の検出その場でタンパク質 - タンパク質複合体ショウジョウバエ幼虫神経筋接合部

サマリー

このプロトコルは、近接ライゲーションアッセイは、ショウジョウバエの幼虫神経筋接合部で、その場のタンパク質-タンパク質相互作用に検出するために使用することができる方法を示しています。この技術では、大規模で胡-LIの太極拳シャオディスクは、シナプス後の領域に、以前に共免疫沈降を介して同定関連を複合体を形成することが示されている。

要約

Discs large）は、膜結合グアニル酸キナーゼファミリーの保存メンバーであり、ショウジョウバエの幼虫神経筋接合部(NMJ)で主要な足場タンパク質として機能します。これまでの研究で、幼虫NMJにおけるDlgのシナプス後分布は、哺乳類のアドデューシンの相同体であるHu-li tai shao(Hts)のシナプス後分布と重なることが示されている。さらに、DlgとHtsは、成虫の全成虫のハエ溶解物を含む共免疫沈降実験に基づいて、互いに複合体を形成することが観察されています。しかし、これらの実験の性質上、この複合体が幼虫の発育中にNMJに特異的に存在するかどうかは不明でした。

Proximity Ligation Assay (PLA)は、最近開発された技術で、主に細胞や組織の培養に使用され、タンパク質間相互作用をその場で検出することができます。このアッセイでは、標準的な免疫組織化学的手順を用いて、目的の2つのタンパク質に対する一次抗体とサンプルをインキュベートします。次に、一次抗体は、PLAプローブと呼ばれる特別に設計されたオリゴヌクレオチド標識二次抗体のペアで検出され、2つのプローブが互いに近接して結合した場合にのみシグナルを生成するために使用できます。したがって、複合体中にあるタンパク質を視覚化することができます。ここでは、PLAを使用してショウジョウバエの幼虫NMJでin situタンパク質間相互作用を検出する方法を示します。この手法は、幼虫の体壁筋製剤で行われ、DlgとHtsの間の複合体がNMJのシナプス後領域に実際に存在することを示します。

概要

（Dlgという）大ショウジョウバエディスクは、原形質膜の特定の部位での大きなタンパク質複合体の集合を編成助ける足場タンパク質の膜結合グアニル酸キナーゼファミリーの保存されたメンバーである。腫瘍抑制タンパク質は、Dlgという上皮apicobasal極性^1,2,3の重要な決定因子として機能するように最初に同定された。 DLGはまた幼虫の発育⁴中のグルタミン酸作動性運動ニューロンの神経筋接合部（NMJ）での主要な足場モジュールとして提供しています。 DLGは幼虫NMJでの多様な役割を果たし、その多面発現は、複数のタンパク質^5,6と会合する能力に依存しています。このようなタンパク質の1つは、胡-LIの太極拳シャオ（HTS）、主にアクチンスペクトリン細胞骨格^7の調節における役割に関してに記載されている哺乳類adducinsにホモログである。これは、以前には、Dlgおよびフーバー、インビトロに基づいて、互いに複合体を形成することができることが示されているの全体の大人のフライ溶解物^8を含む共免疫沈降実験。これらの結果の一つの欠点は、しかし、それらはここで、この複合体の形態を示すものではないということである。免疫組織化学を使用することにより、Dlgというおよびフーバーの分布は、幼虫のNMJのシナプス後膜にオーバーラップすることが観察されますが、この領域⁸で複合体中にありますか？最近示されており、ここでさらに詳述されるように、近接ライゲーションアッセイ（PLA）は、幼虫のNMJ ²⁷で特異的には、Dlgとフーバーの間にその場での関連で検索するために使用されます。

