究者がまだRNA-配列の代わりに、マイクロアレイを使用する理由の一つです。様々なバイオインフォマティクスツールは、RNA配列のデータ処理および分析24のために必要とされる。

いくつかの次世代シーケンサー（NGS）のプラットフォームのうち、454、イルミナ、SOLIDとイオントレントは、最も広く使用されているものである。 454は最初の商用NGSプラットフォームだった。他のシーケンシングプラットフォームとは対照的にそのようなイルミナ固体として、454プラットフォームは、より長い読みの長さ（平均700ベースの読み取り）25を生成します。長くは、その高い効率25を組み立てるためにtranscriptiomeの初期特性評価のための優れている読み取ります。 454プラットフォームの主な欠点は、シーケンスのメガベース当たりのコストが高いことである。イルミナとSOLIDプラットフォームは増大した数と短い長さで読み込み、生成する。シーケンスのメガベース当たりのコストは、454プラットフォームよりもはるかに低い。が短いため、大量のデータ分析がはるかに計算集約され、イルミナとSOLIDプラットフォーム用に読み取ります。イオントレントプラットフォーム用のシーケンシングするための機器および試薬の価格は安いですし、シーケンシング時間は25短い。しかし、エラーレートとシーケンスのメガベース当たりのコストは、イルミナとSOLIDプラットフォームに比べて高くなっている。異なるプラットフォームは、独自の長所と短所を持っており、データ解析のために異なる方法を必要とする。ナンプラーTFORMは、配列決定の目的や資金の利用可能性に基づいて選択する必要があります。

本稿では、例として、イルミナRNA-のSeqプラットフォームを取る。我々は、EMLの細胞の自己再生および分化において重要な調節因子を調査するためのモデル系としてEML細胞を使用し、発現量の計算および新規な転写産物を検出するためのRNA-配列ライブラリーの構築およびデータ分析の詳細な方法を提供した。我々は、機能テスト（ 例えば shRNAのノックダウン）と結合EMLモデルシステム2のRNA-seqの研究は、造血分化の初期段階の分子機構を理解する上での強力なアプローチを提供し、として機能することができるという本発明者らの以前の刊行物に示されている一般に、細胞の自己再生および分化の分析のためのモデル。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. EML細胞培養およびシステムおよび磁気細胞ソーティングの使用LIN-CD34 +およびLIN-CD34-細胞の分離蛍光を活性化細胞選別法

