西ナイルウイルス変異株の感染に対するMyD88非介在細胞性免疫応答のインビトロ分析

サマリー

2つのフローサイトメトリーベースの方法 - in vitro T細胞プライミングアッセイと細胞内サイトカイン染色は、樹状細胞の抗原提示能力とマウスのウエストナイルウイルス変異感染に対する抗原特異的T細胞応答を測定するために利用されました。

要約

マウスにおける野生型WNVより生得サイトカインおよびT細胞応答を誘導した弱毒西ナイルウイルス（WNV）、非構造（NS）4B-P38G変異体。最近、骨髄分化因子88（MyD88に）シグナリングがWNV NS4B-P38G変異体感染の間に、初期T細胞プライミングおよびメモリーT細胞の発達に重要であることが示された。本研究では、2つのフローサイトメトリーに基づく方法-アッセイおよび細胞内サイトカイン染色（ICS）をプライミングin vitroで T細胞は-樹状細胞（DC）およびT細胞の機能を評価するために利用された。 OTIIトランスジェニックマウスのCD4 ⁺ T細胞を標識-アッセイプライミングT細胞では、細胞増殖は、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）でのマウスの両群からのDCの共培養の後にフローサイトメトリーによって分析した。このアプローチは、伝統よりも有意に改善全体的な感度で増殖するCD4 ⁺ T細胞の割合の正確な決定を提供放射性試薬を用いたアルアッセイ。マイクロ遠心チューブシステムは、ICSプロトコルの両方の細胞培養およびサイトカイン染色法に使用した。従来の組織培養プレートベースのシステムと比較して、この修正された手順は、バイオセーフティーレベル（BL）3施設で実行することが容易であった。また、WNV-感染細胞BL3施設外さらなる分析を可能に両方のアッセイにおいて、パラホルムアルデヒドで処理した。全体として、これらのin vitro免疫学的ア ​​ッセイは、効率的にWNV感染の間に細胞性免疫応答を評価するために使用することができる。

概要

西ナイルウイルス（WNV）、神経向性、プラス感知されたフラビウイルスは、新興の公衆衛生上の脅威である。現在、ワクチンは、ヒトでの使用¹のために承認されていない。非構造（NS）（b）のタンパク質でP38G置換を有する弱毒WNV株は、野生型WNV NY99株の²以上のマウスには、マウスにおける致死性が、より高い先天性サイトカインおよびT細胞応答を誘導しないことが知られている。 NS4B-P38G変異体で免疫したマウスは、すべての致命的な野生型WNVと二次攻撃から保護された。これは、NS4B-P38G変異体は理想的なワクチン候補に適した特徴を有することを示唆している。 NS4B-P38G変異体は、高い防御適応免疫を誘導する機構は明らかにまだ理解されていない。病原体関連分子パターンを認識するToll様受容体（TLR）は、ウイルス感染に対する自然免疫の開始に重要な役割を果たしている。コアTLRシグナル伝達経路は、骨髄分化一次応答geと利用プライマリアダプタ^3,4としてNE 88（MyD88に）。最近の研究では、MyD88のシグナル伝達は、マウス⁵におけるWNV NS4B- P38G変異感染中の細胞性免疫の発達に重要な役割を果たすことが示された。樹状細胞（DC）は、ウイルス感染の^6,7の間に、一次T細胞応答を開始するためのユニークな能力を示す最も重要な抗原提示細胞の一つである。 CD4 ⁺およびCD8 ⁺ T細胞は、長期間持続する防御免疫に寄与し、野生型WNV感染の^8,9次宿主の生存のために重要である両方。二つの免疫学的アッセイは、NS4B-P38G変異体に感染したマウスにおけるこれらの細胞の機能を評価するために、本研究に使用した。

