Method Article

浮袋注入による幼虫ゼブラフィッシュにおける粘膜カンジダ症のモデル化

DOI:

10.3791/52182

⸱

November 27th, 2014

 ,  , 
1Department of Molecular and Biomedical Sciences, University of Maine, 2Graduate School of Biomedical Sciences and Engineering, University of Maine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

粘膜レベルでの病原体と免疫防御の生体内時空間相互作用は、既存の脊椎動物宿主では容易には画像化されません。ここで紹介する方法は、ゼブラフィッシュの幼魚の水泳膀胱を感染部位として使用して、生きた脊椎動物の粘膜カンジダ症を研究するための汎用性の高いプラットフォームを示しています。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

粘膜病原体に対する初期の防衛は上皮バリアと自然免疫細胞の両方で構成されています。両方の免疫適格、と彼らの相互通信は、感染症に対する保護のための最も重要である。病原体上皮および自然免疫細胞の相互作用は最高の複雑な挙動は、時間と空間に繰り広げられる、生体内 、 で調査されている。しかし、既存のモデルは、粘膜レベルでの病原体との戦いの容易な時空間的イメージングを可能にしない。

ここで開発されたモデルは、少年ゼブラフィッシュの浮袋に、真菌病原体、 カンジダ·アルビカンスの直接注射により粘膜感染が作成されます。得られた感染は、上皮および粘膜疾患の発生を通じて自然免疫細胞の挙動の高分解能イメージングを可能にする。この方法の汎用性は、pHをもたらす免疫イベントの詳細なシーケンスをプローブするホストの尋問が可能にagocyte動員および保護において、特定の細胞タイプおよび分子経路の役割を検討する。また、免疫攻撃の関数としての病原体の挙動は、蛍光タンパク質を発現するC.で同時に撮像することができるアルビカンス 。宿主 - 病原体相互作用の増大した空間分解能について迅速浮袋切開技術を用いても可能である。

ここで説明粘膜感染モデルは、粘膜カンジダ症の研究のための貴重なツール作り、簡単な再現性の高いです。このシステムはまた、マイコバクテリア、正常上皮表面を介して感染する細菌またはウイルス、微生物などの他の粘膜病原体に広く翻訳可能であってもよい。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

粘膜感染症は、上皮バリアの損傷により生命を脅かす血流感染症を引き起こす可能性があり、これにより病原体は全身環境にアクセスできるようになります1,2。さらに、粘膜感染症は、外部に含まれている場合でも重大な免疫病理を引き起こす可能性があります3〜5。共生性単細胞真菌Candida albicansは、口腔および他の粘膜部位6-9の人口の大部分に存在します。通常は自然免疫応答と適応免疫応答によって抑制されますが、自然免疫の欠陥と医学的介入は、重度の粘膜カンジダ症を引き起こす可能性があります。上皮バリアへの攻撃は、外陰膣カンジダ症の場合と同様に、生命を脅かす播種性疾患および免疫病理学のリスクの増加をもたらし、さらにC.アルビカンスのコロニー形成は肺免疫恒常性と関連しています10,11。播種性カンジダ症は、現在、集中治療室で4番目に多い血流感染症であり12、死亡率は40%と高く、大きな懸念事項となっています。自己免疫疾患、がん、臓器移植の患者に対する免疫調節治療の増加により、この病原体と粘膜免疫コンパートメントとの相互作用を理解することが不可欠です。

粘膜レベルでのC. albicans-細胞相互作用に関する細胞生物学的進歩の大部分は、in vitro13-15およびマウスモデル16-18から来ています。これらのアプローチにはそれぞれ異なる利点がありますが、無傷の宿主で生細胞を高解像度でイメージングする能力は、感染の時間的および空間的特性評価を制限しています。これらの研究では、病原体、自然免疫細胞、上皮細胞の相互作用を無傷の脊椎動物宿主で可視化できるin vivoモデルが必要です。

