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方法論記事

プロ蛍光基質アナログを経由してPAD4活性の蛍光ベースの監視

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DOI:

10.3791/52114

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2014年11月5日

 ,  , 
1Department of Chemistry, Lehigh University

この記事について

サマリー

PAD4は、ペプチジル-アルギニンのペプチジル-シトルリンへの変換に関与する酵素です。PAD4の調節不全は、多くのヒトの疾患に関与しています。容易でハイスループットに適合する蛍光ベースのPAD4アッセイについて説明します。

要約

翻訳後修飾は、多くのタンパク質基質の側鎖の共有結合的変動を増加させることにより、タンパク質の機能状態の変化につながる可能性があります。ヒストンテールは、すべてのヒトタンパク質の中で最も大きく修飾されたストレッチの1つを表しています。ペプチジル-アルギニンデイミナーゼ4(PAD4)は、アルギニン残基を非遺伝的にコードされたシトルリン残基に変換することが示されています。これまでに報告されたアッセイは、満足のいく感度で操作が容易でしたものはほとんどありません。したがって、適切なアッセイの欠如が、強力な非共有結合性PAD4阻害剤の不在に寄与している可能性があります。ここでは、PAD4活性のモニタリングを可能にする新規な蛍光ベースのアッセイについて説明します。プロ蛍光性基質アナログは、プロテアーゼトリプシンの添加によりPAD4酵素活性を蛍光遊離に結びつけるように設計されました。このアッセイは、ハイスループットスクリーニング条件に適合し、強力なS/N比を持つことが示されました。さらに、このアッセイは、過剰発現したPAD4を含む粗細胞ライセートを用いても実施できます。

概要

哺乳類のタンパク質の大多数は重くリボソームによるタンパク質の合成以下の酵素の作用によって修飾される。これらの翻訳後修飾（PTMは）大幅にタンパク質1-3（他の機能の中で）、サイズ、電荷、構造、オリゴマー化状態を変化させることにより、プロテオームの機能的多様性を増加させることができる。その結果、タンパク質構造の変化は、タンパク質分解、細胞分化、シグナル伝達、遺伝子発現の調節、およびタンパク質 - タンパク質相互作用のような生理学的結果をもたらすことができる。これらの変更は、すべてのヒトタンパク質の大きな割合で普及している一方で、端末はヒストンタンパク質に終了共有結合修飾4の異常に高い数値を受ける。ヒストンタンパク質は、ゲノムDNAの凝縮を容易にする構造タンパク質のファミリーである。非構造化ヒストン尾部の共有結合修飾は、セリエAによって行われ、規制されている、残基（作家）の共有結合的修飾を触媒する同じ変更（消しゴム）を逆転し、変更を区別できる酵素のsはヒストン尾（読者）5-7上に刻印されている。実際には、既知のPTMのほとんどは、メチル化、リン酸化、アセチル化、SUMO化、ユビキチン化、およびシトルリン8を含むヒストンのこの短いセグメント内に観察することができる。

シトルリンは、ペプチジル-シトルリン（ 図1A）符号化された非トン RNAへのプチアルギニンの変換を含む。この側鎖の中和を担うタンパク質は、カルシウム依存性酵素であるその全てがPAD た（p eptide A rginine dの eiminase）タンパク質ファミリーのメンバーである。9,10。現在までに、PADのファミリーの5メンバーは（PAD1、PAD2、PAD3、PAD4、およびPAD6）に記載されている。このファミリーの各メンバーは、個別の細胞タンパク質を標的とするように表示され、またUNIを表示queの組織分布プロファイル。 PAD4は、核局在化配列11を介して核内に局在することが知られているこのタンパク質ファミリーの唯一のメンバーである。したがって、H3（H3R2、H3R17、およびH3R26）及びH4（H4R3）、ヒストンH2Aのアルギニン残基3（H2R3）のN末端 ​​尾部におけるアルギニンの側鎖を含む核標的の数を、deiminateすることが示されている12、 13。 PADアイソザイムのそれぞれが具体的かつ重要な生理学的機能を有するが、PAD4は、罹患および正常細胞の両方におけるヒトのプロセス数におけるその役割にかなり注目されている。最近では、PAD4は、多能性の転写ネットワーク14のメンバであることが示された。両方PAD4の発現レベルおよび活性は、マウスにおける再プログラミングと基底状態の多能性状態の間に上昇することが示された。幹細胞の遺伝子の調節を制御することにより、PAD4は細胞リプログラミング効率の極めて重要な役割を保持することができる。 PAD4も関与している病原体の結合時に、そのシステムのクリアランスを有効に好中球細胞外トラップの形成。 PAD4によるヒストンタンパク質のhypercitrullinationは、このような細菌感染15,16を退ける、細胞外トラップによる病原性細菌のカプセル化のための基材として機能するクロマチンの脱凝縮を誘導する。

