リアルタイムPCRによるT細胞受容体切除サークル（TRECs）とK-削除換え切除サークル（KRECs）の同時定量

サマリー

ここでは、T細胞受容体切除サークル(TREC)とK-欠失組換え切除サークル(KRECs)の同時定量化の方法について説明します。TREC/KRECアッセイは、胸腺および骨髄出力のマーカーとして使用できます。

要約

T細胞受容体切除サークル(TREC)およびK-欠失組換え切除サークル(KRECs)は、T細胞およびB細胞受容体を生成する組換えプロセス中に形成される環状化されたDNA要素です。 TRECとKRECは複製できないため、細胞分裂のたびに希釈され、細胞内に残ります。 末梢血中のそれらの量は、胸腺および骨髄量の推定値と見なすことができます。定評があり、一般的に使用されているTRECアッセイとKRECアッセイの改良版を組み合わせることで、新たに産生されたTリンパ球とBリンパ球の両方を1回のアッセイで定量できるデュプレックス定量リアルタイムPCRを開発しました。TRECおよびKRECの数は、細菌プラスミドにクローニングしたTRECおよびKRECシグナルジョイントを、参照遺伝子として機能するT細胞受容体α定常遺伝子のフラグメントとともに連続希釈して調製した標準曲線を使用して取得します。結果は、TRECおよびKRECの数/ 10⁶細胞または血液1mlあたりとして報告されます。これらのDNA断片の定量は、小児と成人の両方における骨髄移植後の免疫再構成のモニタリング、免疫不全の特性評価の改善、または特定の免疫調節薬物活性の理解を深めるために有用であることが証明されています。

概要

T細胞受容体切除サークル（TRECs）とK-削除組換え切除サークル（KRECs）を導く、ゲノムDNAの再結合プロセスの間に、それぞれ、T細胞およびB細胞の割合で切除される小さな環状DNAエレメントであるT-およびB細胞受容体の高度に多様なレパートリーの形成。これらは、機能を有さないが、それらは安定であり、複製できないので、それらは、それぞれの細胞分裂後に希釈され、したがって、2つの娘細胞のいずれかでのみ持続する。したがって、末梢血におけるそのレベルは、胸腺および骨髄の出力の推定値として想定することができる。

TRECアッセイは、主として胸腺出力の程度を評価するために、過去15年間にわたって使用されてきたが、最初に開発された¹ KRECアッセイは、B細胞増殖および健康および疾患におけるB細胞の恒常性への寄与^、2を測定するごく最近骨mのマーカーとして提案されている出力を矢印^。3,4ここで、我々はTRECsとKRECs両方の同時定量化のために開発された方法について説明します^。4

この組み合わせ方法では、リアルタイムPCRによってDNAの定量に関連する変動はTRECs、KRECsおよびT細胞受容体α定数の断片を含むトリプル挿入プラスミドを希釈したユニークな標準曲線の使用（TCRAC）により除去される1：1比1遺伝子。これはTRECとKRECコピー数をより正確に評価することが可能となる。また、同じ反応における2つの標的の同時定量試薬コストを低減することができる。

提案TREC / KRECアッセイは、重症複合免疫不全^{（SCID）、4}共通変数免疫不全^、5自己免疫疾患^、6-8とHIV感染の小児や成人におけるT-の程度およびB細胞ネオ産生を測定するために役立ちます^図9また、ために使用することができる造血幹細胞移植^、10酵素補充^、11および抗ウイルス⁹または免疫調節療法後の免疫の回復を監視する^。6-8 SCID患者は、基礎となる遺伝的欠陥にもかかわらず、患者無ガンマグロブリン血症TRECアッセイを用いて認識されるため、最終的に、KREC定量を用いて同定することができる、TREC / KRECアッセイはまた、新生児スクリーニングプログラムにおいて免疫不全を検出するために用いることができる。この場合には^12、テストが濾紙上にブロットし、乾燥させ、血液の小さなスポットから抽出されたDNAに対して実施する必要があり、高感度かつ特異的でなければならない対象疾患、ならびに高度に再現可能で費用対効果。