PLAは、主にその場 ⁹ でのタンパク質-タンパク質相互作用を検出することができ、細胞および組織培養に使用される比較的新しい技術である。このアッセイでは、目的の2つのタンパク質に対する一次抗体は、種特異的二次抗体の対を用いて検出される、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされたPLAプローブと呼ばれる（ 図1A、B）。 2タンパク質の場合sは、添付のPLAのプローブ間の距離は、2つの追加のコネクターオリゴヌクレオチド（ 図1C）のハイブリダイゼーションを介してブリッジすることができる（数十ナノメートル以内すなわち ）は、互いに近接している。この立体配座において、コネクタオリゴヌクレオチドの自由端が互いに接触するのに十分近く、閉じた環状DNA分子は、in situ ライゲーション （ 図1D）に基づいて形成することができる。環状DNA分子は、PLAプローブ（ 図1E）にコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドのいずれかによって準備され、その場でのローリングサークル増幅のための鋳型として働く。得られた増幅、コンカテマーDNA産物内の配列は、次いで、蛍光標識された相補的オリゴヌクレオチドプローブ（ 図1F）で可視化することができる。増幅されたDNAは、PLAプローブの1つは、タンパク質 - タンパク質相互作用withiの細胞内局在に付着したままであるので組織ナ容易に確認することができる。

いくつかの方法は、一般に、共免疫沈降、プルダウンアッセイおよび酵母ツーハイブリッドスクリーニングなどのインビトロ技術において 、そのようなフェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）と二分子蛍光相補性（のようなインビボ技術を含むタンパク質-タンパク質相互作用を検出するために使用されるBIFC）。 インビトロ技術の落とし穴は、相互作用が内生的に発生している場所で 、前述のインビボ技術は、それらの内因性の対応のネイティブ動作を反映していない可能性が融合タンパク質の人工的な発現を伴うながら、彼らは、特定していないということです。 PLAの1つの主な利点は、それがFRに匹敵する信号を生成するために必要な近さの程度と、組織内で互いに近接していると可能性が高い複合体を形成する内因性タンパク質の相互作用因子の細胞内局在を決定することができるということであるETとBIFC。 PLA起因抗体認識およびDNA増幅のカップリングに高い特異性と感度との相互作用を検出することができる。したがって、このアッセイは、相互作用の正確な位置を明らかに涙の形で個別の、明るい信号を生成することができる。また、ほとんどの可視抗原を検出することができる。最後に、PLAは、実行する比較的簡単な技術ではない、それが完了するために、標準的な免疫組織化学的手順よりも、もはやかかる。従って、PLAは、多くの場合、長い準備時間と広範なトラブルに悩まされている他のタンパク質 - タンパク質相互作用アッセイを介して技術的な利点を提供する。

このプロトコルは、PLAは、 その場での内因性のタンパク質-タンパク質相互作用を検出するために、ショウジョウバエ幼虫NMJに適用することができる方法を示す。ここでは、PLAは、は、Dlgおよびフーバーが実際のNMJのシナプス後領域に複合体中に存在することが示されている幼虫の体壁筋調製物に対して行われる。 PLAは、以前に幼虫のNMJを研究するために使用されていなかった、とショウジョウバエの組織でこのアッセイを使用している論文のほんの一握りは、現状であります。これは、 ショウジョウバエコミュニティにPLAのさらなる暴露は、他のより一般的に使用されるタンパク質-タンパク質相互作用アッセイを補完する追加のツールとしての利用増加につながることが期待されている。

プロトコル

1.ボディウォール準備

NOTE：（体壁の筋肉を神経支配のNMJの研究のための）第三齢幼虫の体壁の調製先にブレントに記載したように行ったら ^10、またはラマチャンドラとBudnik ^11,12が、いくつかの修正を加えた。