ゼブラフィッシュは、主にその透明性と遺伝子操作への適合性により、人間の病気を理解するための貴重なツールとして浮上しています。細胞と臓器の発達は精巧に詳細に画像化されており、それが、発生中の胸腺19におけるT細胞の挙動や、細胞内マイコバクテリアと食細胞との闘争20-22など、新しい免疫細胞の挙動の記述につながっている。最近の研究では、ゼブラフィッシュの腸内微生物と宿主の相互作用が記述されており、腸管の微生物のコロニー形成が宿主の腸の生理機能と他の感染に対する抵抗性に影響を与えることが示されています23,24。さらに、腸上皮を介した感染は、いくつかの病原体について報告されています。

腸管とは対照的に、水泳膀胱はより孤立した補完的な粘膜モデルを表しています。この器官は、発達中の腸管の延長であり、肝臓と膵臓の前方に形成されます25,26。それは界面活性剤、粘液および抗菌ペプチドを産生し27,28、解剖学的に、そして個体遺伝学的にも、この器官は哺乳類の肺29,30の相同体と考えられている。ゼブラフィッシュでは、空気圧ダクトが腸につながったままであるため、自然に浸漬感染が発生することができます。驚くべきことに、カンジダ種を持つ魚の自然発生感染として知られているのは、水泳膀胱におけるC.アルビカンス感染だけである31。私たちは最近、C. albicansが水泳膀胱に感染する実験的浸漬感染モデルについて説明し、この感染がC. albicans-上皮相互作用のin vitro32,33の特徴の一部を再現することを発見しました。

ここで紹介する方法では、受精後4日間のゼブラフィッシュ(dpf)の水泳膀胱にC.アルビカンスを直接注入することにより、元の浸漬感染モデルが改善されます。これにより、感染の正確な時間制御と再現性の高い接種が可能になります。これにより、ゼブラフィッシュモデルの汎用性と相まって、詳細な生体内イメージングが可能になります。この方法で何ができるかの例として、感染部位への好中球の動員とともに、C.アルビカンスの成長の時空間ダイナミクスを示します。ゼブラフィッシュの膀胱組織は生体内で画像化するのが難しいため、蛍光シグナルと顕微鏡分解能を向上させる迅速な水泳膀胱解剖技術も紹介します。これらの方法は、真菌、免疫学、および水産養殖研究のツールボックスを拡張するだけでなく、粘膜表面の他の真菌、細菌、またはウイルス感染をモデル化するために変換できる可能性のある新しい感染経路を記述します。

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注：すべてのゼブラフィッシュケアプロトコルおよび実験は施設内動物管理使用委員会（IACUC）プロトコルA2012-11-03下のNIHガイドラインに従って行った。

4日後に受精1.ゼブラフィッシュ飼育

  1. 別の映像34に示すように、最初の3時間後に受精内、ABゼブラフィッシュ、または任意の他のトランスジェニック系統を収集する。
  2. （; 0.17ミリモルのKCl、0.33のCaCl 2、0.33のMgCl 2、2mMのHEPES、pH6.8の5 mMのNaCl）をメチレンブルー（0.3 / mlの最終E3培地150 mlを含む15センチメートルペトリ皿に120の卵をインキュベート12/12の明/暗光周期で33℃のインキュベーター中の濃度）。
  3. E3 + PTU（1-フェニル-2-チオ尿素、10μg/ mlの最終濃度）と6時間後にメディアを交換して、死んだ卵を取り除く。
  4. 2日後に新鮮なE3 + PTUと交換媒体、33℃で4日間インキュベートする。

