方法論記事

実験的子宮頸脊髄損傷における神経前駆細胞と自己組織化ペプチドの相乗使用

DOI：

10.3791/52105

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2015年2月23日

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1Department of Genetics and Development, Toronto Western Research Institute and Spinal Program, University Health Network, Krembil Neuroscience Centre, 2Department of Surgery, University of Toronto, 3Institute of Medical Sciences, University of Toronto

この記事について

サマリー

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自己組織化ペプチド（SAP）と神経前駆細胞）））の両方を用いて頚椎損傷を治療することは、再生と回復を促進するための有望なアプローチです。頸部SCIの挫傷/圧迫動脈瘤クリップラットモデルとSAP注射とNPC移植の併用治療が確立されています。

要約

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脊髄損傷（SCI）は、患者とその家族のために深刻な神経学的障害や、心理的、経済的、社会的影響を引き起こす。臨床的には、SCIの50％以上が頸椎1に影響を与える。主な傷害の結果として、炎症、アポトーシス、および脱髄を含む二次メカニズムのカスケードは、最終的に髄内空洞2,3の組織瘢痕化と発展につながる発生する。どちらも、細胞移植、統合、および再生の物理的および化学的障壁を表す。そのため、抑制性の環境を成形し、細胞移植と再生のための支援環境を作成するための空洞を埋めることは有望な治療ターゲット4である。ここで、動脈瘤クリップを用いて、子宮頸部SCIの挫傷/圧縮モデルが記載されている。完全な離断または脊髄の破裂は稀であるため、このモデルは、より臨床的に関連する他の実験モデルよりも長い。またcomparisoで重量ドロップモデルにN、特にダメージで背の列、脊髄の周圧縮が有利表示されます。クリップ閉鎖力および持続時間は、異なる損傷の重症度を達成するように調整することができる。リングばねは、クリップ力の正確なキャリブレーションと恒常性を容易にします。生理的条件下で、合成自己集合性ペプチド（SAP）ナノファイバーに自己集合し、したがって、SCI 5における適用のために魅力的。それらは脊髄に対する損傷を最小限に病変に直接注射することができる。 SAPは、髄内の空洞を埋めるため、再生治療のために、損傷した脊髄を装備する足場を建てる生体適合性構造体である。急性期後6 0.14日SCI後中性pHでK2（QL）6K2（QL6） ら Lドンによって導入された新規のSAPである。6他のペプチドと比較して、QL6自己集合βシートに、SAPの病変および神経前駆細胞（NPC）の中心に注入される麟蹄である隣接する背側の列にCTED。細胞の生存をサポートするために、移植は、7日間の浸透マイクロポンプによって成長因子の連続的な硬膜下投与と組み合わされる。

概要

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脊髄損傷の50％以上が頸椎に関連している。脊髄の初期挫傷を、その後、継続的な圧縮は、骨折、出血または組織の腫脹によって引き起こされる臨床設定つの主要な病態生理学的メカニズムに記載されている。

動脈瘤クリップ挫傷/圧縮モデルを模倣両方の病態生理学的メカニズム：クリップをスナップする挫傷を生成し、クリッピングの持続時間は、骨折、出血または組織によって引き起こされる臨床現場での圧縮は、最後の有意な長い腫脹こと失点、圧縮成分を表す。使用される動脈瘤クリップを正確かつ再現性のクリップ力を保証するリングばねによって変更される。特に、ヘミ離断または挫傷モデル、この動脈瘤クリップモデルを模倣最良の臨床設定と比較して。頸椎INJと胸部外傷の患者は麻痺に苦しむ一方で、ほとんどの患者uriesは四肢麻痺と完全に依存しています。頸髄の解剖学的構造は、しかしながら、胸椎または腰椎と比較して有意差を示し、従って、このプロトコルに特に対処される。

髄内空洞および組織瘢痕化の開発は回復と再生のための障害となっている。これらの障害の足場材料の使用を克服するための有望なアプローチである。自己組織化ペプチドは、病変の震源地に直接注入することができます。そこで彼らは、空洞を埋めるナノファイバー足場に集合し、炎症および組織瘢痕を減らすことによって抑制環境を改善する。剛性材料は、注入時の脊髄のかなりの損傷を引き起こす一方で、流体ペプチドが安全かつ深刻なダメージを与....