1. 解剖
   1. 標準的な手順^13を使用して五から六日間、25℃でフライ株式や十字架を上げる。
   2. 細かい鉗子を使用してバイアルまたはボトルから3齢幼虫をクロールピック。
   3. 任意の食物粒子を除去するためにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を含有する小さなペトリ皿に幼虫を洗浄する。
   4. シルガードディスクに、単一の幼虫を置き、氷冷PBSの数滴でそれを浸す。氷冷したPBSを使用すると、簡単に操作すること幼虫を気絶させるのに役立ちます。解剖を通して、準備は常に乾燥からそれを防ぐために、PBS中に沈められていることを確認してください。
   5. ラを配置します2気管路は解剖顕微鏡（ 図2A）の下に表示されるようにその背側を上にしてRVA。鉗子を使用して、minutienピンを把持気門（ 図2B）の近くに後端で幼虫を突き止めるする。別のピンを使用すると、口のフックに近い前方の終わりにキューティクルを貫通。ゆっくりと（ 図2B）、それを突き止めるその後、縦に幼虫を伸ばす。
   6. 顕微解剖はさみを使って、小さな開口部を作成するために、ピンの近くに後部の端をつまんで。切開はちょうどキューティクルを通過するのに十分表面的でなければならない。
   7. 2気管路（ 図2C）との間の背側正中線の全長に沿って切断し、切開部に鋏の底刃の先端を配置する。腹側体壁の筋肉を損傷しないように切断する際に、わずかに上向きにはさみの刃を向け。
   8. 小さな水平切開を行い、わずかにポストの前方eriorly-置かピン（ 図2C）。別の類似の切開がやや前方に-置かピン（ 図2C）に後方を確認します。切開はちょうどキューティクルを通過する必要があります。
      注：似ている必要があります合わせてステップ1.1.7と1.1.8から3切開」 完成した時」、 すなわち 、幼虫の体の背側の左右のフラップが生成されるべきである。
   9. 慎重にピンセットで内臓をきれいに。 PBSの少数の力強い滴を追加すると、幼虫の体から臓器を変位ため、それが簡単にそれらを削除することに役立ちます。それは体壁の筋肉の損傷の原因になりますように幼虫の体を突っついは避けてください。
   10. オープン幼虫の体を広げると（ 図2D）のコーナーを突き止める。ピン止めするとき、均等に張力をかけ長方形を形成するように水平方向と垂直方向の両方で体壁を伸ばす（それ形状の電子図2G）、その過程で体壁の筋肉を引き裂くないように注意しながら。
   11. 残りの内臓（ 図2E）を除去完了。
2. 固定および透過
   1. ブアン溶液を数滴に固定体の壁を浸し。氷上で15分間インキュベートする。あるいは、代替固定液として4％パラホルムアルデヒド（PFA）を使用。 30分間インキュベートする。
   2. トリトンとのリン酸緩衝生理食塩水（PBT）で3回洗浄します。
   3. 細かい鉗子を使用して、慎重にピンを取り外し、シリコン処理0.65ミリリットルマイクロ遠心チューブに彼らのコーナーによって身体の壁を転送する。
   4. PLAの準備が整うまで4℃でPBTの体壁を保管してください。最適な結果を得るために、一日または解剖の2以内に身体壁を免疫染色始める。
      注：試薬上のアイコンをクリックすると、すべての体壁がアッセイ中に平等に扱われることを保証するために、異なる遺伝子型は、単一の中に入れることができるチューブ。遺伝子型（例については、図2Fを参照）異なっ体壁の角を切断することによって区別することができる。

2.免疫組織化学

注：三齢幼虫の体壁の免疫染色は、以前にブレントら ¹⁴とラマチャンドランとBudnik ¹¹に記載のように行ったが、いくつかの変更^11,14とした。
注：特に明記しない限り、室温で、穏やかに攪拌しながら、すべての手順を実行します。

1. 阻止
   1. 10分間ずつPBTで三回体の壁を洗ってください。
   2. 1時間、1％ウシ血清アルブミン（BSA）でブロックする。
2. 免疫染色
   1. 目的の2つのタンパク質に対するマウスおよびウサギ一次抗体と体壁をインキュベートし、室温で2時間、または4℃で一晩のために（1％BSAで希釈）。 250ウサギaの場合：この場合は、1：10のマウス抗は、Dlgおよび1を使用NTI-HTSM ^15,16。マウスまたはウサギで行われていないマーカーに対する抗体も含まれることができる- 例えば 、1を使用：200ヤギ抗HRPニューロン膜を描写する。
   2. PBTで10分間ずつ3回洗浄する。
   3. 室温で2時間、または4℃で一晩のために（1％BSAで希釈）のマーカーを検出するためのフルオロフォア結合二次抗体と共にインキュベートする。ヤギ抗HRP抗体を検出するために、200 FITC結合抗ヤギ： 例えば 1を使用する- PLA信号は後で赤色蛍光体で可視化されるように、別のフルオロフォアは、マーカーを検出するために使用されなければならない。による感光性試薬の使用、以降この点から、暗所で管を保持する。
      注：PLAは、共焦点顕微鏡下で赤チャンネル上で可視化信号と、マウスおよびウサギで育った一次抗体との間で実行されるために使用されているキットができます。所望であれば、他のキットは、アッセイがプリマで行うことができるように利用可能であるRY他の種で作製された抗体、および他のチャネル上で可視化シグナル。