テストでKREC定量の導入は、日常的にウィスコンシン州はintroducする最初になった2008年以来、米国（WI、MA、CA）の一部で行われている免疫不全のために新生児スクリーニングの性能を向上させる必要がありますその出生後のスクリーニングプログラムにおけるTRECsの電子分析^。13

プロトコル

注：倫理のステートメント：このプロトコルは、当施設のガイドラインに従って、Spedali Civiliディ·ブレシア

「トリプル挿入」プラスミドの作製

1. 適切な出発物質の選択および調製：
   1. 例えば、EDTAチューブに集め、若い健常人の末梢血のようなPCRによる検出可能なTRECsとKRECsを持っている可能性が非常に高い細胞を含む試料を取得します。
      注：当初、我々はKRECsために扁桃断片からTRECsおよび単核細胞のための胸腺細胞を用いる方法を開発したが、健康な被験者は通常TRECs PCRによりそれらの検出を可能にするのに十分なKRECsの量を持っている。したがって、末梢血を得るのはとで動作するように簡単に有効な代替、である必要があります。れていない場合TRECsは、特に、子どもたちから、若い成人から健康な成人年齢、末梢血に伴って減少することを考慮すると、お勧めします。
   2. 個別の末梢血mononucリア細胞（PBMC）は、標準的な密度勾配分離法による。
2. DNA抽出：
   1. 市販のDNAブラッドミニキットを使用してPBMCからDNAを抽出します。以下に示すいくつかの変更で、製造元の指示に従ってください。
      1. 1400 rpmでシェーカー·インキュベーターを用いて10分間70℃（代わりに56℃）でサンプルをインキュベートする。
      2. 70℃で5分間インキュベートし、製造業者の指示に従って遠心分離によってDNAを溶出し、カラムを70℃に加熱した溶出緩衝液を加える。 260/280 nmでの分光光度推定によって抽出されたDNA濃度を決定します。
3. TRECとKREC信号ジョイント（SJ）の挿入およびTCRAC参照遺伝子を含むプラスミドの調製
   1. TRECs、KRECsとTCRACに特異的なプライマーを用いた（TREC-SJ、KREC-SJ、およびTCRAC断片を得るために）PBMCから抽出したDNAを増幅した（ 表1を参照のこと）。
      注：5 '末端で、KREC-とTCRAC特異的プライマーは、（斜体で示される）追加のヌクレオチドに隣接する適切な数の（ 表1に示される配列において小文字で）をHindIIIおよびSpeI制限部位を含む。両方の機能は、標準的なKRECとTCRAC配列中に存在していない。

TRECs	フォワード	5'-AAA GAG GGC AGC CCT CTC CAA GGC-3 '
	リバース	5'-GGC TGA TCT TGT CTG ACA TTT GC-3 '
KRECs	フォワード	5'- CCC AAG CTT TCA GCG CCC ATT ACG TTT CT-3 '
	リバース	5'- CCC AAG CTT GTG AGG GAC ACG CAG CC-3 '
TCRAC	フォワード	5 'G交流タグTAT GAG ACC GTGのACTTGC CAG-3 '
	リバース	5 'G交流タグTGC TGT TGT TGA AGG CGT TTG C-3'

クローニング手順に使用される表1プライマー。イタリック体で追加のフランキングヌクレオチドを示しているのに対し、5 '末端で、小文字で、制限酵素部位に対応するヌクレオチドを示している。