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プロトコル

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注：以下の実験プロトコルは、大学健康ネットワーク（トロント、カナダ）の動物管理委員会によって承認され、動物のケアのカナダ人評議会により調製し、実験動物の世話と使用するためのガイドに設立されたポリシーに従っているた。

1.子宮頸動脈瘤クリップ挫傷/圧縮モデル

  1. 手術オートクレーブ器の前および70％アルコール浴に器具を置くことによって全体surgcial手順中に無菌状態を維持する。
  2. （1：1）酸素との組合せ（O 2）、亜酸化窒素（N 2 O）とのWistarラット（250〜270グラム）を麻酔し、そして1.8から2.2パーセントイソフルランおよびガス麻酔マスクを介して自発呼吸をサポートする。麻酔の誘導のために1分間、5％イソフルランで開始し、その後減少させる。手術を開始する前に、痛みを伴う刺激を与えることにより、麻酔の深さを制御する（ 例えば 。足で）。脂肪軟膏を適用します目に乾燥を避けるために、後続の感染を防止することができる。
  3. 発熱クッション（37℃）にラットを入れて、定位フレームに頭部を固定する。
  4. 頸椎周りの手術部位を剃るとポビドンヨードおよび70％アルコールで消毒する。
  5. 胸椎椎体2（T2）の著名な突起に到達頸椎（C2）から脊柱上記正中切開を行います。
  6. 頭尾方向（出血を避けるために）直接正中線上の椎骨の筋....

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結果

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上記の手順を実行するときは、。SAP足場空洞を架橋および阻害環境の改善、より少ない組織瘢痕及びNPCの生存の増加を提供し得る。図4になることで得られたラットの脊髄の縦断面を示している損傷部位SCI後6週間とQL6 SAPの注入とNPC移植後4週間。 QL6ペプチドは成功裏に震源地で集約され、コード内に注入し、周辺部で吻側 - 尾側に拡散された。電子顕微鏡図5に、さらにショーをイメージング、1％のアセンブリ（w / v）のPBS溶液で希釈し、2時間以内に、ナノファイバー足場にQL6ペプチド。

このマトリックスは、増加した細胞生存および細胞分化に寄与抑制環境の改善を提供するより少ない組織瘢痕化、最終的に機能回復のためのより良い機会をもたらす。

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図1：クリップ挫傷/圧縮動脈瘤モデルラッ.......

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ディスカッション

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このプロトコルは、ラットにおいて、子宮頸部傷害モデルを実行するために読者を可能にし、子宮頸SCI後のより良い回復を促進するのSAPとのNPCとの併用治療アプローチを使用するために開発された。

挫傷と圧縮 - 、したがって、模倣最高の臨床症状 - 特にそのような（半）-transectionモデルまたは重量の低下と脳震盪モデルなどの他の頸椎外傷モデル、と比較して、クリップ挫傷/圧縮モデルは、主要な病態生理学的外傷メカニズムの両方を表す。それは十分にラットおよびマウス胸椎7-11で使用するために確立されているが、それは最近、頸椎における使用に適合されている。子宮頸部脊髄損傷は、最も頻繁に診療所で見ており、子宮頸部の解剖学的構造は、胸椎から大きく変化するので、これは重要なステップであった。さらに、四肢に苦しんで子宮頸SCI患者は、少なくとも部分的なモーターFを取り戻すことに熱心である彼らの上肢の慰め。

実験的な子宮頸SCIの困難な側面は、しかし、C5にC7から吻側方向に増加し、中間および上部の頸椎20〜30％ま.......

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開示事項

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Covidien は、この調査のために QL6 SAP を提供しました。

謝辞

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私たちは、ヘルスリサーチ（CIHR）のカナダの研究所からのこの仕事のための資金援助に感謝し、貢献のためKrembilファミリー財団、神経修復におけるハルバート議長と再生、フィリップとペギーDeZwirek、とゴードンヤオは図2を。クラウスZweckbergerは「ドイツForschungsgesellschaft」（DFG）からの助成金によって賄われていた。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
動脈瘤クリップシャープテック
手術用顕微鏡ライカ
マイクロ注射システムWorld Precision Instruments, Inc.
小動物定位固定装置デビッドKopfインスツルメンツ
ハミルトンシリンジハミルトン社
膜下ポンプfigure-materials-1 Alzet 浸透圧マイクロポンプ 1007D
手術器具ファインサイエンスツール
イソフルランUSPファーマシューティカルパートナーズオブカナダ株式会社
0.9%塩化ナトリウム注射 USPBaxter
7.5% Povidoneヨウ素Purdue Pharma
70% イソプロピルアルコール USPGreenField Ethanol Inc.
QL6 SAPCovidien
0.4% トリパンブルーGibco
血小板由来成長因子 (PDGF)シグマ
上皮成長因子 (EGF)シグマ
線維芽細胞成長因子 (FGF)シグマ
硬

参考文献

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  1. Sekhon, L. H., Fehlings, M. G. Epidemiology, demographics, and pathophysiology of acute spinal cord injury. Spine (Phila Pa 1976). 26, S2-S12 (2001).
  2. Fehlings, M. G., Tator, C. H., Linden, R. D.

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