3.近接ライゲーションアッセイ

注：特に明記しない限り、室温で、穏やかに攪拌しながら、すべての手順を実行します。

1. PLAプローブ
   1. 10分間ずつPBTで三回体の壁を洗ってください。
   2. 37℃で2時間：（1％BSAで5希釈の各1）PLAプローブとインキュベートする。この場合、5-10体壁の適切な浸漬及び混合を確実にするためにPLAプローブ抗マウスMINUS40μlの、PLAプローブ抗ウサギPLUS40μlの1％BSAの120μlのを使用する。 PLAプローブ1:25希釈までまだ（この実験のために、すなわち 、）十分な信号対雑音比をもたらすことができる。
2. ライゲーション
   1. 5分間ずつ二回洗浄バッファーAで体の壁を洗ってください。
   2. 1時間aのライゲーション溶液（連結緩衝液中でリガーゼの1：40希釈）でインキュベートT 37℃。この場合は、5〜10体の壁の適切な浸漬及び混合を確実にするためにリガーゼの5μL、5ライゲーション緩衝液40μlの高純度水を155μlのを使用しています。
3. 増幅
   1. 2分間ずつ二回洗浄バッファーAで体の壁を洗ってください。
   2. 37℃で2時間、増幅溶液（増幅緩衝液中のポリメラーゼの1:80希釈）と共にインキュベートする。この場合は、5〜10体の壁の適切な浸漬及び混合を確実にするためにポリメラーゼ2.5μlの、5増幅緩衝液40μlの高純度水の157.5μLを使用しています。
4. イメージングのための準備
   1. 10分間ずつ二回洗浄緩衝液Bで体の壁を洗ってください。
   2. 1分間に一度0.01X洗浄緩衝液Bで洗浄する。
   3. 取り付けの前に少なくとも30分間取付溶液数滴で平衡化、または4℃で一晩保存する。
   4. 微細なピンセットを使用して、慎重にプラットフォームスライドワットに体壁を転送するi番目の彼らのキューティクルを下に向けて。行と封入の低下や2内の同じ向きで体壁を配置します。その後明確なマニキュア液でスライドをシール、気泡を発生させないように注意しながら準備を介して22ミリメートル×40 mmのカバースリップを置きます。
   5. 共焦点イメージングのための準備ができるまで-20℃の暗所でスライドを保管してください。

結果

野生型の第3齢幼虫のNMJでは、Dlgというは、主にタイプが終末であるよりは、Dlg免疫反応性レベルはIb型終末においてより顕著であることで、I型グルタミン酸作動性神経繊維末端のシナプス後膜で発見された（ 図^3A）4。 HTSが筋肉全体で存在するが、両方のI型繊維末端に等しい登場フーバー免疫反応性レベルのシナプス後の領域に集中し、また、（ 図3A '）シナプス前発見された^8,17。は、Dlgとフーバーの分布が大きくシナプス後領域（ 図3A ^''）8で重複することに注意してください。

は、DlgとフーバーはNMJでの複合体中に存在するかどうかを判断するには、PLAは2つのタンパク質間の幼虫の体壁筋標本で実施した。このアッセイでは、N末端およびウサギ抗HTSM抗体で第2のPDZドメインを検出するマウス抗Dlgという抗体これはC末端のMARCKS相同ドメイン^15,16を用いた検出。野生型では、は、Dl...

