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方法論記事

T細胞の導出体外マウス胚性幹細胞からの

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⸱

DOI:

10.3791/52119

⸱

2014年10月14日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Hunter College and Graduate Center, City University of New York, 2Sunnybrook Research Institute, Department of Immunology, University of Toronto

この記事について

サマリー

マウス胚性幹細胞は、OP9-DL1共培養システムを使用してin vitroでT細胞に分化させることができます。この手順を成功させるには、試薬/細胞のメンテナンス、および主要な技術に敏感なステップに細心の注意を払う必要があります。ここでは、これらの重要なパラメータについて説明し、このテクノロジーの採用を促進するための詳細なプロトコルを提供します。

要約

OP9/OP9-DL1共培養システムは、マウスとヒトに由来する胚および造血の祖先から分化した血液細胞型を導き出すための確立された方法となっています。現在、造血に関連する複雑な遺伝的、細胞的、分子的な問題など、ますます多様化する問題に対処するために使用されており、これらの基本的な知見を治療応用につなげる取り組みの最先端にいます。手順は簡単で、定期的に堅牢な結果が得られます。しかし、in vitroで造血分化を成功させるには、試薬と細胞培養の維持に特別な注意を払う必要があります。さらに、このプロトコルは、難しくはありませんが、習得するために注意を払い、練習するテクニックに敏感なステップを特徴としています。ここでは、マウス胚性幹細胞(mESC)からTリンパ球を分化するための手順に焦点を当てます。私たちは、in vitroで再現性のある頑健な細胞分化を可能にする重要なステップとパラメーターについての議論を含む詳細なプロトコルを提供します。この技術は、動物の使用を減らし、コストを削減し、基礎実験とトランスレーショナル実験の両方のタイムラインを短縮する可能性があるため、この技術の幅広い採用を検討することは、この分野の利益になります。

概要

マウス胚性幹細胞(mESC)をin vitroでT細胞に分化させる細胞培養システムが確立されました。1 このシステムは、Notchシグナル伝達の能力を利用してT細胞の分化を促進します。2 OP9-DL1細胞株は、骨髄由来のOP9細胞3にNotchリガンドであるDelta-like 1(DL1)を形質導入することによって作製されました。4 in vitroでNotchシグナル伝達カスケードが活性化されると、T細胞の発達が促進され、他の細胞系譜が排除されます。適切なサイトカインを含めることで、このシステムは、mESCが造血、ひいてはT細胞系譜への逐次的な進行をサポートする細胞培養の「微小環境」を提供します。このシステムは、胸腺の正常なT細胞個体発生中に見られるさまざまな発生段階におけるT細胞のフローサイトメトリー同定をサポートします。T細胞の発生に関連する選択された問題を調査するために、この手順は、マウス胚性幹細胞由来の造血前駆体からT細胞の発達を誘発するために使用されるin vivo全マウスモデル5およびin vitro胎児胸腺臓器培養法の魅力的な代替手段となっています。6 OP9共培養システムの主な利点は、標準的で直接的な細胞培養技術を使用し、実験動物の継続的な使用に依存しないことです。

このアプローチを使用した実験では、以前に公開された詳細なプロトコルに従います。7 この技術を用いて、非操作mESCクローン、キメラ胚8作製のために厳選した高品質mESCクローン8、薬剤選択から直接得られる安定トランスフェクションESCクローンの造血分化産物を調べました。9 このモデルにおけるmESCから中胚葉様コロニーへの最初のin vitro分化の時間的動態は、個々のクローン間で変動する可能性があることに注目しました。mESC-OP9共培養は、中胚葉への進行について視覚的に評価できます。これは通常、共培養の5日目までに完了しますが、個々のクローンでは、完了が1日または2日遅れることがあります。定量的(~80-90%)中胚葉形成は、最適な造血前駆細胞(HPC)形成と堅牢なリンパフォポイシスを得るためには、移植前に達成する必要があります。したがって、複数のmESCクローンを扱う場合、この「5日目」の経過は、すべてのクローンが中胚葉様コロニーへの移行を完了するまで遅らせるのが最善です。これにより、造血分化条件に移行した後のクローン間のその後の発達の同期が可能になります。80-90%の中胚葉形成の通過から3日後、HPCはOP9単層から収集されます。HPCを新しいOP9細胞に播種して、単球細胞、赤血球、およびB細胞系統の分化を可能にすることができます。あるいは、HPCをOP9-DL1細胞に播種し、T細胞の発達に向けて駆動することもできます。すべてのin vitro分化培養物は、5日目からFlt-3Lを提供し、さらにIL-7を8日目から追加します。実験中のさまざまな時点で実施されるフローサイトメトリー解析により、造血分化とT細胞発生の段階と系統の進行をモニタリングできます。CD4/CD8二重陽性(DP)T細胞は、共培養の16日目までに出現し始め、DP細胞とCD8シングルポジティブ(SP)細胞の両方が20日目までに豊富に存在します。共培養の一般的な結果と堅牢性は、発生する重要な発達のターニングポイントの完了を視覚的に確認する能力に大きく依存します。このプロトコルは、これらのマイルストーンと、差別化を成功させるための鍵となるその他の重要なパラメーターを認識するためのガイドとなることを目的としています。