3. 2. 1×バッファーIIからなる、25μlの最終容量でPCR反応を行い、1.5のMgCl _2、dNTPミックス（各200μM）、900nMの最終濃度のAmpliTaq DNAポリメラーゼ（2.5 U /25μlの）でプライマーとDNA 100ngの。
   3. 以下のPCRパラメータを使用して30秒間95℃の40サイクル、続いて10分間95℃での最初のステップ; 30秒間60℃、 30秒間72℃、10分間72℃で最終的に1サイクル。 PCR産物の長さは次のようになります。TRECsための380 bpの、Kのための166 bpののREC、TCRACための381 bpの。
   4. をpCR2.1-TOPOベクターのTA受容部位にTREC-SJのPCR産物を挿入します。細胞に提供されたプロトコル以下のヒートショックによりXL1ブルー化学的コンピテント細胞にプラスミドDNAを変換します。なぜならアンピシリン耐性の成長コロニーのうち、なぜなら失われたβガラクトシダーゼ相補性の白表示され、マスター皿にそれらを接種しますインサートを担持しているものを特定する。最後に、PCRによってTREC断片を含有するコ​​ロニーを同定。
   5. 識別されたコロニーの1を展開し、プラスミドミニプレップキットを用いてプラスミドDNAを精製し、製造元の指示に従ってください。 SpeI制限酵素を用いてプラスミドDNAとTCRAC増幅産物を消化し、SpeI制限部位にTCRAC断片を連結。
   6. XL1-blue細胞にプラスミドDNAをトランスフォームし、PCRによりTCRAC断片を含有するコ​​ロニーを同定。識別されたコロニーの1を展開し、浄化するプラスミドミニプレップキットを用いてプラスミドDNA。
   7. プラスミドDNAおよびHindIIIでKREC増幅産物を消化し、HindIII制限部位にKREC-SJの断片をクローニング。 XL1-blue細胞にプラスミドDNAをトランスフォームし、PCRにより第三の断片を含むコロニーを同定。
   8. 直接配列決定、3のインサートの存在と変異の不在によって、確認してください。最終トリプル挿入プラスミドのマップを図1に示されている。

図1.トリプル挿入プラスミドマップ。TREC、KREC、TCRAC配列及び制限酵素部位の位置を示すトリプル挿入プラスミドマップ。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

9. 同定されたコロニーのいずれかを拡張するプラスミドミディプレップキットを用いてプラスミドDNAを精製する。 260/280 nmでの分光光度推定によるプラスミドDNA濃度とゲル電気泳動によるDNAの品質を決定します。 -80℃でプラスミドの適切な分量を保存する（ 例えば 、50μLずつ）。

2.標準曲線の準備

注：特別なDNAキャリーオーバーの封じ込めのために設計された場所に0.1×TE緩衝液にすべての希釈液を調製する。

1. したがって、目的のプラスミドのコピー数の質量を計算する（ 表2参照）、プラスミドのサイズは4846塩基対であり、塩基当たりの平均質量は1.096×10 ^-21グラム/塩基対であることがあることを考慮し、そして：m個_のp（= 4846塩基対）×（1.096×10 ^-21グラム/ BP）= 5,311.216×10 ^-21グラム= 5.311×10 ^-18 gである。

コピー＃	X 5.311×10 -18 gの	プラスミドDNAの質量（g）
1×10 6		5.311×10 -12
1×10 5		5.311×10 -13
1×10 4		5.311×10 -14
1×10 3		5.311×10 -15
1×10 2		5.311×10 -16

各標準曲線希釈ポイントのために必要なプラスミドの表2.マス。

2. 各反応中にピペットするボリューム（5μl）をすることによって必要なプラスミドの質量を除することにより、プラスミドDNAの濃度を計算した（ 表3参照）。

プラスミドDNAの質量（g）	÷5μL	プラスミドDNAの最終濃度（グラム/μl）を
5.311×10 -12		1.062×10 -12
5.311×10 -13		1.062×10 -13
5.311×10 -14		1.062×10 -14
5.311×10 -15		1.062×10 -15
5.311×10 -16		1.062×10 -16

各希釈ポイントに必要なプラスミドの濃度が表3の計算。

3. プラスミドのアリコートを解凍する。 XhoIでプラスミドDNA2μgのを線形化し、その濃度bを決定する260/280 nmでのyの分光光度推定。
4. （ 例えば、100 ng /μLで= 0.1μgの/μL= 1×10 ^-7 G /μL）から開始すると便利ワーキングストック溶液を達成するために、線状化プラスミドDNAの適切な希釈を準備します。 -80℃で、線状化プラスミドDNAの残りを保管してください。
5. 1×10 ^-10グラム/μLのより有効な濃度でプラスミドを持って来るために100の希釈：1：10または1の便利な数を実行します。
6. 1.062×10 ^-12 gの対応する一連の最初の標準曲線の点の準備に必要な（1×10 ⁶コピー、 -希釈体積（V ₁ V _2）を算出し、式C ₁ V ₁ = C ₂ V _2を使用/ 5μL; 表4参照）。