さらに、PAD4は、多くのヒト疾患において積極的な役割を果たすことが見出されている。これは、以前にPAD4の異常な発現は、関節リウマチの発症および重症度と関連していることが示されており、アルツハイマー病、パーキンソン病、および多発性硬化症17。実際、抗シトルリン化タンパク質抗体の存在が関節リウマチ18の最も信頼性の決定的な診断および予後バイオマーカーの1つである。同様に、調節不全PAD4活性は最近、卵巣、乳房、肺、などの多くのヒト癌において観察されているD食道癌19-22。 PAD4と癌との関連は、p53腫瘍抑制タンパク質22,23 ELK1癌遺伝子を介して、またはを介して媒介されることが示されており、以前の研究は、PAD4は、新規な抗癌治療のターゲット17,24,25かもしれないことを示唆している。原理研究の証明として、結腸直腸癌細胞株HCT116におけるshRNAを介したPAD4の枯渇は、アポトーシスおよび細胞周期停止26を誘導するために十分であることが判明した。最近開発された不可逆的なPAD4阻害剤は、マウス27の腫瘍塊における七十%削減につながった。かなり著しく、PAD4阻害は非形質転換細胞を温存しながら、癌細胞の選択的殺傷をもたらした標的療法として機能するように見えた。

PAD4の機能をオフにする小分子の使用は、癌細胞を標的とするか、または既存の癌化学療法剤28を補強するための強力な新しい戦略になるかもしれない。残念ながら、PO10トン可逆PAD4阻害剤は、まだ発見されなければならない。共有結合性阻害剤の数は、アルギニン基板27,29,30を模倣し、健康および疾患状態の細胞の両方においてPAD4の役割を理解する上で実用的なツールであることが証明されているクロロ/フルオロイミジンハンドルを使用して開発されている。しかし、これらの分子は、同様の効力を有する活性のPADのすべてを阻害する。したがって、PAD4の活動について報告し、容易なアッセイの必要性は非常に重要です。今日まで、PAD4アッセイは、比色読み出し31に対する反応からのアンモニアの放出をリンクすることが記載されており、蛍光偏光アッセイ32用の蛍光標識chloroamidine基質類似体を利用し、グリオキサール及びシトルリン33との間の酸アシスト反応に依存して、及び夫婦ステップ34を脱消光蛍光にPAD4活動。これらのうち、唯一の共有結合の修飾haloacetamidine戦略は、ハイスループットSCREと互換性があることが証明されている締付プラットフォーム32,35,36。私たちは確実にPAD4の活性を測定する簡便な蛍光ベースのアッセイを記述する。強力な信号対雑音比、分析速度、および測定のロバスト性を表示するアッセイは、真の強力かつ選択的なPAD4阻害剤を発見する可能性がある。