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プロトコル

培養培地、サイトカインおよび糊化プレートの作製

  1. 高グルコースおよびピルビン酸ナトリウムをイーグル培地（DMEM）のダルベッコ改変を使用することにより、ES細胞培地を準備します。 ESC認定ウシ胎児血清（FBS）、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、1％L-グルタミン、1％HEPES緩衝液、1％非必須アミノ酸、0.1％ゲンタマイシン（50 mg / ml）を、0.1％の（20％の追加55μM）、β-メルカプトエタノール。濾過によってES細胞培地を滅菌する。
  2. メーカーの指示に従って粉末からアルファ最小必須培地（α-MEM）を1LにすることによってOP9メディアを準備します。 20％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを追加する。混合する反転。 2 500ミリリットルのアリコートに濾過することにより滅菌する。
    注：粉から作られたメディアの使用が推奨され、改善されたOP9細胞の維持およびインビトロ分化結果にをもたらす可能性が高い。このアプローチは、私たちの標準的な手順となっている。しかし、私たちは股関節の点に注意してくださいT私たちは常に、十分な成功を収めて事前に作成された液体のα-MEMを用いてきた。
  3. 90％FBSを10％ジメチルスルホキシド（DMSO）を添加することにより凍結培地の準備。優しく旋回し、濾過により滅菌する。 4℃で保存。
  4. を10μg/ mlに完全なOP9培地中でヒト組換え体Flt-3リガンド（FLT-3L）を溶解することにより2,000x FLT-3リガンド（10μg/ mlの）を準備します。 -80℃で1.5 mlマイクロチューブに分注して保存。安定性、保存に関する供給業者の推奨事項に従ってください。
    NOTE：のFlt-3Lの安定性（4℃または3ヶ月間-80℃で1ヶ月間）に短い。
  5. 完全なOP9メディアを使用して1,000倍のIL-7（1μg/ mlの）を準備します。 -80℃で1.5 mlマイクロチューブに分注して保存。安定性、保存上の供給元の推奨に従ってください（IL-7は、-80℃で12ヶ月まで安定である）。
  6. LIF iの10 7単位の1:10希釈により1,000倍白血病抑制因子（LIF）（10μg/ mlの）を準備nはES細胞培地。 4℃で保存一定分量。分量バイアルにメーカーが提供する有効期限に注意して。
    注：製品は、製造日からの濃縮または希釈された形は少なくとも18ヶ月で安定している。
  7. 6ウェルプレートの各ウェルに0.1％ゼラチン溶液1.5mlを加えることにより糊化6ウェルプレートを準備する。コー​​ティングのために少なくとも30分を可能にする上で蓋を室温で無菌フード内で料理をしておきます。皿はまた、加湿インキュベーター中で一晩放置してもよい。右の細胞播種の前に残っゼラチン溶液を除去します。ゼラチン溶液を完全にウェル内に乾燥させてはいけない。