  1. 幹細胞因子コレクションのベビーハムスター腎臓（BHK）細胞培養培地の調製：
    1. 37℃の細胞培養インキュベーター中、5％CO 2で25cm 2のフラスコ（ 表1）、10％FBSを含むDMEM培地中で培養BHK細胞。
    2. 細胞が80まで成長する場合 - 90％コンフルエンス、10mlのPBSで細胞を1回洗浄します。単層に0.25％トリプシンEDTA溶液5ミリリットルを加え、細胞が剥離されるまで、室温（RT）で1-5分間細胞をインキュベート。
    3. ピペットで上下ソリューション優しく細胞の塊を分割する。トリプシン活性を停止するために、フラスコに完全DMEMを5ml追加します。 RTで5分間200×gでの遠心分離によって細胞を収集します。
    4. 培地を除去し、新鮮BHK細胞培養培地10ml中に細胞ペレットを再懸濁する。
      5. 転送2新しい75cm 2のフラスコにステップ1.1.4からの細胞懸濁液mlのフラスコに新鮮なBHK細胞培養培地の48ミリリットルを追加します。
  2. 培地を培養2日BHK細胞を収集。 0.45μmのフィルターを通過する媒体。さらに使用するまで-20℃でのメディアを保管してください。
  • EML細胞培養：
    1. 細胞培養インキュベーター中で37℃、5％CO 2で、BHK細胞培養培地（ 表1）を含むEML塩基性媒体中で培養EML細胞（懸濁液中）。
    2. ピーク未満の密度6×10 5細胞/ mlの低細胞密度（0.5〜5×10 5細胞/ ml）をEMLで細胞を維持する。 5：1の割合で2〜3日おきにセルを分割します。継代EML細胞を静かにし、10世代にわたって継代後の培養を捨てる。
  • 系統陽性細胞の枯渇：
    1. 200×gでのFOでの遠心分離によってEML細胞を収穫R 5分間、PBSで細胞を1回洗浄します。 5分間200×gでの遠心分離によって細胞を収集します。
    2. PBSで細胞を再懸濁し、血球計算板を用いて細胞を数える。 （細胞単離システムのプロバイダによって提供される説明書を参照してください）​​は、細胞の数に応じてその後の細胞分離工程で抗体濃度を決定します。
    3. 系統陰性（リニア）を単離系統抗体カクテル（ビオチン結合モノクローナル抗体のカクテルを用いて細胞、CD5、CD45R（B220）、のCD11b、抗GR-1（LY-6G / C）、7-4とテル-119 ）で製造業者の指示に従って、磁気活性化細胞選別システム。
  • LIN-CD34 +およびLIN-CD34-細胞の分離：
    1. 5分間200×gでのステップ1.3.3からのリニア細胞をスピンダウン。 PBSで細胞ペレットを再懸濁し、血球計算板を用いて細胞を数える。
    2. FACS緩衝液で2回細胞を洗浄し、200×gで細胞をペレット5分間。
    3. それぞれ番号1、2、3、4、5で5 1.5mlの微小管にラベルを付ける。 10 6個の細胞（試験管当たり10 6細胞）当たり100μlのFACS緩衝液で細胞を再懸濁。
    4. チューブ1とチューブ2に抗マウスCD34 FITC抗体1μgのを加え、穏やかにチューブを混ぜる。
    5. 暗闇の中で1時間、4℃で、全てのチューブをインキュベートします。
    6. にチューブ3にPE結合抗のSca1抗体のPE結合抗のSca1抗体及びチューブ1へのAPC結合リネージュカクテル抗体20μlの0.25μgの、0.25μgのを追加し、APC標識リネージュカクテル抗体20μlのチューブ4。
    7. 優しく全てのチューブを混合し、暗闇の中でさらに30分間、4℃で細胞をインキュベートする。
    8. 細胞にFACS緩衝液300μlのを追加し、5分間200×gで細胞をスピンダウン。
    9. 3回のFACS緩衝液500μlで細胞を洗浄。
    10. FACS BU500μlに細胞ペレットを再懸濁ffer。
    11. 補償を設定するために、チューブ2、3、4、および5の細胞を使用する。 FACSアリアを使用したチューブ1におけるLIN-SCA + CD34 +およびLIN-SCA-CD34-細胞を単離する。

    • 2.高スループットシーケンシングのためのRNAの調製およびライブラリー構築

    1. 単離、RNAの品質分析および定量。
      1. 製造 'プロトコル以下のTRIzolを使用して、それぞれの林-CD34 +およびLIN-CD34-細胞から全RNAを抽出します。
      2. 製造業者のプロトコルに従って汚染されたDNAを用いて、デオキシリボヌクレアーゼI（DNaseI）を取り外します。必要に応じて、さらに使用するため、このステップで-80℃でRNAを保存する。
      3. 供給業者が提供する指示に従って、バイオアナライザーを用いて総RNAの品質を評価する。 RNA完全性番号（RIN）9よりラガーとRNAサンプルを使用してください。
    2. ライブラリーの構築およびハイスループットシークエンシング：
      注：このプロトコルは、イルミナのプラットフォームを用いてRNA-配列について説明します。のために他のシーケンシングプラットフォームは、異なるライブラリの調製方法が必要とされる。
      1. ライブラリ調製のためのサンプルあたりの高品質の全RNA 0.1-4μgのを使用してください。通常、2μgの全RNAは、10 5 EML細胞から抽出することができる。
      2. 第一および第二鎖cDNA合成、最後の修復、3 'プロバイダの指示の詳細な標準的手順に従って、アデニル化、アダプターライゲーションとPCR増幅を終了し、RNA精製および断片化RNA配列決定サンプル調製システムを使用する。
        1. 積極的にオリゴdT磁気ビーズを使用してポリA mRNAを選択して、mRNAを断片化する。
        2. cDNAを得るために、ランダムプライマーを用いて逆転写を行い、続いて二本鎖cDNAを生成するために、cDNAの第二鎖を合成する。
        3. 3 'オーバーハングを5埋める「取り外しDNAポリメラーゼによるオーバーハングを。アデニル3 'は、互いに連結することからcDNA断片を防止するために終了する。
        4. dscDNAの両端にマルチプレックスインデクシングアダプタを追加します。 DNA断片の濃縮のためのPCRを行います。
      3. 分光光度計を使用してライブラリの濃度に関する情報を得るためにA260 / A280を測定します。
      4. ライブラリーの質を評価し、バイオアナライザを用いてDNA断片のサイズ範囲を測定する。