初期の濃。 （G /μL）	プラスミドDNAの容量（μL）	DilueNT容量（μL）	最終巻。 （μL）	最終濃度。 （G /μL）	プラスミドDNAの最終的なコピー数/5μlの
C 1	V 1	V 2 -V 1	V 2	C 2
1×10 -7	5μL	45μL	50μL	1×10 -8	該当なし
1×10 -8	5μL	495μL	500μL	1×10 -10	該当なし
1×10 -10	5μL	465μL	470μL	1.062×10 -12	1×10 6
1.062×10 -12	50μL	450μL	500μL	1.062×10 -13	1×10 5
1.062×10 -13	50μL	450μL	500μL	1.062×10 -14	1×10 4
1.062×10 -14	50μL	450μL	500μL	1.062×10 -15	1×10 3
1.062×10 -15	50μL	450μL	500μL	1.062 X 10- 16	1×10 2

表4.希釈の計算。

7. 残りの標準曲線ポイントを得るために、1：10希釈液の定期的なシリーズに進みます。
   メモ：次を実行する前に、簡単に各プラスミドの希釈をボルテックスすることを忘れないでください。
   注：STの最高希釈プラスミドDNAのような少量の将来の使用のために保存するのに十分に安定ではないのでandard曲線（10コピー/5μl）を、単にアッセイを行う前に準備されなければならない。
8. 使用するまで別々のチューブに、-80℃でトリプルプラスミドの希釈ポイントを保存。希釈されたトリプルプラスミドDNAは、少なくとも6ヶ月間安定性が高い。

標的試料から3. DNA抽出

1. 密度勾配分離法を用いて、EDTAチューブに採取した末梢血から分離したPBMC。
   注：あるいは、他の適切な出発物質を使用し、ターゲット試料として（ 例えば、リンパ球亜集団、全血をソート）。
2. ステップ1.2で報告されているように標的サンプルのPBMCからDNAを抽出します。

TRECsとKRECsの定量4.リアルタイムPCR

1. プレートの準備とロード：
   1. 各サンプルについて、少なくとも2つの複製を含むPCRプレートを手配分析される：標準曲線（A→F 1→4）、陽性対照（CTRL ^+; G1→4）と無鋳型対照（NTC; H 1→4）。
      注： 表5に典型的なスキームを守ったが、異なるフォーマットを作成することができます。 TRECsとKRECsがTCRACのものとは異なる、同じウェル中で一緒に増幅されることを覚えておいてください。

	TRECs + KRECs A		TCRAC Bは		TRECs + KRECs		TCRAC		TRECs + KRECs		TCRAC
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A	10 6コピー	10 6コピー	10 6コピー	10 6コピー	1	1	1	1	9	9	9	9
B	10 5コピー	10 5コピー	10 5コピー	10 5コピー	2	2	2	2	10	10	10	10
℃	10 4コピー	10 4コピー	10 4コピー	10 4コピー	3	3	3	3	11	11	11	11
D	10 3コピー	10 3コピー	10 3コピー	10 3コピー	4	4	4	4	12	12	12	12
E	10 2コピー	10 2コピー	10 2コピー	10 2コピー	5	5	5		13	13	13	13
F	10コピー	10コピー	10コピー	10コピー	6	6	6	6	14	14	14	14
G	CTRL +	CTRL +	CTRL +	CTRL +	7	7	7	7	15	15	15	15
H	NTC	NTC	NTC	NTC	8	8	8	8	16	16	16	16