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プロトコル

1. PAD4変換、発現、および精製

  1. PAD4の形質転換のために、化学的にコンピテントにPAD4のGST融合を含むのpGEXプラスミドを変換する以下の手順を使用して、タンパク質発現のための大腸菌 （BL21（DE3））細胞。化学的にコンピ（塩化カルシウム）を準備E.大腸菌 （BL21（DE3））細胞を標準的なプロトコルに従って。
    1. 氷上で予め調製した化学的にコンピテントなBL21（DE3）細胞を、50μlの融解し、5mlの培養チューブにPAD4遺伝子を含有するpGEXプラスミド1μlを混合する。優しく2分ごとに振とうしながら10分間氷上で混合をインキュベートする。
    2. 熱は、40秒間42℃の水浴中で混合物を配置することによって細胞にショックを与える。すぐに細胞が回復できるように2分間背中氷上で細胞プラスミド混合物を配置します。混合物に滅菌LBブロス1ミリリットルを加え、1分間氷上に置きます。
    3. 1のために250rpmで振盪、37℃で細胞を熱ショックをインキュベートhrで。アンピシリン耐性寒天プレート上に形質転換された細胞のピペット75μlの、15時間、37℃でインキュベートする。 4℃で保存プレート。
  2. PAD4式。
    1. 1xのアンピシリンを含むLB 5mlにアンピシリン寒​​天プレートと場所からのBL21（DE3）細胞の1コロニーを採取。インキュベーター内の場所、そして37℃でO / Nを振る。
    2. 1Xアンピシリン三水和物を含む滅菌LB（MW 403.45グラム/モル）1L中にLB（スターター）の5ミリリットルを転送します。 37℃の振盪インキュベーター内の場所の成長。成長のOD 600を監視します。成長は600 0.3のODに達したときに、インキュベーターを振って16℃に成長を移動します。
    3. OD 600が 0.6 に達したら、0.3mMので細胞を誘導する（IPTG、MW 238.30グラム/モル）isopropylthiagalactoside。細胞は16℃で15時間振とうすることができます。
    4. 0℃で20分間、4,000×gでの遠心分離により細胞を回収する。 -80℃で上清とストアペレットを捨てる。
  3. PAD4精製
    1. 再懸 ​​濁50mMのNaCl（MW 58.44グラム/モル）の緩衝液中で細胞をBL21（DE3）で発現さPAD4を含むペレットを300mMののNaH 2 PO 4（MW 119.98グラム/モル）、10mMのイミダゾール（MW 68.077グラム/モル）、0.1mMのフェニルメチルスルホニルフルオライド（PMSF、MW 174.94グラム/モル）及び1mMジチオスレイトール（DTT、154.25グラム/モル）でpH = 8.0。
    2. 4℃で15分間、超音波処理を介した溶解細胞。以下、超音波処理、0℃で20分間遠心2万×gで細胞溶解物。捨て、上清を保存します。バッチをRTで30分間グルタチオン（GSH）アガロースビーズと上清。
    3. GSTビーズ/重力介してカラムから上澄みを排出します。 RTで1×PBS（リン酸緩衝生理食塩水、pH値= 8.0）の4×25 mlのビーズを洗ってください。
    4. 溶出PAD4 10mLで2回溶出緩衝液を用いて、50mMのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス塩基、MW 121.14グラム/モル）、10mMグルタチオン（GSH、MW 307.32グラム/モル）でpH = 8.0。
    5. 100kのMWカット-Oを使用してPAD4を集中ffの遠心管遠心分離を4℃で20分間4,000×gで。 -80℃でアリコート1.0 mlのマイクロチューブ中の200μlのボリュームへのタンパク質や店舗。

バッファ2.準備株価ソリューション

  1. 塩化ナトリウム（NaCl、MW 58.44グラム/モル）を秤量し、2 M溶液を調製する。透明になるまで溶液を混合。
  2. トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス塩基、MW 121.14グラム/モル）秤量し、2M溶液のpH = 8.0を準備します。透明になるまで溶液を混合。
  3. 塩化カルシウム二水和物（のCaCl 2·2H 2 O、MW 147.01グラム/モル）を秤量し、500mMの溶液を調製する。透明になるまで溶液を混合。
  4. トリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP、MW 250.19グラム/モル）を秤量し、200mMの溶液を調製する。 -20℃で、明確かつ店舗まで溶液を混ぜる。
  5. ジチオスレイトール（DTT、MW 154.25グラム/モル）秤量し、1M溶液を調製。 -20℃で、明確かつ店舗まで溶液を混ぜる。
  6. 準備するトリトンX-100の0.5％溶液。
  7. エチレンジアミン四酢酸（EDTA、MW 292.24グラム/モル）を秤量し、100mMの溶液を調製する。透明になるまで溶液を混合。
  8. Z- Arg- Arg- 7-アミド - 、4-メチルクマリン塩酸塩（ZRcoum、MW 621.69グラム/モル）を秤量し、ジメチルスルホキシド（DMSO）中の10mM溶液を調製する。