2.でjectionマイクロニードルの準備

  1. 次の設定で針プラーを使用したマイクロニードルに（110時間550ヒート; 0プル; 130ベロシティ）;（ID 0.69ミリメートル外径1.2ミリメートル）ホウケイ酸キャピラリーを引き出します。
    NOTE：設定は、同様の形状のマイクロニードルを得るために、フィラメントからフィラメントに変化するであろう（ 図1参照）、新たなフィラメントがインストールされるたびに再調整する必要がある。
  2. 0.4μmのフィルタリン酸緩衝生理食塩水の3μlのマイクロニードルを埋める（; 137のNaCl、2.7のKCl; 10のNa 2 HPO 4; PBS 1.8 mMのKH 2 PO 4; pH7.4）を20μlのmicroloaderピペットを用いて、先端。
  3. 高圧噴射システムに接続されているマイクロマニピュレータにマイクロピペットホルダー上のマイクロニードルを設定します。 30 PSIへの射出圧力と30ミリ秒のパルス持続時間を設定します。
  4. 針の1/5が水になるまで蒸留水でペトリ皿を使用して、マイクロニードルを下げる。マイクロニードルのWiクリップちょうど水位以下に目細かいピンセット。水の中からマイクロニードルを持参し、ボーラスが表示されるまで、ペダルを数回押してください。
  5. タイプの一滴浸漬油でレイヤード血球計数器上のマイクロニードルを下げてボーラスの直径を測定します。所望の容積を得るために、パルス持続時間を調整する（ 表1参照）。
  6. 油で安定した状態を保つ（ボーラスは体積が増加した場合、圧力を下げ、ボーラスボリュームが減少した場合背圧を増やす）するボーラスのための背圧を設定します。各マイクロニードルのためのパルス持続時間を記録します。
  7. microloaderピペットチップを使用してそれを吸引することによって、微小針からPBSを削除し、インジェクタに戻ってそれを配置し、連続パルススイッチを切り替えることで、左オーバーPBSを追放。各マイクロニードルを予約。

3. カンジダ準備

  1. コドン最適化dTomato、GFP、BFP、EOSや極東で形質転換ストリークカンジダ·アルビカンス酵母peptineデキストロース（YPD）寒天プレート（10g / Lの酵母エキスが20g / Lペプトン、20グラム/ Lのデキストロースに滅菌木製のダボを用いて凍結ストック（25％グリセロール中で-80℃のストック）から赤、が20g / L寒天;オートクレーブし、ペトリ皿中を25ml注ぎ）、30℃で一晩インキュベートする。
  2. 滅菌木製のダボを用いてつのコロニーを選択し、YPD液体（10g / Lの酵母エキスが20g / Lペプトン、20グラム/ Lのデキストロース、オートクレーブし、無菌的に16×150mmのガラス培養において5mlのアリコートを5 mlに植菌管）。
  3. 60rpmでローラードラムで30℃で一晩インキュベートする。
  4. Cの 1ミリリットルを収集1.7ミリリットル滅菌遠心管にアルビカンス文化と転送。
  5. 秒のカップルのための5000×gで遠心分離する。上清を空にし、徹底的に滅菌PBS、渦の1ミリリットルを追加します。これを2回繰り返します。
  6. 滅菌PBS 1,000：1ミリリットル株式1に希釈することにより、血球計数器を使用してコロニーを数える。