    3.データ解析

    この部分で使用されているソフトウェアの参考のために、（ 表2）を参照してください。

    1. 下流の分析のためのデータファイル処理：
      1. .bcl（ベースコールファイル）CASAVAソフトウェア（イルミナ、バージョン1.8.2）を使用してファイルを.fastqにファイル変換します。
        1. Linuxシステムの「ターミナル」を起動する。イルミナHiSeq2000シーケンシングマシンからデータファイルを含むデータのフォルダに移動します。結果フォルダである「NASboy1 / JiaqianLabData / HiSeq_RUN / 2013_07_11 / 130627_SN860_0309_A_2013-166_H0PW9ADXX / '、種類を仮定図S1A内のコマンドで、データのフォルダを入力してください。
        2. LinuxシステムでCASAVA 1.8.2をインストールします。 outputfolderが「アンアラインド」であるとし、変換するためのコンフィギュレーション·ファイルを準備するために、図S1Bでコマンドを使用します。一つだけ.fastqファイルは、各サンプルのために作成されていることを確認するために--fastqクラスタカウント0オプションを使用します。生成されたファイルは.gzの.fastq形式です。下流の分析（ 図S1B）のためにそれを解凍します。
        3. 「アンアラインド'フォルダが生成された後、「アンアラインド'フォルダ（ 図S1C）に行く。
        4. 変換プロセスを開始するために、図S1Dでコマンドを使用します。 「-j 'パラメータが使用され、CPUの数を提供しています。
        5. システムは変換処理を終えた後、「アンアラインド'フォルダ（ 図S1E）の下で結果フォルダに移動します。
        6. <図S1Fでコマンドを使用します/ strong>の各サンプルフォルダの下.fastqファイルに.fastq.gzファイルを解凍します。
    2. 新規転写物を検出し、Tuxedoのスイート26を用いて発現レベルを評価します。
      1. RNA-seqが（から得UCSCのバージョンMM9、マウスの参照ゲノムに読み込み、ペアエンドにマップhttp://cufflinks.cbcb.umd.edu/igenomes.html使用しています）トップハットソフトウェアを使用します（バージョン1.3.3）27、ボウタイはマッパ（バージョン0.12.7）28をお読みください。トップハットは、発現量の推定精度を向上させる「-no-小説juncs」オプションが供給される。
        1. マッピングプロセスが実装されたフォルダに.fastqファイルを置く。ペアエンドシーケンシングサンプルの2 .fastqファイル（Example1.read1、Example1.read2に名前変更）、（システム設定に応じてパラメータを調整する）マッピングを行うために、図S2でコマンドを使用があると仮定します。"-p"パラメータが使用され、CPUの数を提供しています。 「-r」と「-mate-STD-devの"パラメータは、ライブラリQCから得たり（ 図S2は ）整列のサブセットから読み取る推測することができる。
      2. カフスソフトウェアを使用してRNA転写物に読み込むマッピングされた（バージョン1.3.0）29を組み立てます。既知遺伝子（トップハットで使用されるのと同じ.gtfファイル）とトップハットによって生成.bamファイルの注釈ファイルを使用してファイル名を指定して実行カフス。
        1. トップハットは、実行が終了した後に、同じフォルダに、トランスクリプトームと推定転写産物の発現レベルを構築するためにカフスボタンを実行するために、図S3Aでコマンドを使用します。 「GenomeSeqMM9」フォルダ内の「mm9_repeatMasker.gtf 'とゲノム配列ファイルは、UCSCゲノムブラウザから得ることができる。
        2. その結果genes.exprとtranscripts.exprファイルが遺伝子や転写産物（アイソフォーム）の式の値が含まれています。コピーアンドペーストExcelへのファイルの内容をファイルやスプレッドシート·アプリケーション（ 図S3B）で操作します。
        3. 小説転写物を同定するために、リファレンス「mm9_genes.gtf 'ファイルに生じた「transcripts.gtf'ファイルを比較するために、図S3Cでコマンドを使用します。
        4. 結果の.tmapファイルは、比較結果が含まれています。コピーしてExcelファイルにファイルの内容を貼り付け、スプレッドシートアプリケーションで操作します。クラスコードを持つ転写産物'U'が（ 図S3D）提供されたファイル.gtfリファレンスに比べて「小説」として考えることができる。
          注：値は0.1の下にある場合、下流の分析の利便性のために、0.1にFPKM値を設定します。
          注： ステップ3.2.3 - 3.2.6は、新規転写産物'式の推定精度を向上させたい人のためのオプションです。マッピングおよびトランスクリプトームの構造をrにする必要があるため、これは非常に長い時間がかかる国連回以上。