37℃で3 PAD4アッセイ

  1. 10 mMのZRcoumストックから、水にZRcoumの125μMの溶液を調製。この125μMZRcoum溶液は溶液Aになります
  2. 62.5のNaCl、62.5 mMトリス、12.5のCaCl 2、6.25 mMのDTT、および5μMのPAD4液（pH = 8.0）のバッファを準備します。これは溶液Bになります
  3. 62.5のNaCl、62.5 mMトリス、12.5のCaCl 2、および6.25 mMのDTT（pH値= 8.0）のバッファを準備します。これは溶液Cになります
  4. （ウシ膵臓から）トリプシン、結晶を秤量し、100 mMのEDTA中に10mg / mlを準備します。透明になるまで溶液を混合し、-20℃で保存する℃である。これにより、ソリューションD.なります
  5. 96ウェルプレートを入手して、コントロールのウェル数（無PAD4）を指定し、試験ウェル（+ PAD4）。
  6. ピペット160試験ウェルへの溶液Bμlのピペット溶液C160μlの対照ウェルへ。 37℃で15分間インキュベートする。
  7. ピペット40のすべてのウェルにA液μlの45分間37℃でインキュベートする。
  8. 試験ウェルの対照ウェルと半分の半分にのdH 2 Oのピペットを10μl。対照ウェルと試験制御、ピペット37℃で10分間インキュベートするソリューションD.10μlの他の半分。
  9. 345 nmの励起波長および465 nmの発光波長を有するマルチモーダルリーダーで読み取った蛍光を得る。

RTで4 PAD4アッセイ

  1. 10 mMのZRcoumストックから、水にZRcoum50μMの溶液を調製。この50μMのZRcoumソリューション、ソリューション、Aになります
  2. 100 mMのNaをバッファを準備Clを、100mMのトリス、20mMのCaCl 2を 、2mMのTCEP、0.02％トリトンX-100、および8μMPAD4液（pH = 8.0）。これは溶液Bになります
  3. 100mMのNaCl、100 mMトリス、20のCaCl 2、2mMのTCEP、0.02％トリトンX-100液（pH = 8.0）のバッファを準備します。これは溶液Cになります
  4. （ウシ膵臓から）トリプシン、結晶を秤量し、100 mMのEDTA中に10mg / mlを準備します。 -20℃で、明確かつ店舗まで溶液を混ぜる。これにより、ソリューションD.なります
  5. 384ウェルプレートを取得せず、コントロールのウエルを指定する（無PAD4）と試験ウェル（+ PAD4）。
  6. ピペット試験ウェルとピペット対照ウェルへの溶液Cを25μlにB液25μlの。 PAD4なし/付きバッファは室温で20分間ウェル中でインキュベートすることができます。
  7. すべてのウェルに溶液Cのピペットを25μlとRTで45分間インキュベートする。
  8. 試験ウェルの対照ウェルと半分の半分にのdH 2 Oのピペットを10μl。対照ウェルと試験のコントロールの他の半分に、pipett室温で10分間ソリューションD.インキュベートの電子10μlの。
  9. 345 nmの励起波長および465 nmの発光波長を有するマルチモーダルリーダーで読み取った蛍光を得る。