^{- / -}マウスで最初に、 インビトロでの T細胞プライミングアッセイは、WNV感染野生型マウス及びMyD88-のDCの抗原提示能力を比較するために利用された。アッセイ、ナイーブCD4の感度を高めるために、<商標> + T細胞は、323、ニワトリオボアルブミン（OVA）ペプチドをVα2/Vβ5TCR特異的に発現OTIIトランスジェニックマウスから単離した- WNV感染したマウスの339 DCは、カルボキシフルオレセインスクシンイミイースターで精製し、共培養した（CFSE OVAペプチドの存在下で）標識CD4 ⁺ T細胞。共培養の5日後、細胞を採取し、パラホルムアルデヒド（PFA）で固定し、フローサイトメトリーによって分析した。増殖アッセイは伝統的に、5-ブロモ-2'-デオキシウリジン（BrdU）の取り込みまたはトリチウム化チミンデオキシリボシド^{（3 HTdr）10}を介して行われている。それにもかかわらず、これらのアッセイは、放射性および/またはバイオセーフティーレベル（BL）WNVの研究が行われている3施設、での特別な設備を必要としてのいずれかである。生体染色色素の蛍光強度CFSEのシリアル半減によるリンパ球増殖のフローサイトメトリー分析は、より一般的に染料をより安定的であるように、免疫学的アッセイにおいて使用されるようになっている均等に、細胞内に取り込まれ、フローサイトメトリーによって容易に検出され^、11非放射性である。アッセイはまた、細胞分裂の数を評価する能力を有する。 WNVの研究において、このアッセイを使用する1つの大きな利点は、1〜2％PFAによる感染細胞の固定はBL2実験において、フローサイトメーターでサンプル採取を可能にするWNV ^12を不活性化する可能性があることである。

次に、変更された細胞内サイトカイン染色（ICS）手順がNS4B-P38G変異体感染マウスにおけるWNV特異的T細胞応答の調節におけるシグナル伝達のMyD88の役割を研究するために使用された。このアッセイでは、感染したマウスから単離した脾細胞を、WNV特異的なペプチドを用いてインビトロで処理した。ブレフェルジンAは、細胞内サイトカインを保持するために添加した。 5時間のインキュベーション後、細胞を回収し、洗浄し、T細胞サブセットを染色した。次いで、細胞を（IFN）-γおよびフローサイトメトリーによって分析し、インターフェロンのために透過処理、染色、PFAで固定した。細胞は、PFAを含む固定および透過化緩衝液で処理されると、他のフローサイトメトリーに基づくアッセイと同様に、感染したサンプルは、さらなる処理および分析のためBL2室に移すことができる。いくつかの公表された研究では、我々は、WNV感染マウス^13,14におけるT細胞エフェクター機能を測定するためにICSを使用している。それは十分に確立さですが、このアッセイの一つの主要な欠点​​は、手順が非常に長いですし、BL3施設内で行わより多くの時間がかかることができることです。ここで、微小遠心管ベースのICS法はより実現可能であることが示された、進行しやすくとBL3研究所内で行うより少ない時間がかかる。

プロトコル

全ての動物実験は、テキサスメディカル支店大学の動物実験委員会によって承認された。

非感染およびWNV感染マウスからのDCの単離

1. 年齢および性別が一致6-10週齢の野生型C57BL / 6（B6）とのMyD88 ^{- / -}マウス。腹腔内（IP）WNV NS4B- P38G変異体の500プラーク形成単位（P​​FU）で接種する。 ^{- / -} CO ₂を用いたマウス感染後3日目に、B6マウス及びMyD88-を安楽死させる。コントロールとして、両グループの非感染マウスを使用してください。各グループから3匹のマウスを使用してください。
2. 70％エタノールを使用して屠殺したマウスの左側にウェット毛皮と、マウスの左側に沿って前後脚の間の約半分の毛皮を切り取る。体腔を切り開い。鉗子を使用して脾臓を削除します。 RPMIでペトリ皿に脾臓を置きます。
3. に従って抗CD11c磁気ビーズを使用して、脾臓DCを単離する製造元の説明書。