フィーダー細胞とマウスの胚性幹細胞の調製とメンテナンス（MESC）

注：5％CO 2の加湿した37℃のインキュベーター内のすべてのセルをインキュベートする。

  1. 解凍マウス胚線維芽細胞（MEF）
    1. 凍結バイアル（〜5×10 6をクイック解凍細胞/バイアル）および15 mlチューブに移す。
    2. 次第に凍結媒体からのDMSOを希釈して滴下方式で、解凍された細胞へのES細胞培地を8mlを追加します。
    3. 5分間、4℃で400×gで遠心分離した細胞。上清を慎重に除去し、ES細胞培地3mlに細胞ペレットを再懸濁する。
    4. 予め温めたES細胞培地の33ミリリットルと50ミリリットルの遠心管を準備します。 36ミリリットル最終容量をもたらすために、再懸濁したMEFの3ミリリットルを追加します。
    5. 2糊化6ウェルプレートの各ウェルに再懸濁させたMEFの3ミリリットルを配布します。細胞が付着し、その上にたmESCを播種する前に広がることができるように、少なくとも6時間インキュベーターにプレートを置きます。彼らのメディアは2〜3日ごとに変更された場合は、これらの有糸分裂逮捕フィーダー層は、最初の播種後数日間使用可能であってもよい。
      NOTE：新鮮逮捕MEFを使用することもできる。
    6. 播種たmESC
      1. 37℃の水浴中の凍結MESCクローンでバイアルをクイック解凍し、2.1.1-2.1.3に記載されているように細胞を調製する。
        注：私たちは、6ウェルプレートのコンフルエント井戸からMESCの2バイアルを凍結する。
      2. 逮捕MEF単層（ステップ2.1.5で調製）で6ウェルプレートの（MESCクローンあたり）つのウェルから培地を除去し、MEF単層の上にたmESCの3ミリリットルをシード。 1,000倍LIF（10 ng / mL）を、3を添加する。インキュベーターに皿を返します。
    7. ES細胞の維持およびトリプシン仲介通過
      注：MESCの合流点に基づいて、日単位のメディアを変更し、または分割。最適には、収穫および分割/再プレート細胞隔日。
      1. ES細胞培地を除去し、PBS 2mlでたmESCを洗う。 PBSを除去します。 0.25％トリプシンを1mlを加え、3〜5分間37℃でインキュベートする。
      2. トリプシン処理した細胞を収集し、15ミリリットルの遠心管に転送します。激しくメートルの塊を破壊するために、細胞懸濁液をピペットESCは。トリプシンを中和し、細胞懸濁液に完全なES細胞培地2 mlを加える。
      3. 4°Cで5分間400×gで細胞をスピン。上清を除去し、3ミリリットルのES細胞培地でペレットを再懸濁します。
      4. 準備逮捕MEF単層を含む6ウェルプレートから培地を除去。播種するために、各ウェルにES細胞培地3ml中の（所望の分割比に基づいて）細胞懸濁液の適当な量を加える。 1,000倍LIFの3を添加する。うまく分割コンフルエントMESC 1：図6は、2日間で通過させるための準備が整います。
    8. OP9 / OP9-DL1細胞の維持
      1. OP9細胞のバイアルを解凍（手順に従って2.1.1-2.1.3 OP9メディアを使用）
      2. 10cmの組織培養皿に7ミリリットルのOP9メディアを追加します。プレート全体に細胞を分配、一滴ずつの方法で再懸濁した細胞の3ミリリットルを追加します。インキュベーター内で一晩細胞を配置します。
      3. 翌日OP9細胞の合流点を確認してください。料理は多くの死んだ浮遊細胞が含まれている場合は、レモメディアVEの、新鮮なOP9メディアの10ミリリットルを追加します。ほぼ完全な合流点が観察されていない場合、インキュベーターに皿を返します。 4近くコンフルエントOP9単層：スプリット1（トリプシンを用いて）。
        注：プレートを約2日後にもう一度同じ合流レベルに達する必要があります。 OP9細胞が過コンフルエントになるさせないように注意してください。
      4. 拡張ストックとしてOP9細胞の初期の継代をフリーズします。
        注：私たちはコンフルエント10cmディッシュに近いものからOP9細胞の2のバイアルを凍結する。拡張ストックの各バイアルは、さらに後述MESC共培養実験で使用されるワーキングストックを作成するために増殖させることができる。変動温度はマイナスのフリーズの品質に影響を与える可能性があるので、むしろ-80℃の冷凍庫でも液体窒素中で凍結し、すべてのOP9ストックを保管してください。