37℃およびRTで5 PAD4タイムコースアッセイ

  1. 10 mMのZRcoumストックから、水にZRcoumの125μMの溶液を調製。この125μMZRcoum溶液は溶液Aになります
  2. 62.5のNaCl、62.5 mMトリス、12.5のCaCl 2、6.25 mMのDTT、および5μMのPAD4液（pH = 8.0）のバッファを準備します。これは溶液Bになります
  3. （ウシ膵臓から）トリプシン、結晶を秤量し、100 mMのEDTA中に10mg / mlを準備します。 -20℃で、明確かつ店舗まで溶液を混ぜる。これは溶液Cになります
  4. （どのように多くの時間点に依存することになるのウェル＃）2 96ウェルプレートおよびピペットのウェル＃量にB液160μlのを取得します。
  5. 37℃で1枚の96ウェルプレートをインキュベートする。 RTで、他の96ウェルプレートをインキュベートする。
  6. ピップ両方の96ウェルプレート内のすべてのウェルにエットA液40μlのを、すぐにT = 0分ウェルに溶液Cを10μlピペット。すべてのウェルが急冷されるまで、特定の時点で溶液C10μlの追加を続けます。
  7. 345 nmの励起波長および465 nmの発光波長を有するマルチモーダルリーダーで読み取った蛍光を得る。

RTで6 PAD4阻害アッセイ

  1. 10 mMのZRcoumストックから、水にZRcoumの83μM溶液を調製。この83100μMのZRcoum溶液は溶液Aになります
  2. のCl - アミジンを秤量（MW 424.8グラム/モル）および100μMストック溶液を準備します。これは溶液Bになります
  3. 100mMのNaCl、100 mMトリス、20のCaCl 2、2mMのTCEP、0.02％トリトンX-100、および8μMPAD4液（pH = 8.0）のバッファを準備します。これは溶液Cになります
  4. 100mMのNaCl、100 mMトリス、20のCaCl 2、2mMのTCEP、0.02％トリトンX-100液（pH = 8.0）のバッファを準備します。目ソリューションD.なりますです
  5. （ウシ膵臓から）トリプシン、結晶を秤量し、100 mMのEDTA中に10mg / mlを準備します。 -20℃で、明確かつ店舗まで溶液を混ぜる。これにより、ソリューション、Eになります
  6. 384ウェルプレートを入手して、コントロールのウェル（なしPAD4）、試験ウェル（+ PAD4）、および阻害ウェル（PAD4 +のCl - アミジン）を指定。
  7. ピペット25試験ウェルへの溶液Cμlのピペット対照ウェルへの溶液D25μlの。 PAD4なし/付きバッファは室温で20分間ウェル中でインキュベートすることができます。
  8. ピペット10阻害ウェルに溶液BμlのRTEで20分間インキュベートする。
  9. すべてのウェルへの溶液Aのピペットを15μlとRTで45分間インキュベートする。
  10. ピペットすべてのウェルへの溶液Eを10μl。室温で10分間インキュベートする。
  11. 345 nmの励起波長および465 nmの発光波長を有するマルチモーダルリーダーで読み取った蛍光を得る。

7.粗細胞溶解物アッセイRTで

  1. 50mMトリス、50mMのNaCl、0.1mMのフェニルメチルスルホニルフルオライド（PMSF、MW 174.94グラム/モル）及び1mMジチオスレイトール（DTT、154.25グラム/モル）、pHを、10mlのPAD4 1 Lの成長から再懸濁細胞を細胞を回収した後= 8.0。
  2. 4℃で15分間、超音波処理を介した溶解細胞。遠心0℃で20分間、20,000×gで細胞溶解物。 100kのMWカットオフ遠心チューブを用いて4℃で4,000rpmでの遠心分離により半分の容量に透明な上清を濃縮する。
  3. 10 mMのZRcoumストックから、水にZRcoumの250μMの溶液を調製。この250μMのZRcoum溶液は溶液Aになります
  4. 100mMのNaCl、100 mMトリス、20のCaCl 2、および2mM TCEP（pH値= 8.0）のバッファを準備します。これは溶液Bになります
  5. （ウシ膵臓から）トリプシン、結晶を秤量し、100 mMのEDTA中に10mg / mlを準備します。 -20℃で、明確かつ店舗まで溶液を混ぜる。これは溶液Cになります
  6. 黒色の384ウェルプレートデザインを得るコントロールのウェル（無細胞溶解物）と試験ウェル（+細胞溶解物）を食べた。
  7. ピペット試験ウェルへのすべてのウェルおよび細胞溶解物の60μlのピペットにB液を100μl。 RTで20分間インキュベートする。
  8. すべてのウェルへの溶液Aのピペットを40μlとRTで45分間インキュベートする。
  9. ピペットをすべてのウェルに溶液Cを10μl。室温で10分間インキュベートする。
  10. 345 nmの励起波長および465nmの発光波長でマルチモーダルリーダーで読み取った蛍光を得る。