4にゼブラフィッシュを注入する浮袋

  1. 33℃のインキュベーター中で30分間注入皿（2％アガロース）を温める。
  2. 所望の時間に、すべてのゼブラフィッシュを吸引することなく、25ミリリットルピペットを用いて注入するために、魚を含む15センチメートルペトリ皿からE3 + PTUの150ミリリットルの100を削除します。
  3. （最終濃度は200μg/ ml）を、残りの50ml培地に4 mg / mlの緩衝化トリカインメタンスルホン酸塩ストック（TR）2 mlを加えることにより、ゼブラフィッシュのdpf 4を麻酔し、15分間待つ。
  4. 解剖顕微鏡下では、膨張した浮袋で魚を選択します。魚はまた、MPOにおける好中球分布として、均質な表現型のために、その時点でスクリーニングすることができる：解剖顕微鏡落射蛍光を用いて、GFPライン 。
  5. C.を希釈PBS中1ml当たり形成単位1.5×10 7コロニー（CFU / ml）を基準にした元濃度（ ステップ3.8）からアルビカンス株式を。
  6. プラスチック製の移送管を用いて射出皿30ゼブラフィッシュを転送するTTEとは余分なメディアを取り出します。
  7. 釣りワイヤツールを使用すると、（0.012インチ径釣り糸ホウケイ酸キャピラリー内にスーパー接着）、垂直方向に注入ディッシュを保持し、垂直方向に魚を方向付けることで、10匹の魚の3行を作る。
  8. 余分なメディアを取り出します。
  9. 徹底的に1.5×10 7 CFU / mlのCでチューブをボルテックスアルビカンス 。
  10. Cの 3μlの1のマイクロニードルを埋めるアルビカンスが新しいmicroloaderピペットチップを使用して、適切な設定にパルス持続時間を設定する（ ステップ2.9参照 ）。
  11. 浮袋（ 図3A）の背面に向かって目指して、マイクロニードルと魚の頭の間に20°の角度を作るために、注入の皿を回します。
  12. 針の穴がルーメン内にあることを確認しながら、浮袋にマイクロニードルを押し、一度ペダルを押してください。
  13. 各魚を繰り返し、E3で料理をあふれさせることで回復皿（25ミリリットルE3 + PTU）に移転Dリカバリー皿にそれを空に。
  14. 注射皿に別の30魚を転送します。
  15. 徹底的にC.ボルテックスで満たされた新しいマイクロ針で繰り返し注射アルビカンス 。
  16. 必要に応じて、汚染を避けるため、別の回復皿（ ステップ4.10）に転送するために異なる注入の皿を使用して、PBS対照を注入して終了。

5.目的の接種のために魚のスクリーニング

  1. 溶解するまでマイクロ波処理し、37℃に冷却し、沸騰、E3 40mlのアガロース低溶融物160mgを加えることにより、0.4％低融点アガロース溶液（LMA）を40mlを準備する。一旦冷却TR（最終濃度200μg/ ml）を400μlのを追加します。
  2. （25 mLのE3 + PTU、最終濃度を200μg/ mlのにTRの唯一の1ミリリットルを使用してステップ4.3）に記載されているようで30分の回復後、魚を麻酔し。
  3. 体重ボートでLMAの2ミリリットルに転送（できるだけメディアとの）30魚。
  4. トランスファーピペットで吸引し、個々の魚とのみ10×6中央井戸を使用して、96ウェルイメージングプレートにLMAの1滴の魚プレート。
  5. 画面にすべての魚は、イメージングプレートにロードされるまで繰り返します。
  6. 媒体を5分間室温で固化しましょう​​。
  7. 彼らはガラスの底に接触していることを確認しながら、彼らの側に魚を置きます。
  8. 倒立落射蛍光/共焦点顕微鏡および適切なフィルターで20X対物レンズを用い、C.数を記録する各魚の浮袋でアルビカンス酵母細胞。
  9. 、浮袋で15-25酵母細胞魚（または所望の接種材料）を選択して安楽死させる非選択魚（E3におけるTRの800μgの/ mlで）によってE3 + PTU 50mlの深いペトリ皿に選択された魚を戻すイメージングプレート選択したウェルにE3の3滴を追加し、プラ​​スチック製のトランスファーピペットを用いて魚を吸引する。
  10. 所望の期間のために、33℃でインキュベートする。

6.魚ポストスクリーニングイメージング

  1. 所望の時間に、イメージに魚を含む深いペトリ皿からE3 + PTUメディアの50ミリリットルの25を削除します。
  2. （25ミリリットルE3 + PTU残り、最終濃度を200μg/ mlのにTRの唯一の1ミリリットルを使用してステップ4.3）に記載されているような魚を麻酔し。
  3. 適切96ウェルイメージングプレート及び位置に魚プレート（ - 5.7 5.3ステップ ）。
  4. 適切なレーザーおよび発光フィルターを使用して共焦点顕微鏡を走査して画像。微分干渉コントラスト（DIC）の下で4倍対物レンズを用いて魚に第1焦点と第2マイクロ秒/ピクセル速度および1024×600ピクセルのアスペクト比を有する走査モードで共焦点レーザーで20X対物レンズを用いて関心領域の画像を取得する。 3フレームのカルマン·フィルタモードを適用し、1μmのステップサイズでのZスタックを取得する。
  5. 50ミリリットルE3 + PTUまたはindividuaに深くシャーレに戻るリットルウェル（24ウェル培養皿を3ml E3 + PTU）と33℃でインキュベートする。