    3 OP9-DL1共培養手順

    1. 共培養の準備
      1. 約1週間前に、共培養の開始に、MEFは、たmESCとOP9細胞作業STO解凍CKS。 OP9-DL1細胞を共培養8日目までは必要としないことから、共培養開始後の最初の3日間OP9-DL1細胞を解凍。必要に応じて、すべての細胞を維持または凍結。
      2. 実験の規模に基づいて共培養0日目に80％のコンフルエンスに到達するために用意OP9細胞単層を10cmプレートの最初の数を決定する（ 例えば 、MESCクローンの数は、に分化し、共培養の時点の数する）を分析すること。 2日後に控え単層が必要とされるときの6：4と1：共培養の準備をするために、1との間でOP9細胞のコンフルエント皿の近くに分割します。
        注：一つは、ESCクローンごとに少なくとも1つのプレートが必要になります。 （以下に記載するように）一般的に、単一のESCクローンは0日目に、単一のプレートに播種し、5日目の通路で6枚のプレートに播種するのに十分な細胞が得られるはずです。毎日5板は、1次の分析の時刻が有効になります。
      3. OP9単層を継続的に共培養継代のために必要とされるので、常にmaintaに注意してください共培養と並行して、追加のOP9培養プレートの十分な数の。
    2. 0日目：共培養の開始
      1. 2.3.1-2.3.4のようMESCを収集します。細胞を数える。
      2. 各MESCクローンの場合はプレート当たりOP9培地10ml中に5×10 4 MESCを準備します。
        注：私たちはそれを使用していないが、私たちは代替α-MEMからなる培地、10％のFBS、5×10 -5 Mのβ-メルカプトエタノールも分化共培養の使用が報告されていることに注意してください10。
      3. OP9皿から古いメディアを取り出して、プレート全体に均一に細胞を分配するために注意しながら、皿に​​MESC懸濁液の10ミリリットルを追加します。 37℃のインキュベーターに皿を置きます。
    3. 3日目：メディアの変化
      1. インキュベーターから皿を取り出し、顕微鏡下で観察します。コロニーは光沢を失い、平らに現れ始める必要があります。
      2. 皿から培地を除去し、穏やかに新鮮なOP9 10mlのを追加メディア。
      3. インキュベーターに共培養皿を返します。視覚的にコロニーの80〜90％は、視覚的に中胚葉様の形態を表示する〜まで行われるべきではない次の継代（5日目）にOP9フィーダー単層製剤のタイミングを通知するために、毎日の中胚葉様コロニー形成を監視します。 5日目の細胞の転写工程の最大延期は2日です。
    4. 5日目：めっき前とトリプシン仲介通過。
      注：最適なコンフルエントOP9細胞を事前に10cmの皿の十分な数を用意してください。共培養は、視覚的にステップ3.3.3で説明されている機能が表示された場合にのみ次のステップに進みます（これも代表的な結果を参照してください）​​。
      1. 共培養皿からメディアを取り出します。洗浄するために4ミリリットルのPBSを追加します。 PBSを旋回し、削除します。 0.25％トリプシンの4ミリリットルを加え、約5分間インキュベーター内で皿を置きます。
      2. まで、過剰な気泡を導入しないように注意しながら、激しいピペッティングによりトリプシン処理した細胞層を乱す均質で、主に単一細胞懸濁液が達成される。
      3. 完全なOP9メディアの4ミリリットルを加え、ピペッティングにより混和する。 OP9細胞はシャーレに付着させ、30分間インキュベーター内で新しい空の10cmディッシュ、所定の位置に細胞を移す。この「プレめっき」のステップは、共培養の次のステップに移し、OP9細胞の数を減少させる。
      4. 40μmのセルストレーナーで50ml遠心管を準備します。
      5. 事前メッキディッシュから非接着細胞を収集し、チューブにセルストレーナーを介してそれらを渡します。 PBSを6ミリリットルで軽く、皿を洗って、同じストレーナーに通し、背後に付着したOP9細胞を残す。
      6. 4℃で400×gで 5分間で遠心細胞。上清を除去し、完全なOP9培地3mlにペレット化した細胞を懸濁します。細胞を数える。
      7. 最適コンフルエントOP9細胞との10cmプレートから培地を除去。
      8. 各分析時点について、OP9モノに5×10 5細胞を播種10ミリリットル最終容量層。
      9. 5 / mlのヒト組換え体Flt-3Lを加え、インキュベーター内で皿を置きます。
    5. 8日目：造血前駆細胞（HPC）のコレクション
      注：これらはこのステップの時間が〜80％コンフルエントになるように、OP9またはOP9-DL1細胞単層が予め6ウェルプレートの十分な数を用意してください。
      1. 40μmのストレーナーで50ml遠心管を準備します。
      2. インキュベーターから皿を取り出し、顕微鏡下で観察します。のHPCのシャイニークラスタは緩くOP9単層に接続する必要があります。ピペットでOP9単層と皿上の既存のメディアを洗う（ただし、過度に崩壊されていない）により、可能な限りこれらの細胞の多くを収集します。発泡しないようにするには、常にこのHPC収集/洗浄工程の間にピペットの先端でメディアの少なくとも1ミリリットルのままにしておきます。