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結果

最初に、それはZRcoum 96ウェルプレートフォーマットでPAD4の活性に報告することができることが実証された。ウェルを基板ZRcoumとし、PAD4の存在/非存在下でインキュベートした。 475/15 nmのフィルタ（ 図2A）、 - 37℃で45分間のインキュベーション時間の後、蛍光を340/40で測定した。予想されたように、蛍光レベルはZRcoum（またはシトルリンZRcoum）内の蛍光団として低いままロック状態のままであった。溶液に、過剰のトリプシン/ EDTAを添加すると、フルオロフォアはZRcoumから解放されたが、PAD4の存在下でほとんど変わらなかった。 EDTAの添加により本質的なカルシウムイオンをキレート化する能力にPAD4反応の停止を助けることを意図している。これらのデータから、蛍光出力の5.2倍の減少は、PAD4の存在下で観察された。次に、コンプハイスループットスクリーニングプラットフォームと新しく開発されたア...

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ディスカッション

本明細書では、PAD4の活性をモニターする蛍光ベースのアッセイの開発に成功しました。このアッセイは、多くのハイスループット条件で信じられないほど堅牢であることが証明されており、全細胞ライセート37とも互換性があります。

ヒストンタンパク質とそれを取り巻くDNA鎖との間の親和性は、シトルリン化時のアルギニン側鎖上の正電荷の中和により緩みます。アルギニン側鎖の中和を同様に活用して PAD4 活性を監視できることが想定されました。PAD4 によるアルギニンのシトルリンへの変換は、トリプシンを介した加水分解に対する感受性を大幅に低下させることが期待されます。トリプシンは、リジンとアルギニンの両方のC末端アミド結合の加水分解に明確な好みがあり、7.5〜8.5のpH範囲付近で最適な活性を示します。したがって、すべてのトリプシン溶液を pH 7.5 で調製し、すべてのアッセイを pH 8.0 で実施しました。さらに、蛍光色素7-アミド-4-メチルクマリンのアルギニンC末端へのアセチル化は、その蛍光をオフ状態で「ロック」するのに役立ちます(図1C

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この作業は、リーハイ大学スタートアップパッケージによって支援されました。タンパク質発現用のGST-PAD4プラスミドを提供してくださったWalter Fast博士に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
LBブロス、ミラー(LURIA-BERTANI)アムレスコJ106-2KGhttp://www.amresco-inc.com
アンピシリン三水和物(オフホワイトパウダー)、フィッシャーバイオ試薬フィッシャーサイエンティフィックBP902-25 http://www.fishersci.com
イソプロピルチアガラクトンス (IPTG)Life Technogolies15529-019http://www.lifetechnologies.com
All Buffer Salts フィッシャーサイエンティフィ、フィッシャーScieintifcから購入することができます。VWRの;アクロス;シグマ・アルドリッチ;等。
プロティーノグルタチオン(GSH)アガロース Machery-Nagel745500.104 °C;http://www.mn-net.com/
クロロアミジン ケイマン・ケミカル 10599-20 >C;https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm
Triton X-100Sigma AldrichX100-100MLwww.sigmaaldrich.com
>Corning/Nunclon MicroWell プレート (96 および 384)コーニングから購入。Sigma-Aldrich
Tecan Infinite 200 / Tecan i-control マイクロプレートリーダーソフトウェアwww.tecan.com
Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filterhttp://www.perkinelmer.com
ックは

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