      3. デフォルトのパラメータを使用して、トップハット実行し、 図S3Eでコマンドを使用して生成.gtfファイルへのカフスボタンを実行します。
      4. 図S3Fでコマンドを使用して、リファレンスゲノム.gtfファイルに結果の.gtfファイルを比較してください。
      5. ステップ3.2.2.4で説明したようになった.tmapファイルを解析します。コピーしてExcelファイルにファイルの内容を貼り付け、スプレッドシートアプリケーションで操作します。クラスコードを有する転写物uは提供されているファイル.gtf基準と比較して「新規」と考えることができる。
      6. ステップ3.2.5の後、ファイル.gtf基準として使用することができるフォルダ内.combined.gtfファイルが存在する。 ステップ3.2.1および3.2.2に記載したように、トップハットとカフスのセカンドランは、新規な転写産物のより正確なFPKM推定を得るために行うことができる。
    3. differentiall検出DESeqパッケージ30を使用してyの発現された遺伝子。
      1. DESeqの入力は、生の読み取りカウントテーブルである。このような表を得るためには、HTSeqのウェブサイトからダウンロードすることができますHTSeq Pythonパッケージと一緒に配布htseqカウントスクリプトを使用（ http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/doc/count.html ） 。
        1. samtools、パイソン、およびhtseqカウントprogramsareがシステムにインストールされていることを確認してください。 図S4Aでコマンドを使用して、トップハット出力からの生のリードカウント数を取得します。
        2. 「Raw_Count_Table.txt「Excelを使用して、「ExperimentDesign.txt 'ファイルを準備します。 DESeq Rパッケージ（ 図S4B）用の.txt形式でコンテンツをコピーして保存します。
        3. システム内のRプログラムをインストールします。ターミナルでは、タイプ「R」キーを押しENTER.A画面メッセージがappearasは、 図S4Cに示したでしょう。
        4. 「Raw_Cを読む図S4Dでコマンドを使用してRにount_Table.txt '、' ExperimentDesign.txt」。
        5. 図S4Eでコマンドを使用してDESeqパッケージをロードします。
        6. R（ 図S4F）で因数分解条件。
        7. 正規化されたカウントテーブルの上に負の二項テストを実行するために、図S4Gでコマンドを使用します。
        8. .csvファイルに出力著しい差発現された遺伝子に、図S4Hでコマンドを使用します。
    4. Excelを使用して試料にわたってルックアップ転写因子」（TFS）FPKM値。 DE遺伝子テーブルとのTFテーブルと交差する。遺伝子は、両方のテーブルに属し示差的転写因子を発現する。
      1. ウェブサイトに行くhttp://www.bioguo.org/AnimalTFDB/download.phpおよび転写因子をダウンロードします。その後<（ExcelでDE転写因子を検索強い>図S5）。
    5. UCSCゲノムブラウザの可視​​化のための.bigwigファイルを生成する。
      1. ウェブサイトから「bedtools「ソフトウェアパッケージをダウンロードしhttps://github.com/arq5x/bedtools2し、システム31にソフトウェアをインストールします。 UCSCツール「bedGraphToBigWig」はウェブサイトからダウンロードしhttp://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/およびシステム内のソフトウェアをインストールします。
      2. .bamファイルを含むフォルダで、.bedファイルにトップハットによって生成された.bamファイルを変換するには、図S6Aでコマンドを使用します。
      3. .bedファイルが生成された後、.bigwigファイルを生成するために、図S6Bでコマンドを使用します。ファイル 'ChromInfo.txt'は、以下のURLから入手できます。ARGET = "_blank"> http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm9/database/chromInfo.txt.gz。
      4. UCSCゲノムブラウザ上のカスタムトラックを守ってください。 Webサイトを参照してくださいhttp://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/customTrack.html UCSCゲノムブラウザを使用してカスタムトラックを表示する方法について。