表5.サンプルのリアルタイムPCRプレート。

1. 2. （ 表6参照 ）、別々のチューブでTRECs / KRECsとTCRACためのマスターミックスを調製する-必要なウェルの合計数を計算する（可能なピペット操作誤差を考慮するために2つの余分のウェル1を含む）。
      NOTE：TRECs、KRECsとTCRACに特異的なプライマーおよびプローブを、表7に記載されたプライマーとプローブの最終濃度は、それぞれ、900および200nmである。

TRECs / KRECs		TCRAC
H 2 O	2μL	H 2 O	4.75μL
20ピコモル/μlのためのKRECs	1.125μlの	20ピコモル/μlのためのTCRAC	1.125μlの
KRECsは20ピコモル/μlのREV	1.125μlの	TCRACは20ピコモル/μlのREV	1.125μlの
KRECsプローブ10ピコモル/μL	0.5μL	TCRACプローブ10ピコモル/μL	0.5μL
20ピコモル/μlのためのTRECs	1.125μlの	2倍のTaqManユニバーサルPCRマスターミックス	12.5μL
TRECsは20ピコモル/μlのREV	1.125μlの
TRECsプローブ10ピコモル/μL	0.5μL
2倍のTaqManユニバーサルPCRマスターミックス	12.5μL

示された井戸のために必要な試薬の表6巻。

TRECs	フォワード	5'-CAC ATC CCTのTTCのAAC CAT GCT-3 '
	リバース	5'-TGC AGG TGC CTA TGC ATC A-3 '
	プローブ	5'-FAM-ACA CCT CTG GTT TTT GTA AAG GTG CCC ACT-TAMRA-3 '
KRECs	フォワード	5'-TCC CTT AGT GGC ATT ATT TGTのATC ACT-3
	リバース	5'-AGG AGC CAG CTC TTA CCCタグのAGT-3 '
	プローブ	5'-HEX-TCT GCA CGG GCA GCA GGT TGG-TAMRA-3
TCRAC	フォワード	5'-TGG CCT AAC CCT GAT CCT CTT-3 '
	リバース	5'-GGA TTT AGA GTC TCT CAG CTG GTA CAC-3
	プローブ	5'-FAM-TCC CAC AGA TAT CCA GAA CCC TGA CCC-TAMRA-3 '