      3. チューブに40μmのストレーナーを通して細胞を渡します。もし、すべてのHPCを同一プレートに8ミリリットルのPBSを追加し、顕微鏡下で確認してください、私たち再収集。 （必要ならば）より多くの強力な洗浄をPB​​Sで洗浄/回収ステップを繰り返します。すでに同じプレートからの細胞を含むチューブに細胞株。
      4. 4°Cで5分間400×gで遠心分離細胞。
      5. 5 ngのOP9培地の3ミリリットルのマスターミックスを（プレートあたり5日目に播種）の準備/ mlの体Flt-3Lおよび1ng / mlのIL-7。
      6. 体Flt-3L + IL-7マスターミックス（処理された各10cmディッシュ用3ml）でOP9培地で上清と再懸濁ペレットを削除します。 OP9細胞を6ウェルプレートの1ウェルに各プレートから採取した細胞を転送します。
        1. 単球に向けて細胞を駆動するために、B細胞または赤血球系統は、OP9細胞上に回収した細胞を播種する。 T細胞を誘導するために、OP9-DL1細胞単層上に細胞を播種する。
      7. インキュベーターに6ウェルプレートを置きます。
    6. 10日目：メディアの変化
      1. 各個別MESCクローンフィーダーセル型COMBINA用の15ミリリットルの遠心管を準備する共培養中のる。
      2. 体Flt-3Lの5 ng / mlのおよびIL-7の1 ng / mlのでOP9メディアのマスターミックスを調製する。各ウェルについて3ミリリットルを準備します。
      3. 穏やかに同じESCクローンフィーダー細胞タイプの組み合わせを含む複数のウェルから培地を組み合わせる6ウェルプレートの各ウェルから培地を収集する。
      4. 各ウェルに（3.6.2を参照）OP9メディアマスターミックスの2ミリリットルを追加します。
      5. 遠心し、4℃で5分間400×gで収集したメディア。ウェルあたりOP9メディアマスターミックス1ml中各ペレット（可視の場合、非常に小さい）（3.6.2を参照）へのステップ3.6.3に集めて上清を除去し、懸濁します。
      6. よく戻って各への細胞の1ミリリットルを配布メディアは、もともと3ミリリットルを各ウェルにボリュームを持っ収集された。インキュベーターに皿を返します。
    7. 12日目：いいえトリプシン通路
      注：これはsの彼らは最適の時間でコンフルエントされるように、事前にOP9またはOP9-DL1細胞と6ウェルディッシュの十分な数を用意TEP。 12日目には、赤血球、単球、および初期段階のT細胞の開発の分析、フローサイトメトリーに最適です。
      1. マスターミックスのFlt-3Lの5 ng / mlのおよびIL-7の1 ng / mlのでOP9メディアの（共培養で継続され、各ウェルのために3ミリリットル）を準備します。
      2. 40μmのストレーナー（共培養中の各ESCクローンフィーダー細胞型の組み合わせごとに1つ）で50mlの遠心管を準備します。
      3. 激しくウェル中に（単層を含む）のすべてのセルを分解するために、各ウェル内の既存のメディアをピペット。単一細胞懸濁液に似た状態が達成されるまで、力強いピペット操作を続行します。
      4. チューブにストレーナーを通して採取した細胞を渡します。残りのすべての細胞を洗浄し、収集するために各ウェルに3mlのPBSを追加します。同じストレーナーを通して細胞を渡します。同じESCクローンフィーダー細胞タイプの組み合わせを含む複数のウェルから細胞を結合します。
      5. 使用セルストレーナーを破棄し、1ウェルにアリコート相当を削除（〜6ミリリットル）、任意のためのフローサイトメトリー（または他の）は、その日に行わなければ分析する。使用前に氷の上にこれらのアリコートに保管してください。
      6. 4°Cで5分間400×gで遠心分離細胞。上清を取り除きます。ウェル当たりマスターミックス3mlに50mlの遠心分離管からのペレットを再懸濁し、再播種する。適切なフィーダー細胞型への各細胞懸濁液ウェルあたり3ミリリットルを加え、インキュベーター内で皿を置きます。
    8. 14日目：メディアの変化
      1. セクション3.6で説明されている手順に従ってください。
    9. 16日目：いいえトリプシン通路
      注：このステップのために、事前に最適なコンフルエントOP9またはOP9-DL1細胞の6ウェル皿を準備します。
      注：16日目は​​、Bリンパ球および中段T細胞の解析、フローサイトメトリーに最適です。
      1. 3.7節で説明されている手順に従ってください。
    10. 18日目：メディアの変化
      1. セクション3.6で説明されている手順に従ってください。
    11. 20日目：いいえトリプシン通路
      注：20日目私フローサイトメトリーのための理想的なのは、T細胞の開発後期半ばの分析。
      1. 3.7節で説明されている手順に従ってください。必要に応じて、培地交換なしトリプシンを交互過去20日目分化する細胞を運ぶリンパ球の拡大率を毎日モニターしながら、日おき通路。