7.浮袋を解剖

  1. 高真空グリースで10ミリリットル注射器を埋める。
  2. 2％のLMA（アガロースE3の8ミリリットル中の低融点の160 mgのと歩調5.3）を準備します。
  3. 所望の時間に、魚（ ステップ5.2）を麻酔し。
  4. 転送10 E3 1mlの1.7 mlの遠心管に魚や遠心管に4 mg / mlのトリカイン（最終濃度800μg/ ml）を200μlを添加し、室温で15分間インキュベートすることによって安楽死させる。
  5. マイクロスライド（75×25ミリメートル、 図2）に1センチメートル離れて、広場に真空グリースの4滴を配置することにより、画像化スライドガラスを準備します。
  6. 広場の真ん中に2％のLMAの2滴を置きます。
  7. 解剖顕微鏡下で独立したスライドガラス上に1魚を置き、心臓が鼓動を停止していることを確認して、余分な水分を除去する。
    8. は左ピンセットで固定された位置に頭を維持し、右のピンセット（ 図4A）で、前腸を下に引っ張って浮袋を分析。
  8. 消化管からそれを分離し、左ピンセットで空気圧ダクトによる浮袋をピックアップし、それが固化する前に、2％のLMAの中心に配置します。
  9. イメージングスライドガラスの上にカバースリップ（18×18 mm）を置き、真空グリースなどLMA（ 図2）に触れるまで押し込みます。
  10. 切開の10分以内に画像がステップ6.4で説明したように。 手順を繰り返し7.7から7.11他の魚と。

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Results

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後部浮袋でマイクロインジェクション

ここに提示された実験方法はC.一貫した用量の注射を記載ゼブラフィッシュのDPF 4の浮袋でアルビカンス酵母細胞。イマージョンモデルと以前の研究は、Cに浮袋免疫応答を示唆しているアルビカンスは、哺乳類の粘膜カンジダ症32と同様である。ここでは、より多くの、簡単な再現性があり、迅速であり、変更された感染法を実証する。ゼブラフィッシュの数百を注入し、数時間以内にスクリーニングすることができる。

浮袋の正確で再現性の感染は、マイクロインジェクションによって臓器の後部領域を標的にすることによって達成される。浮袋への注射は、幼虫または胚ゼブラフィッシュ（ 例えば、静脈内または後脳心室）のために、他のほとんどのマイクロインジェクションルートよりも学ぶことは簡単です。注射の前に魚の準備がシミです浮袋は魚が古いように膨張される必要があることを除いて、他の注入部位の場合とLAR、。 33℃での養殖魚の約75％...

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Discussion

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浮袋のマイクロインジェクション疾患モデルの進歩と限界

ここで紹介するモデルは、Gratacap らに記載粘膜カンジダ症浸漬モデルの拡張である（2013）。それは、制御された感染時間、再現性の高い感染量、したがって、改善された効率の利点が追加されます。ここでは、非侵襲非常に詳細に感染動態の時間的なドキュメントだけでなく、より高解像度浮袋のex vivoイメージングを可能にする新しい方法を実証する。これらの手順は、Cの研究を促進すべきであるアルビカンスは、粘膜の免疫系の相互作用のダイナミクスを-innate。粘膜感染モデルの限られた数は、すべての消化管障害/感染24,43に限定されるものではゼブラフィッシュにおいて記載されている。ここに提示浮袋モデルが肺にいくつかの類似点を共有し、閉じ込められたサイトを提供しています臓器に感染部位を拡張洗い流されるべき病原体にはあまり可能性と、感染の。

これらの技術を習得する際に考慮しなければな...