2.精製とOTIIトランスジェニックマウスのT細胞の標識

1. ナイーブOTIIマウスから収穫1脾臓は、上記のステップ1.2で説明したと2スライドのすりガラス端部の間に脾臓を均質化するように。 14ミリリットルにRPMI培地を加えるを15mlコニカルチューブに細胞懸濁液を移す。サスペンションは5分間座って、新しい15ミリリットルコニカルチューブにそれの13ミリリットルを転送してみましょう。
2. 製造業者の説明書に従ってCD4 ⁺ T細胞単離キットを使用して、脾臓CD4 ⁺ T細胞を単離する。
3. を50mlコニカルチューブに転送細胞は、PBSで2回洗浄する。再懸 ​​濁し、1ml当たり1×10 ⁶細胞を、0.5％ウシ血清アルブミン（BSA）を有するPBS中の細胞とCFSEの0.5モル/ mlに加える。光から保護し、10分間、37℃でインキュベートする。
4. 10％の熱不活化ウシ胎児血清を5ミリリットルの冷完全培地（RPMI-1640を追加し、100分の1巻1000×1000の2-メルカプトエタノール、抗生物質/抗真菌剤、1/100体積L-グルタミンおよび1 / 1,000倍容量）。
5. 氷上で5分間インキュベートします。 PBSで細胞を1回洗浄し、2％PFAで0.2×10 ⁶ラベルのCD4 ⁺ T細胞を固定し、フローサイトメーターで取得する。 CFSEの基礎レベルを決定するために、このサンプルを使用します。完全培地中の標識細胞の残りを再懸濁。

WNV感染マウスのDCと3。共培養OTII T細胞

1. 培養2×10 OTIIマウスの⁵精製CD4 ⁺ T細胞単独で、または野生型もしくはMyD88の精製されたDCと^{- / -}またはOVA残基323-339無し24ウェルプレート中のマウス（2×10 ^4）（1グラムウェルあたり1mlの完全培地中/ ml）を。
2. 5日間、37℃で細胞をインキュベート。収穫細胞は、（1％FBSを含むPBS）、FACS緩衝液中で2回洗浄すると0.25mlの2％PFAで固定する。ボルテックスすぐに。

インビトロの4。フローサイトメトリー分析</ em>のT細胞プライミング

1. 買収のために、フローサイトメトリーソフトウェアのアイコンをダブルクリックする。 対 SSC-AのFSC-Aと200,000 0上の線形SSC-A、チャンネルを選択0 200,000リニアFSC-Aの密度プロットのために。その後、生細胞にゲートを作成（P2; 図1A参照 ）。
2. CFSEの蛍光強度を分析するために、FL1チャンネルのヒストグラムを開き、ゲーテッド集団20,000のイベントを取得する。単独で培養し（ 図1A）OTII細胞のための試料上のマーカーを設定します。
3. 野生型のDC（ 図1B）またはMyD88のと共培養OTII細胞のためのサンプルを取得する^{- / -}樹状細胞（ 図1C）と同様の方法で。

