西ナイルウイルス変異株の感染に対するMyD88非介在細胞性免疫応答のインビトロ分析

サマリー

2つのフローサイトメトリーベースの方法 - in vitro T細胞プライミングアッセイと細胞内サイトカイン染色は、樹状細胞の抗原提示能力とマウスのウエストナイルウイルス変異感染に対する抗原特異的T細胞応答を測定するために利用されました。

要約

マウスにおける野生型WNVより生得サイトカインおよびT細胞応答を誘導した弱毒西ナイルウイルス（WNV）、非構造（NS）4B-P38G変異体。最近、骨髄分化因子88（MyD88に）シグナリングがWNV NS4B-P38G変異体感染の間に、初期T細胞プライミングおよびメモリーT細胞の発達に重要であることが示された。本研究では、2つのフローサイトメトリーに基づく方法-アッセイおよび細胞内サイトカイン染色（ICS）をプライミングin vitroで T細胞は-樹状細胞（DC）およびT細胞の機能を評価するために利用された。 OTIIトランスジェニックマウスのCD4 ⁺ T細胞を標識-アッセイプライミングT細胞では、細胞増殖は、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）でのマウスの両群からのDCの共培養の後にフローサイトメトリーによって分析した。このアプローチは、伝統よりも有意に改善全体的な感度で増殖するCD4 ⁺ T細胞の割合の正確な決定を提供放射性試薬を用いたアルアッセイ。マイクロ遠心チューブシステムは、ICSプロトコルの両方の細胞培養およびサイトカイン染色法に使用した。従来の組織培養プレートベースのシステムと比較して、この修正された手順は、バイオセーフティーレベル（BL）3施設で実行することが容易であった。また、WNV-感染細胞BL3施設外さらなる分析を可能に両方のアッセイにおいて、パラホルムアルデヒドで処理した。全体として、これらのin vitro免疫学的ア ​​ッセイは、効率的にWNV感染の間に細胞性免疫応答を評価するために使用することができる。

概要

西ナイルウイルス（WNV）、神経向性、プラス感知されたフラビウイルスは、新興の公衆衛生上の脅威である。現在、ワクチンは、ヒトでの使用¹のために承認されていない。非構造（NS）（b）のタンパク質でP38G置換を有する弱毒WNV株は、野生型WNV NY99株の²以上のマウスには、マウスにおける致死性が、より高い先天性サイトカインおよびT細胞応答を誘導しないことが知られている。 NS4B-P38G変異体で免疫したマウスは、すべての致命的な野生型WNVと二次攻撃から保護された。これは、NS4B-P38G変異体は理想的なワクチン候補に適した特徴を有することを示唆している。 NS4B-P38G変異体は、高い防御適応免疫を誘導する機構は明らかにまだ理解されていない。病原体関連分子パターンを認識するToll様受容体（TLR）は、ウイルス感染に対する自然免疫の開始に重要な役割を果たしている。コアTLRシグナル伝達経路は、骨髄分化一次応答geと利用プライマリアダプタ^3,4としてNE 88（MyD88に）。最近の研究では、MyD88のシグナル伝達は、マウス⁵におけるWNV NS4B- P38G変異感染中の細胞性免疫の発達に重要な役割を果たすことが示された。樹状細胞（DC）は、ウイルス感染の^6,7の間に、一次T細胞応答を開始するためのユニークな能力を示す最も重要な抗原提示細胞の一つである。 CD4 ⁺およびCD8 ^....