リアルタイムのPCのためのプライマーおよびプローブの配列を表7Rアッセイ。

1. 3. 各ミックス20μlの（TRECs / KRECsとTCRAC）を追加します。試薬調製室を出る前に、光学接着剤カバーとの反応プレートをシール。
   4. 核酸抽出室では、接着剤、カバーを持ち上げて、ゲノムDNA試料5μlを加える - ウェルに（400〜500 ngのを）。 CTRL ⁺ウェルにゲノムDNAの5μL（PBMCから調製すなわち、臍帯血から得た）を追加します。
      NOTE：臍帯血の代わりに、試料の同じ既知の陽性末梢血試料またはプールからのDNAを使用し、またはTREC-からのゲノムDNAと三重挿入プラスミドの所定量を混合することによって、「人工」正標準を準備とKREC陰性細胞株。
   5. NTCウェルに水5μlを添加する。光学接着剤カバーで再び反応プレートをシール。
   6. プラスミドDNAのキャリーオーバーの封じ込めを確保する場所に移動します。各希釈POINを解凍のみ使用前にプラスミドDNA標準曲線のtと最も高い希釈液を調製（10コピー/ 5μL）。のみ→Hの1→4ウェルからの接着剤のカバーを持ち上げ、プラスミドDNA標準曲線の各点希釈の5μlを添加する。再び接着剤カバーをシール。
   7. このような試薬は、底部に配置されることを確実に、ウェルの底に気泡が存在しないことを確認する。
   8. リアルタイムPCRシステム上で検定を実行します。標準プロトコルは、2分、15秒、95℃での変性を45サイクル、続いて10分間95℃での初期加熱、及び複合プライマー/プローブのアニーリングと伸長を50℃での最初のステップで構成され1分間60℃である。
   9. PCRプログラムの終了後にデータを保存します。
      注：リアルタイムPCRアッセイのセットアップ時に、定量的PCRのための通常の優れた研究室のプラクティスの推奨事項に従うこと：覚えて、DNAの交差汚染を避けるために核酸抽出用の独立したエリア/ルームを使用して、試薬調製、プラスミド操作、増幅反応。別々のピペットセットを使用します。適切な手袋/コートを変更します。
2. 結果と計算：
   注：以下の手順は、 マテリアルの表に記載されたリアルタイムPCR装置に付属のソフトウェアを使用して、私たちの経験に基づいているが、一般的に、彼らは他のリアルタイムPCR分析プラットフォームとソフトウェアに適用されるべきである。でも、同じソフトウェアを使用している場合、通常は必要なコマンド（ 例えば、アイコン、ショートカット）を実行するための複数の方法がある、ということを覚えておいてください。
   1. ソフトウェアに保存された結果ファイルを開いて、「結果」タブをクリックします。ウィンドウの上部には、「分析」メニューをクリックし、「分析の設定」を選択します。ソフトウェアは「すべて」検出器および「自動CT」（CT =閾値サイクルを選択することで、自動的にしきい値を決定してみましょう。「自動ベースライン」に設定し、ソフトウェアをしましょう。デフォルトでは、バックグラウンドの除去のために。
   2. 「増幅プロット」というタブをクリックし、ウィンドウの右端の部分に、対応するドロップダウンメニューで3「検出器」のいずれかを選択します（ 例えば、TRECsで始まる）。すぐ下、手動でしきい値を設定する「手動のCt」を選択します。ウィンドウの下部に移動し、増幅プロットを表示するために選ばれた検出器の標準曲線希釈点に対応するウェルを選択。これを行うにはクリックするだけで、テーブルの対応するセルの上にマウスをドラッグします。
      1. 、手動でしきい値を調整上下赤の閾値ラインをドラッグして、その結果を再分析するために、「分析」をクリックします。しきい値を設定すると、結果をどのように影響するかを確認するには、「レポート」タブを選択し、それぞれの標準曲線希釈点の結果としてのCtを参照してください。しきい値を移動する場合は、最適な配置を取得するには、次の推奨事項を遵守することを試みる。
      2. 「増幅プロット」タブに戻って、しきい値が十分にバックグラウンドノイズを超えるがプラトー期下の指数関数的増幅の領域にあることを確認してください。増幅プロットは、対数スケールで示されていない場合は、「グラフ設定」をリコールし、「ログ」としてポストランY軸の設定を設定するには、プロットを右クリックして、の直線部分でしきい値中間に設定プロット、および観察増幅曲線は、互いにほぼ平行である。
      3. Ctの結果を見て、「レポート」タブをクリックします。しきい値の配置は、各標準曲線希釈点の2つの複製の精度を最大化する結果をもたらしていることを確認してください。
      4. 閾値は最も標準曲線希釈ポイント（最適な感度）の大きさの極端なオーダーを反映している点に配置されていることを確認してください。残りの二つの検出器（KRECsとTを繰り返しステップ4.2.2と残りのサブステップCRAC）。
      5. 、[レポート]タブに移動しますすべての検出のための標準曲線（TRECs、KRECs、TCRAC）のウェルに対応するセルを選択するために、ウィンドウの下部に表に再びマウスをドラッグします。 3つのターゲットの結果Ctが同じ希釈点で非常に類似していることを確認します（ 例えば、差が0.5以下CT）。必要に応じてしきい値を再調整し、再確認してください。
         NOTE：トリプル挿入プラスミドは、各ターゲットの単一のコピーが含まれているため、増幅率は、理論的に1に近くなければならないので：1：1。場合によっては、手動でより良い結果を得るために1つ以上の検出器のためのベースラインを調整する必要があるかもしれない。ちょうどその時「手動ベースライン」を設定し、調整が必要とされる検出器を選択して、開始と終了サイクル（通常3〜15）にカスタム値を挿入して、「分析設定」ウィンドウを思い出す。その後、「OK＆再分析」をクリックして、前のポイントを再確認。
   3. のみ以下を確認した後に実験的なセッションを受け入れます。
      1. 「レポート」タブをクリックし、ウィンドウの下部に移動し、NTCウェルを選択し、対応するCtは「Undet」であることを確認してください（ すなわち、増幅はNTCウェルの中に存在しない）。
      2. 「標準曲線」タブを選択し、プロットウィンドウの右側に見る。ドロップダウンメニューから選択して検出器とは、報告された標準曲線の傾きは-3.55と-3.32の間の範囲であるかどうか（91の効率をPCRに対応する - 100％）を参照してください
      3. 決定（R ^2）の係数は（各検出器を選択した後に、同じ「標準曲線」タブで）右傾きと切片の下にその値を読み取ることで、0.998（ 図2）よりも高いことを確認してください。
         注：彼らのずれがより簡単に傾きに影響を与える可能性があるため（それらが高い」のleveを持っている極端な希釈点に注意してください回帰直線上の怒り」効果）。具体的には、最も高いプラスミド希釈が予想よりも早く低下する可能性があることに注意してください。しかし、可能な限り合理的なアプローチは、定量的検出の限界として100を検討することであってもよいので、それは、それらを破棄しないように便利です。言い換えれば、10〜100のサンプルに対して、結果は<100または「陽性と報告されることがありしかし、定量化できない」、カーブの範囲（<10）の外には、0またはとして報告されることがあればしながら、「 "検出できない。
         注：将来の実験のために最適な「参照」範囲または内部品質検査の一種として保持される各希釈点の平均値を計算するために、以前の標準曲線希釈物のCt値のアーカイブを維持するのに有用であり得る（ 例えば、シューハート管理図を構築するために、平均およびSDを計算する）。同様に、それは、陽性対照の過去のCtのアーカイブを維持するために有用であり得る。