5.絶縁およびサイトカインアッセイ用の脾細胞の刺激

1. steのと同様の手順を用いて、WNV NS4B-P38G変異を有するマウス^{- / -} B6およびMyD88に感染するP 1.1。日、30日8と21ポストのプライマリWNV感染または二次感染後4日目に、野生型WNV株IPの2000 PFUで感染後、再チャレンジ生存マウスでは、脾臓の収集のためにCO ₂でマウスを安楽死させる。
   注：我々は、各時点についてグループごとに2〜3匹のマウスを使用していました。
2. ステップ1.2＆ステップ2.2で上記のように脾臓細胞の単一細胞懸濁液を作成します。血球計数器を用いて細胞をカウントし、10mlの完全培地中に再懸濁これら。
3. 2.5×10 ⁶細胞/ mlの完全培地で細胞を希釈する。 1.5ミリリットルのマイクロ遠心管に脾細胞の1ミリリットルを追加します。
4. DMSO中1mg / mlのWNV特異NS4B及びEペプチド（SSVWNATTAとIALTFLAV）を、CD8 ⁺ T細胞をシミュレー希釈する。 CD4 ⁺ T細胞の刺激のために、DMSO中1mg / mlのWNV特異的NS3およびEペプチド（RRWCFDGPRTNTILEとPVGRLVTVNPFVSVA）を希釈する。 followe細胞へのペプチドの10μlのを追加します。ブレフェルジンの1μlの溶液によるD。コントロールとしてのペプチド処理なしに細胞を使用してください。細胞を混ぜる。
5. チューブのキャップで18 G針で2穴パンチ。 5時間、37℃で細胞をインキュベート。

6.細胞内サイトカイン染色

1. 新しいマイクロ遠心チューブに細胞を移す。 300〜400×gで5分間細胞をスピンし、上清を捨てる。 120μlのFACS緩衝液でピペッティングにより1mlのFACS緩衝液を追加し、300〜400×gで5分間スピンし、再懸濁細胞。
2. 2μlのFcの遮断を追加し、10分間室温で細胞をインキュベートする。各チューブに1ミリリットルFACSバッファーを追加します。 400×G - 300でスピン5分。
3. 再懸 ​​濁300μlのFACS緩衝液で細胞をし、3本のチューブ（チューブ当たり約0.8×10 ⁶細胞）にそれらを分割する。 表1に示すように、ラットのIgG-PE染色のために、各培養条件の第一の管を予約する。第二の管の場合、CD4ペプチド処理細胞への抗CD4 APCの3μlを添加、3μペプチド処理なしの細胞に対するCD8ペプチド処理細胞または双方の抗体に対する抗CD8 FITCのリットル。補償染色するための第3のチューブを使用してください。各培養条件については、APC結合CD4、FITC結合CD8またはFL1、FL2及びFL4チャネルの補償コントロールなどの単独のPE-ラベルCD3抗体（チューブあたり3μL）で染色した細胞の3本のチューブを使用しています。
4. 簡単にボルテックス細胞。氷上で20分間のままにして、光から保護する。 1.4ミリリットルFACS緩衝液を追加します。 300〜400×gで5分間スピンし、上清を捨てる。
5. 細胞ペレット（または簡潔に渦を）破壊すること攪拌する。 250μlの固定/透過化solutionbyのペッティングで細胞ペレットを再懸濁。 20分間室温でインキュベートし、光から保護する。
6. 1.2ミリリットルFACS緩衝液を追加します。 300μlのFACS緩衝液中で300〜400×gで再懸濁細胞でのスピン5分。
   注：この時点で、細胞は、さらなる処理のためにBL2ラボに転送することができるか、冷蔵庫に保存し、uのために光から保護3日のp。
7. 500μlのFACSバッファーを追加します。スピン1X透過化/洗浄緩衝液500μl中で300〜400×gで再懸濁細胞で5分。スピン300~400×gで5分間。
8. 以前に予約済みチューブのステップ6.3および3.5μlのラットのIgG-PEでCD4のための抗体および/ ​​またはCD8 T細胞マーカーを付加したチューブに3.5μlの抗IFNγ-PEを追加し、100μlの1×パーマ/洗浄で細胞を再懸濁氷上で25分間のIgGコントロールのために、光から保護する。 1X透過化/洗浄緩衝液1.4ミリリットルを追加することによって、細胞を洗浄。スピン300~400×gで5分間。 1.4ミリリットル1X透過化/洗浄バッファーを追加することによって、洗浄工程を繰り返します。
9. 300〜400×gで5分間スピンし、上清をデカント。 FACS緩衝液1.4ミリリットルと、最終的な獲得のためのFACS緩衝液400μlの再懸濁を追加することによって、細胞を洗浄。