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結果

LIFの存在下で、MEF上で増殖させた場合、たmESCは、未分化状態に維持することができる。理想的な条件下では、それらは位相差顕微鏡（ 図1）に光沢のあるハローに囲まれた細胞のコンパクトなコロニーとして見える。これらの培養物を毎日監視する必要があります。細胞のコンフルエンスに応じて、メディアを変更することができ、または細胞が分割することができる。隣接MESCコロニーは互いに接触点に来るべきではありません。未分化たmESCの正常な、健康な培養物は、 インビトロ T細胞分化に必須の出発点である。共培養を開始すると、それは細胞が過密することなく、完全にコンフルエントにすることをお勧めします。 OP9単層上に細胞を播種するために回収した細胞の大部分が（むしろフィーダー細胞以外）MESCであるようにするためである。合流点での主な違いは、0日に区別される各種MESCクローン間で観察されている場合、それはTISに予め付着によりMEFにを除去することがベストです共培養シードにたmESCをカウントする前に、（完全なES細胞培地を使用してステップ3.4.3-3.4.6のように）培養皿を訴える。

...

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ディスカッション

OP9-DL1共培養系幹細胞からの血液細胞型の発達中のさまざまな遺伝子産物の役割を研究するために利用されている。8,12,13また、遺伝子調節DNAの機能を研究するための有効なモデルを証明して細胞分化の間に。9,14全体のマウスモデルの代替としてこの方法を使用すると、造血における多くの基本的な質問に対応した実験の時間とコストでかなりの節約をもたらすことができる。しかし、これらの目的のためにこのプロトコルの適合は、これらの手順で使用されるであろうMESCクローン間の潜在的な変動性の認識が必要である。公開されたプロトコルのタイムラインは、手入れの行き届いた、非操作さMESCライン、平均値から期待できる。7また、キメラマウスの作製のために選択されMESCクローンは通常、より高品質のものであり、OP9共培養では非常に堅牢に実行されます。一方、MESCクローンが安定から直接出現異所的に組み込まれた導入遺伝子を用いたトランスフェクションは、平均から平均以下の範囲の初期分化効率のさまざまな程度を表示します。ここに記載されているプロトコルは、in vitroでの造血の...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