TRECs、KRECs、およびTCRAC図2.標準曲線。標準曲線の点のプロットと対数回帰直線がTRECs（A）のために推定し、KRECs（B）、及びTCRAC（C）は、理想的な指数関数の遵守を確認するために構築されている100％の効率に相当する増幅率（傾き= 3.32）。 Ctは：閾値サイクル。 R ^2：決定の回帰係数この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

2. 3. 4. 「レポート」タブをクリックし、（グラフ下の表の対応するセルにあります）陽性対照のCtがSA上で、前のアッセイの結果と一致していることを確認してください私はポジティブコントロールを知られています。
         注：「レポート」タブがTRECs、KRECsとサンプルのTCRACの量を示しているが、ソフトウェアが適切に設定されたしきい値とベースライン後に得られたCt値を使用して、それぞれの標準曲線から補間により計算したことをテストされている（A新しいしきい値/ベースラインとの新たな分析）は、これらの結果を変更します。補間は標準曲線に行われる場所は、「標準曲線」タブを選択し、希望するウェルを選択し、回帰直線上に現れる黒い "X"を探します。それらのy軸の値は補間量である。常に同じ陽性対照を使用する場合、適切な基準範囲および/または品質管理図は、陽性対照で決定以前の値に基づいて、構築することができる。
   4. TEにすべてのウェルの量をエクスポートする.csvファイルに、「ファイル」メニューをクリックし、「保存」を選択し、「エクスポート」カンマ区切り値を含むXTファイル。
   5. 10 ⁶ xは[（TRECsまたはKRECsの量を意味する）/（TCRAC / 2の量を意味する）]：表計算ソフトでthe.csvファイルと適切に以下の式を設定することにより、10 ⁶ PBMCあたりTRECsまたはKRECsの数を計算インポート
      注：各セルに2 TCRAC遺伝子コピー、 例えば、各染色体について一つが存在するためTCRACの平均量を2で割る。
      注：ポジティブコントロールのTRECsとKRECsの最終的な数の一貫性がみなすことができるが、値が完全ので、標準曲線希釈ポイントの追加可変性の一致しないことに留意してください。総発散の場合には、実験が繰り返される必要があり得る。再度、管理図は、適切な基準範囲を設定するために構築されてもよい。
   6. 完全な血球数の結果が利用可能な場合は、次の式を用いて血液の1mlあたりTRECsまたはKRECsを計算する（オプションですが、推奨）：
      TRECsまたは1×10 ^6）×（リンパ球+単球あたりKRECsは、血液の1ミリリットル）/ 10 ⁶ =のコピー/ mlでカウントされます。