細胞内サイトカイン染色の7フローサイトメトリー分析

1. ステップ4.1と同じ取得設定を使用します。クレア生細胞上のゲートTE（P2を、 図2Aを参照）。各グループの補償管を使用して電圧を調整します。
2. 二つの新しいドットプロット、 対 FL1のために収集したデータを表示するための1を開きます。 FL2（CD8 対 。IFN-γ）、他方は対 FL4のために収集されたデータを表示することである。 FL2（CD4 VS。IFN-γ）。各サンプルのゲートされ、人口5万のイベントを取得します。

結果

^{- / -} OVAペプチドの存在下または非存在下でマウスT細胞プライミングアッセイでは、CFSE標識CD4 ⁺ T細胞は、NS4B-P38G変異感染野生型マウス及びMyD88-から精製されたDCと培養した。 5日間またはOVAなしで単独で培養した標識​​されたT細胞は、陰性対照として使用した。 図1Aに示すように、総T細胞は、FL1チャネルで蛍光強度を分析するためにゲートした。マーカーはDCの共培養せずに増殖速度を決定するために、0日目に新鮮に標識されたCD4 ⁺ T細胞に基づいて設定した。この培養条件下での増殖率（1.6％）の低レベルがあった。 1：1の比と同じマーカー10でDCと共培養したCD4 ⁺ T細胞の増殖速度を決定した。により共培養におけるその高い比率とその増殖性質のため、T細胞は、追加の表現型のSTAIなしで混合集団にゲートをすることができます寧。 図1Bに示したものと同じ条件下で処理3つのサンプルの一つの代表的に示されるように、87.0％の増殖速度は、野生型群であっ...

ディスカッション

WNVは、BL3の病原体である。起因する安全規制に、WNVに感染したサンプルを用いた免疫学的アッセイは、多くの場合、BL3施設または実行するために、より長くて退屈な時に機器の利用可能性によって制限されている。最近の研究では、WNV感染の⁵中の細胞性免疫応答を研究するための2つのフローサイトメトリーに基づく方法を使用する。両方のアッセイでは、WNV感染細胞を直接またはPFA 4％を含有する固定化/透過化溶液で1〜2％PFAで処理した。これは、ウイルス感染細胞を1％PFA固定を効率的に検出限界が¹²以下の感染性粒子の数を減らすことができることが知られている。そのため、両方の方法を大幅にBL3施設内部のパフォーマンス時間が減少している。 BrdUの取り込みまたは放射性チミジンを介したものを含む、T細胞増殖を測定するための多くの確立されたアッセイは、存在し、フローサイトメトリーに基づくインビトロの T細胞に CFSEを用いたアッセイをプライミングはOTII T細胞を標識した粗腐植を提供している有意に改善全体的な感度でCD4 ⁺ T細胞を増殖の...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
RPMI 1640	Invitrogen	11875	ウォームアップ 37 °C;C
抗CD11c磁気ビーズ	Miltenyi Biotec	130-052-001	はメーカーの指示
反CD4磁気ビーズ	Miltenyi Biotec	130-095-248	は、メーカーに従ってくださいS instructions
CFSE	Invitrogen	C34554
OVA residue 323-339	Genscript Corporation	RP10610
Peptides	Proimmune	PC0AD-D
Brefeldin A solution	BD Bioscience	555029
Mouse Fc Blocker	e-Bioscience	14-0161-85
APC-conjugated CD4	e-Bioscience	17-0041-81
FITC-conjugated CD8	e-Bioscience	11-0081-82
固定・透過処理液	BD-Bioscience	554722
透過・洗浄バッファー	BD-Bioscience	554723
anti-IFNγ-PE	e-Bioscience	12-7311-82
Accuri flow cytometer	BDバイオ サイエンス