    figure-protocol-1
    図S1：CASAVAソフトウェアを使用してファイルを.fastqに変換する.bclファイル。

    figure-protocol-2
    図S2：マッピングトップハットを使用してゲノムを参照するために読み取ります。

    figure-protocol-3 図S3：新規な転写産物の検出および発現量推定。

    figure-protocol-4
    図S4：DESeqパッケージを使用して差分発現された遺伝子を呼び出す。

    figure-protocol-5
    図S5：差次的に発現する転写因子の同定。

    figure-protocol-6
    図S6：データ可視化のための変換マッピング結果。

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    結果

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    リン- CD34 +およびCD34-リン-EML細胞において差次的に発現される遺伝子を分析するために、我々は、RNA配列の技術を使用した。 図1は、手順のワークフローを示している。磁気細胞選別による系統陰性細胞の単離後、我々は、LIN-SCA + CD34 +およびFACSアリアを使用してLIN-SCA-CD34-細胞を分離した。リン富化EML細胞を、抗CD34、抗のSca1および系統カクテル抗体で染色した。唯一のリニア細胞はのSca1及びCD34発現の分析のためにゲートした。二つの集団（SCA + CD34 +およびSCA-CD34- EML細胞）をFACS分析（ 図2）6によって観察することができた。

    細胞分離の後、我々は、それぞれCD34 +およびCD34-細胞からトータルRNAを抽出し、RNAの質を分析した。 RNA-配列データの精度は、主にRNA-配列ライブラリーの品質に依存して、総RNAの品質は、高品質のライブラリーを調製するために不可欠である。高品質のRNAサンプルは1〜OD 2...

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    ディスカッション

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    哺乳動物のトランスクリプトームは、34〜38は非常に複雑です。 RNA-配列技術はまた、遺伝子発現解析のための他の方法に勝る多くの利点を有する新規な転写産物の検出および一塩基変化の検出など 、トランスクリプトーム解析の研究においてますます重要な役割を果たしている。冒頭で述べたように、マイクロアレイのハイブリダイゼーションのアーチファクトを克服する新規の転写物のde novoを識別するために使用することができる。 RNAシークエンスの1つの制限は、サンガー配列と比較し、相対短い読み取り長である。しかし、シークエンシング技術の急速な改善と、長さが絶えず増加してお読みください。本稿では、マウスのEM​​L細胞の自己再生および分化に潜在的な重要な調節因子を特定するためにこの技術を使用する詳細な方法を提供する。

    このプロトコルの最初の重要なステップは、EML細胞培養である。 EMLは、造血前駆細胞株であり、それはあり得るがSCFを大量に増殖させた。 EML細胞の培養条件は通常の不死化細胞株よりも多くの注意が必要です。細胞...

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    開示事項

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    著者らは開示するものは何もない。

    謝辞

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    JQW、SZ、SD、KCは、国立衛生研究所とStaman Ogilvie Fund—Memorial Hermann Foundationからの助成金によってサポートされています。

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    材料

    この記事で使用された材料の一覧
    名前会社カタログ番号コメント
    Antibiotic-AntimycoticInvitrogen15240-062BHK cell culture
    Anti-Mouse CD34 FITCeBioscience11-0341-81FACS sorting
    Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) PEeBioscience12-5981-81FACS ソーティング
    APC マウス系統抗体カクテルBD Biosciences558074FACS ソーティング
    BD FACSAria Cell SorterBD Biosciences特別オファーsysmtemFACSの選別
    コーニング™細胞培養処理フラスコ 75 cm2Corning incorporated430641Cell culture
    Corning™細胞培養処理フラスコ 25 cm2Corning incorporated430639細胞培養
    デオキシリボヌクレアーゼ I, Amplification GradeInvitrogen18068-015ライブラリー調製
    DMEMInvitrogen11965-092BHK 細胞培養
    DPBSGibco14190細胞培養
    HI FBSInvitrogen16140071BHK細胞培養
    馬 血清Invitrogen16050-122EML 細胞培養
    IMDMHyCloneSH30228.02EML 細胞培養
    L-グルタミンInvitrogen25030-081細胞培養
    系統 細胞枯渇キット、マウスMiltenyi Biotec130-090-858系統陰性細胞の単離
    NanoVue Plus 分光光度計GE Healthcare28-9569-62品質管理
    Thermo Scientific™ナプコ&トレード;8000 Water-Jacketed CO2 インキュベーターThermo Scientific15-497-002細胞培養
    ペニシリン-ストレプトマイシンInvitrogen15140-122EML 細胞培養
    TRIzol®試薬Invitrogen15596-018RNA exraction
    TruSeq™RNAサンプル調製キットv2 -セットB (48 rxn)IlluminaRS-122-2002ライブラリ調製
    2100 電気泳動 バイオアナライザー 機器AgilentG2939AA品質管理
    0.25% トリプシン-EDTAGibco25200細胞培養
    0.45 µm シリンジフィルターNalgene190-2545細胞培養

    参考文献

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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