結果

24 45歳の成人 - 60（男性/メス：16分の29）： - 17（17分の25オス/メス）42 0歳の子供：アッセイは、87健常対照の代表的なサンプルで実施した。結果は、10 ⁶ PBMCあたりTRECsとKRECsとして得られたし、その後の血液1mlあたりTRECsとKRECsを算出した。

4年- TRECsの数は、0から3の非常にシャープなファッションに特に胸腺退縮^、4に年齢とともに減少します。それは、女性よりも男性においてより急速に減少するので、成人では、TREC番号は、性別に依存する^。5これは非常に正確な場合には、年齢、おそらく性別に基づいて区別されるべき適切な基準範囲を設定することで問題を作成すること正規性の推定が必要である。

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ディスカッション

TREC および KREC の定量化は、いくつかの注意点が考慮されていれば、最近の胸腺および骨髄の出力の適切な推定値と見なすことができます。標準曲線を使用した絶対定量法では、リアルタイムPCR反応プレート上により多くの試薬とより多くのスペースが必要ですが、既知の量の出発物質に基づいて構築された標準曲線から未知のサンプル量が補間されるため、非常に正確な定量結果が保証されます。さらに、この方法は、少量のターゲットを検出するのに適しています。方法論的観点からは、標準曲線点に対応する凍結プラスミド希釈液が予想よりも早く分解される可能性があることが重要な点です。これには、各実験手順の前に、最初に保存されたプラスミドからの新しい希釈液、特に最も希薄なものを調製する必要があります。最終的な計算では、PBMC 量の推定値としてのリンパ球と単球数の間の不完全な等価性により、10⁶ あたりに表される値と血液 ml あたりに表される値との間の変換にいくらかのバイアスが追加される可能性があります。全血から直接抽出された既知の量のDNAから2つのターゲット(TRECとKREC)の量を決定するための改善を行うことができ、単球とリンパ球数の必要...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Histopaque-1077	Sigma Aldrich SRL	10771-500 ML	密度勾配分離法
QIAamp DNA 血液ミニキット (250)	QIAGEN	51106	DNA 抽出
未修飾 DNA オリゴヌクレオチド HPSF 0.01 mmol	Eurofins MWG Operon/Carlo Erba 試薬 S.r.l		凍結乾燥製品を100 pmol/µに再懸濁します。l
AmpliTaq DNA ポリメラーゼ:10x Buffer II および 25 mM MgCl2		N8080156
GeneAmp dNTP Blend (100 mM)	を含む Applied Biosystems/Life-Technologies	N8080261
TOPO TA Cloning Kit for Subcloning	Invitrogen/Life-Technologies	K4500-01
XL1-Blue Subcloning Grade Competent Cells	Stratagene	200130
PureYield Plasmid Miniprep System	Promega	A1223
SpeI 500U	New England Biolabs	R0133S
HindIII-HF 10,000 U	New England Biolabs	R3104S
PureYield Plasmid Midiprep System	Promega	A2492
XhoI 5,000 U	New England Biolabs	R0146S
TRIS Utrapure	Sigma Aldrich SRL	T1503
EDTA	Sigma Aldrich SRL	E5134
TE buffer (1 mM TRIS and 0.1 mM EDTA)
TaqMan Universal PCR Master Mix	Applied Biosystems/Life-Technologies	4364338
Dual labeled probes HPLC 0.01 mmol	Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l		凍結乾燥製品を100 pmol/µに再懸濁します。l
NanoDrop 2000c 分光光度計	サーモフィッシャー
アプライド バイオシステムズ 2720 サーマルサイクラー	アプライド バイオシステム/ライフテクノロジー	4359659
ファスト 7500 リアルタイム PCR システム	アプライド バイオシステムズ/ライフテクノロジー
ズ SDS 配列検出ソフトウェア 1.4	アプライド バイオシステムズ/ライフテクノロジー