私たちはJoon Kim氏に専門的なフローサイトメトリーの支援に感謝します。著者らの研究室での研究は、国立衛生研究所(National Institutes of Health)(BDOにSC1-GM095402を付与)およびカナダ衛生研究所(J.C.Z.P.)のSCOREプログラムによってサポートされています。J.C.Z.P.は、カナダ発生免疫学研究講座の支援を受けています。ハンターカレッジの生物医学研究インフラストラクチャは、助成金MD007599を通じてNIHマイノリティ機関研究センター(RCMI)プログラムによって部分的にサポートされています。また、ニューヨーク州幹細胞科学プログラム(NYSTEM)が、助成金C023048を通じてハンターカレッジでの幹細胞研究の開始を支援したことにも感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
DMEMCorning15-013-CV
幹細胞認定 FBSGemini100-125熱不活性化
ペニシリン/ストレプトマイシンCorning30-002-CI
L-alanyl L-グルタミンCorning25-015-CI
HEPESバッファー ミリポアTMS-003-C
非必須アミノ酸ThermoScientificSH30853.01
ゲンタマイシンリージェント溶液(50 mg / ml)Life Technologies 15750-060
β-メルカプトエタノール(55 mM) in DPBSLife Technologies 21985-023
フィルターユニットミリポアSCGPU05RE0.22 μm PES膜
細胞培養グレード水コーニング25-055-CM
α-MEM ライフテクノロジーズ 12000-022粉末、製造推奨重
炭酸ナトリウムごとに再構成 SigmaS5761-500G
FBSThermoScientificSH 30396.03個々のロットの試験が必要 
ジメチルスルホキシド SigmaD2650
組換えヒト FLT-3 リガンドR&D Systems308-FK
マウス組換えマウス IL-7PeproTech217-17
LIF  ミリポアESG1107
0.1%ゼラチン入りウトラピュア水ミリポアES-006-B
MEFs マイトマイシンC処理ミリポアPMEF-CF有糸分裂的に停止したMEFは、
DPBSCorning21-031-CV
セルストレーナー(40 μm)Fisher22363547
Tissue culture dish 100 x 20 mmBD Falcon353003
Multiwell 6-wellBD Falcon353046
1.5 ml microcentrifuge tubesUSA Scientific1615-5500
15 ml 遠心分離管BD Falcon352096
50 ml 遠心分離管BD Falcon352070
5 mlポリスチレン丸底チューブ、セルストレーナーキャップ付きBDファルコン352235チューブ、FACS用 
ES R1細胞ATCCSCRC-1011
OP9細胞細胞は、理化学研究所細胞リポジトリ(日本)から入手できます。
OP9-DL1細胞    細胞はZúから要求できます。ñiga-Pflücker研究所。
FlowJoソフトウェア 、Tree StarFACSデータ解析
、Flow CytometerBDFACScan、FACSCalibur、FACSVantageを使用しています
当研究室では

参考文献

  1. Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5, 410-417 (2004).
  2. Pui, J. C., et al. Notch1 expression in early lymphopoiesis influences B versus T lineage determination. Immunity. 11, 299-308 (1999).
  3. Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture. Science. 265, 1098-1101 (1994).
  4. Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
  5. Chen, J., Lansford, R., Stewart, V., Young, F., Alt, F. W. RAG-2-deficient blastocyst complementation: an assay of gene function in lymphocyte development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 4528-4532 (1993).
  6. de Pooter, R. F., Cho, S. K., Carlyle, J. R., Zuniga-Pflucker, J. C. In vitro generation of T lymphocytes from embryonic stem cell-derived prehematopoietic progenitors. Blood. 102, 1649-1653 (2003).
  7. Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009, (2009).
  8. Arsov, I., et al. A role for autophagic protein beclin 1 early in lymphocyte development. J Immunol. 186, 2201-2209 (2011).
  9. Lahiji, A., et al. Complete TCR-alpha gene locus control region activity in T cells derived in vitro from embryonic stem cells. J Immunol. 191, 472-479 (2013).
  10. Hirashima, M., Kataoka, H., Nishikawa, S., Matsuyoshi, N., Nishikawa, S. Maturation of embryonic stem cells into endothelial cells in an in vitro model of vasculogenesis. Blood. 93, 1253-1263 (1999).
  11. Nishikawa, S. I., Nishikawa, S., Hirashima, M., Matsuyoshi, N., Kodama, H. Progressive lineage analysis by cell sorting and culture identifies FLK1+VE-cadherin+ cells at a diverging point of endothelial and hemopoietic lineages. Development. 125, 1747-1757 (1998).
  12. de Pooter, R. F., et al. Notch signaling requires GATA-2 to inhibit myelopoiesis from embryonic stem cells and primary hemopoietic progenitors. J Immunol. 176, 5267-5275 (2006).
  13. Watarai, H., et al. Generation of functional NKT cells in vitro from embryonic stem cells bearing rearranged invariant Valpha14-Jalpha18 TCRalpha. 115, 230-237 (2010).
  14. Pipkin, M. E., et al. Chromosome transfer activates and delineates a locus control region for perforin. Immunity. 26, 29-41 (2007).

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