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Disclosures

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著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

私たちは彼の研究室で撮影を行うことを可能にするためシトリンの魚のラインとビル·ジャックマン：著者は、寛大にαカテニンを提供するための博士ルトリン博士とトービンに感謝。著者は、資金源国立衛生研究所（助成5P20RR016463、8P20GM103423とR15AI094406）とUSDAを認める（プロジェクト＃ME0-H-1-00517-13）。この原稿は、メイン農林試験場公開番号3371として公開されている。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.7 mlチューブAxygenMCT-175-C
ディープシャーレフィッシャーサイエンティフィック89107-632
トランスファーピペットフィッシャーサイエンティフィック13-711-7M
酵母エキスVWR サイエンティフィック90000-726
ペプトンVWR サイエンティフィック90000-264
デキストロースフィッシャーサイエンティフィックD16-1
寒天VWR Scientific90000-760
ファインピンセット (Dumont Dumoxel #5)Fine Science Tools11251-30
木製ダボVWR Scientific10805-018
低溶融アガロースVWR Scientific12001-722
フレーミングブラウン マイクロピペットプーラーSutter InstrumentsP-97
ホウケイ酸キャピラリー サッターインスツルメンツBF120-69-10
MPPI-3 インジェクションシステムアプライドサイエンティフィックインスツルメンテーションMPPI-3
背圧ユニットアプライドサイエンティフィックインスツルメンテーションBPU
マイクロピペットホルダーキットアプライドサイエンティフィックインスツルメンテーションMPIP
フットスイッチアプライドサイエンティフィック計装FSW
マイクロマニピュレーターアプライド・サイエンティフィック・インスツルメンMM33
マグネティック・ベース アプライド・サイエンティフィック・インスツルマグネティック・ベース
トリカイン・メタン・スルホン酸ウエスタン・ケミカル社MS-222
解剖顕微鏡オリンパスSZ61 トップ SZX-ILLB2-100 ベース
共焦点顕微鏡オリンパスIX-81 FV-1000 レーザー走査型共焦点システム
20倍顕微鏡対物レンズオリンパスUPlanSApo 20x/0.75
ローラードラムニューブランズウィックサイエンティフィックTC-7
マイクロローダー ピペットチップエッペンドルフ930001007
ガラス製培養チューブ (16 x 150 mm)VWR Scientific60825-435
NaClVWR ScientificBDH4534-500GP
KClVWR ScientificBDH4532-500GP
MgSO4>VWR ScientificBDH0246-500GP
HEPES (コーニング)VWR ScientificBDH4520-500GP
子供用粘土 (Play-Doh)ハズブロ
CaCl2>フィッシャーサイエンティフィックC69-500
メチレンブルーVWR サイエンティフィックVW6276-0
PTUシグマP7629-10G
ペトリ皿ッシャーサイエンティフィFB0875712
血球計算盤 (ハウサーサイエンティフィック)VWRサイエンティフィック15170-172
タイプA浸漬油ブルーマーブル製品51935
遠心分離機エッペンドルフ5424
テックスジーニーVWRサイエンティフィック14216-184
ガロース(ロンザ)VWRサイエンティフィック12001-870
Na2HPO4フィッシャーサイエンティフィックS374-500
KH2PO4フィッシャーサイエンティフィックP285-500
釣りワイヤーStren
96ウェルイメージングプレート(Sensoplate)Greiner Bio-One655892
高真空グリース(ダウコーニング)VWRサイエンティフィック59344-055
マイクロスライド (25 x 75 mm)VWR Scientific48300-025
カバースリップ (18 x 18 mm)、No 1.5VWR Scientific48366-045
15 cm シャーレ (オリンパスプラスチック)ジェネシー サイエンティフィック32-106
グリセロール (EMD 化学薬品)VWR サイエンティフィックEMGX0185-5
24 ウェル培養ディッシュ (オリンパス樹脂)ジェネシー サイエンティフィック25-107
ウェイトボート(8.9 cm)VWR Scientific89106-766
テーション メンテーション フィック ボルア

References

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