ディスカッション

このレポートは、PLAは、ショウジョウバエの幼虫NMJに適用する方法を示しています。アッセイは、NMJで存在する内因性のタンパク質 - タンパク質相互作用を検出するため幼虫体壁筋調製物に対して行われる。この技術では、は、Dlgおよびフーバーは、互いに近接しているため、特にシナプス後領域²⁷において、複合体中に存在することが示されている。この結果を支持して、以前の研究では、次のデータとの関連付けの証拠を提供した：1）は、Dlgとフーバーの免疫反応性の分布が幼虫のNMJのシナプス後領域において重複し、2）は、Dlgとフーバーは共同に基づいて複合体を形成する免疫沈降大人になってからフライ溶解物を含む実験、および3）は、Dlgとフーバーは、上皮細胞とシナプス接合部⁸の両方で相互作用。シナプス後領域におけるPLA信号も一層クレーデを提供し、は、Dlgおよびパック、以前に他の研究において同定相互作用の間で観察されたNMJ ^15,20,21でこのアッセイを使用してのNCEの。興味深いことに、朴とWgの間のPLAは、その免疫反応性の分布がNMJで重なっていても、観察可能...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
鉗子(細かい#5)	アルメディック	A10-704
シルガードディスク	ワールド精密機器	SYLG184	エラストマーベースと硬化剤を10:1の比率で混合します。30分に設定します。型に注ぎます(例:12ウェル細胞培養プレートを使用)。少なくとも24時間硬化させてください。解剖するときは、60 x 15 mmのシャーレの蓋に接着します。
微細ピン (0.0125 先端径)	ファインサイエンスツール	26002-10
マイクロダイセクションハサミ (超微細)	ファインサイエンスツール	15200-00
プラットフォームスライド			2 つの 22 x 22 mm2 カバースリップを透明なマニキュアで顕微鏡スライドに接着し、<サンプルマウント用に20mmのギャップがあります。
w1118	Bloomington Drosophila Stock Center	3605
hts01103	Bloomington Drosophila Stock Center	10989	ストックはGFPバランサー上で再バランスされ、GFPシグナルの不在に基づいてホモ接合変異体を選択できるようになりました。
1x PBS(リン酸緩衝生理食塩水):3 mM NaH2PO4, 7 mM Na2HPO4, 130 mM NaCl、pH 7.0			NaH2PO4 (Caledon Laboratories - 8180-1)、Na2HPO4 (Caledon - 8120-1)、NaCl (Caledon - 7560-1)
Bouin's Solution	Sigma-Aldrich	HT10132
4% PFA (パラホルムアルデヒド): 1x PBS			中の 4% PFAPFA(アナケミアサイエンス - 66194-300)。解決策の作り方については、doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006を参照してください。
[header]
1x PBT(トリトンを含むリン酸緩衝生理食塩水):0.01%トリトン			トリトンX-100(シグマアルドリッチ-T8787)
1%BSA(ウシ血清アルブミン):1x PBT			のBSA(Bioshop Canada - ALB001)に1%BSA。4°Cで保管してください。
マウス抗DLG(ディスク大)	発達研究ハイブリドーマバンク	4F31	%BSAで1:10希釈で使用します。
ウサギ抗HtsM(Hu-li tai shao)			は、Lynn Cooley博士(イェール大学)によって提供されました。1% BSAで1:250の希釈度で使用してください。
rabbit anti-Pak (p21-activated kinase)			Nicholas Harden博士(サイモンフレーザー大学)より提供。1% BSAで1:500の希釈度で使用してください。
マウス抗Wg(翅なし)	Developmental Studies Hybridoma Bank	4D4	1%BSAで1:5希釈で使用します。
ヤギの抗HRP(西洋ワサビペルオキシダーゼ)	ジャクソン             ImmunoResearch	123-065-021	1%BSAで1:200の希釈度で使用してください。
FITC共役ロバ対ヤギ	ジャクソン            ImmunoResearch	705-095-003	1%BSAで1:200の希釈で使用します。
Duolink In Situ PLA プローブ 抗マウス MINUS	Sigma-Aldrich	DUO92004
Duolink In Situ PLA プローブ 抗ウサギ PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002
Duolink In Situ 検出試薬 Red	Sigma-Aldrich	DUO92008
1x Wash Buffer A: 0.01 Mトリス、0.15 M NaCl、0.05% Tween 20、pH 7.4	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories - 8980-1)、NaCl (Caledon - 7560-1)、Tween 20 (Fisher Scientific - BP337)
1x Wash Buffer B: 0.2 Mトリス、0.1 M NaCl、pH 7.5	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories - 8980-1)、NaCl (Caledon - 7560-1)
0.01x 洗浄バッファー B: 2 mM トリス、1 mM NaCl、pH 7.5	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories - 8980-1)、NaCl (Caledon - 7560-1)
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI	Sigma-Aldrich	DUO82040