プロトコル

全ての動物実験は、テキサスメディカル支店大学の動物実験委員会によって承認された。

非感染およびWNV感染マウスからのDCの単離

1. 年齢および性別が一致6-10週齢の野生型C57BL / 6（B6）とのMyD88 ^{- / -}マウス。腹腔内（IP）WNV NS4B- P38G変異体の500プラーク形成単位（P​​FU）で接種する。 ^{- / -} CO ₂を用いたマウス感染後3日目に、B6マウス及びMyD88-を安楽死させる。コントロールとして、両グループの非感染マウスを使用してください。各グループから3匹のマウスを使用してください。
2. 70％エタノールを使用して屠殺したマウスの左側にウェット毛皮と、マウスの左側に沿って前後脚の間の約半分の毛皮を切り取る。体腔を切り開い。鉗子を使用して脾臓を削除します。 RPMIでペトリ皿に脾臓を置きます。
3. に従って抗CD11c磁気ビーズを使用して、脾臓DCを単離する製造元の説明書。

2.精製とOTIIトランスジェニックマウスのT細胞の標識

1. ナイーブOTIIマウスから収穫1脾臓は、上記のステップ1.2で説明したと2スライドのすりガラス端部の間に脾臓を均質化するように。 14ミリリットルにRPMI培地を加えるを15mlコニカ....

結果

^{- / -} OVAペプチドの存在下または非存在下でマウスT細胞プライミングアッセイでは、CFSE標識CD4 ⁺ T細胞は、NS4B-P38G変異感染野生型マウス及びMyD88-から精製されたDCと培養した。 5日間またはOVAなしで単独で培養した標識​​されたT細胞は、陰性対照として使用した。 図1Aに示すように、総T細胞は、FL1チャネルで蛍光強度を分析するためにゲートした。マーカーはDCの共培養せずに増殖速度を決定するために、0日目に新鮮に標識されたCD4 ⁺ T細胞に基づいて設定した。この培養条件下での増殖率（1.6％）の低レベルがあった。 1：1の比と同じマーカー10でDCと共培養したCD4 ⁺ T細胞の増殖速度を決定した。により共培養におけるその高い比率とその増殖性質のため、T細胞は、追加の表現型のSTAIなしで混合集団にゲートをすることができます寧。 図1Bに示したものと同じ条件下で処理3つのサンプルの一つの代表的に示されるように、87.0％の増殖速度は、野生型群であっ.......

ディスカッション

WNVは、BL3の病原体である。起因する安全規制に、WNVに感染したサンプルを用いた免疫学的アッセイは、多くの場合、BL3施設または実行するために、より長くて退屈な時に機器の利用可能性によって制限されている。最近の研究では、WNV感染の⁵中の細胞性免疫応答を研究するための2つのフローサイトメトリーに基づく方法を使用する。両方のアッセイでは、WNV感染細胞を直接またはPFA 4％を含有する固定化/透過化溶液で1〜2％PFAで処理した。これは、ウイルス感染細胞を1％PFA固定を効率的に検出限界が¹²以下の感染性粒子の数を減らすことができることが知られている。そのため、両方の方法を大幅にBL3施設内部のパフォーマンス時間が減少している。 BrdUの取り込みまたは放射性チミジンを介したものを含む、T細胞増殖を測定するための多くの確立されたアッセイは、存在し、フローサイトメトリーに基づくインビトロの T細胞に CFSEを用いたアッセイをプライミングはOTII T細胞を標識した粗腐植を提供している有意に改善全体的な感度でCD4 ⁺ T細胞を増殖の.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
RPMI 1640	Invitrogen	11875	ウォームアップ 37 °C;C
抗CD11c磁気ビーズ	Miltenyi Biotec	130-052-001	はメーカーの指示
反CD4磁気ビーズ	Miltenyi Biotec	130-095-248	は、メーカーに従ってくださいS instructions
CFSE	Invitrogen	C34554
OVA residue 323-339	Genscript Corporation	RP10610
Peptides	Proimmune	PC0AD-D
Brefeldin A solution	BD Bioscience	555029
Mouse Fc Blocker	e-Bioscience	14-0161-85
APC-conjugated CD4	e-Bioscience	17-0041-81
FITC-conjugated CD8	e-Bioscience	11-0081-82
固定・透過処理液	BD-Bioscience	554722
透過・洗浄バッファー	BD-Bioscience	554723
anti-IFNγ-PE	e-Bioscience	12-7311-82
Accuri flow cytometer	BDバイオ サイエンス