円窓膜を介してマウスインナーイヤーにウイルスにより媒介遺伝子送達のための手術方法

サマリー

説明されている耳介後の外科的アプローチは、失血と動物の死亡率を最小限に抑えながら、マウスの蝸牛スカラティンパニへの迅速かつ直接的な送達を可能にします。この方法は、丸い窓の膜を介して出生後のマウスに分子、薬理、およびウイルスを送達する蝸牛療法に使用できます。

要約

感音難聴からの機能的回復を達成するために使用される遺伝子治療は、難聴に寄与する根本的な分子的および遺伝的メカニズムのより良い理解を与えることを約束する。内耳へのベクターの導入は、既存の構造への損傷を最小限に抑えながら、広く蝸牛全体にエージェントを配布する方法で行われなければならない。この原稿は、分子、薬理学的、およびマウス生後10日目と丸い窓膜（RWM）を介して、古いのウイルス送達を用いてマウス蝸牛治療に用いることができる後の耳介の外科的アプローチについて説明します。血液の損失を最小化し、動物の死亡を回避しながら、この外科的アプローチは、鼓室階への迅速かつ直接の受け渡しが可能になります。完全に聴力を維持しながら、この手法は、無視できるか、インナーと中耳の本質的な構造への損傷だけでなく、首の筋肉を伴う。この手術法、水疱glutamの有効性を実証するために、食べトランスポーター3ノックアウト（VGLUT3 KO）マウスは、アデノ随伴ウイルス（AAV-1）を使用して内耳にVGLUT3の送達後に聴力回復先天性難聴のマウスモデルの例として使用される。

概要

遺伝子治療は、長い遺伝性難聴のための潜在的治療法として提案されているが、この分野での成功は^、1とらえどころのないままである。現在までに、ウイルス媒介性の方法論は、比較的アクセス蝸牛内の特定の細胞型を標的とする理論的能力により優勢いる。アデノウイルス（AV）、アデノ随伴ウイルス（AAV）の両方が蝸牛遺伝子送達のために使用されている。のAAVは、多くの理由のために蝸牛で有利である。彼らは、複製欠損ウイルスであると効率的にニューロン、難聴の原因の数の重要な標的を含む、異なる種類の細胞に遺伝子導入する分子を転送することができます。細胞へのAAVのエントリは、特定の受容体²によって媒介される。このように、特定の血清型の選択は、形質導入される細胞型に適合しなければならない。のAAVは、効率的に有毛細胞^3をトランスフェクトし、トラヒックの安定した長期発現をもたらす、宿主ゲノムに組み込むことができnsgenicタンパク質や細胞⁴における表現型の変化。毛髪細胞再生短期用途には必ずしも有利ではないが、長期発現は、遺伝的欠陥を安定救助のために非常に重要である。 AAVは、任意のヒト疾患または感染に関連しない耳毒性^5,6,7を示さないれていないので、彼らは損失^8聴力の遺伝型の遺伝子治療に使用するための理想的な候補である。

ウイルスベクターを用いて哺乳動物の内耳への外因性遺伝物質の移動は、過去10年間研究されており、損失^9聴力の遺伝的および後天両方の形態を治療するための有望な技術として浮上している。蝸牛は、潜在的にいくつかの理由のために、遺伝子治療のための理想的な標的である：1）その小さな容積は、必要なウイルスの限定された量を必要とする。他の器官系の制限副作用2）の相対的な単離; 3）その流体充填チャンバは、ウイルスを容易にする迷路^{10、11,12,13,14、15}を通じて配信。

先天性難聴のマウスモデルは、系統的、複製可能な方法で、内耳の開発を監視するための研究の多くの方法の使用を可能にする。マウス蝸牛の小さいサイズは、いくつかの外科的困難を提示しませんが、マウスが他の種¹⁶に比べていくつかの実験的な利点で、遺伝性難聴の研究に極めて重要なモデルとなる。マウスモデルは、遺伝的連鎖解析、詳細な形態学的観察の収集、および病原性のシナリオをシミュレートを通して特性の範囲の評価を可能にする。のような、それらがウイルス媒介遺伝子治療のための良好な候補である。技術の進歩と組み合わせたマウスでの広範な遺伝学的研究は研究室^{17,18、19、20,21}全体で再現可能な方法で、遺伝子改変されたマウスを作製することが可能になりました。 Furthermor両方を取得し、この動物モデル^22、23,24で厳密なテストを可能にする、マウスにおける難聴表現型を継承するための電子、多数のモデルが存在する。従って、マウスモデルにおいてウイルス媒介遺伝子治療を用いて聴覚を補正するヒト疾患の治療法の探索において適切な最初のステップである。

我々は以前胞性グルタミン酸輸送体3（VGLUT3）を欠くトランスジェニックマウスによるIHCリボンシナプス²⁵におけるグルタミン酸放出の欠如のために聴覚障害者が生まれていることが示されている。この変異は感覚毛細胞の一次変性につながらないので、これらの変異マウスは、潜在的に先天性難聴のための蝸牛遺伝子治療をテストするに優れたモデルである。

現在までに、蝸牛遺伝子治療のためのウイルス送達技術の数が正円窓膜拡散、正円窓膜注射、および蝸牛を介した送達を含む、記載されている。強力ありますIAL利点及びこれらのアプローチ⁹のそれぞれの短所。

ここでは、正円窓膜（RWM）を介してVGLUT3 KOマウス内耳へのウイルス媒介遺伝子送達のための外科的方法を報告している。耳介RWM注入法は、優れた聴覚保護と低侵襲性であり、かつ比較的高速である。我々は以前に公開しているように、このマウスモデルで聴力回復するための努力で、VGLUT3遺伝子（AAV1-VGLUT3）を運ぶAAV1ベクターは、生後12日目にこれらの聴覚障害のマウスの蝸牛に導入した（P！@）、その結果^26聴力の回復。導入遺伝子のタンパク質発現を免疫蛍光（IF）を使用して確認しながらVGLUT3 KOマウスにおいて聴力は、聴性脳幹反応（ABR）によって確認した。この方法論は、このように、ウイルス媒介遺伝子治療は、そうでなければ難聴になるだろう遺伝的欠陥を修正することができることを実証している。

プロトコル

注：すべての手順や動物の取り扱いは、NIHの倫理ガイドラインを遵守し、カリフォルニア大学の制度的動物実験委員会、サンフランシスコのプロトコル要件を承認した。

1.手術のための動物の準備

1. きれいな、専用スペースでの外科的処置を行ってください。手術前にガラスビーズ滅菌器で滅菌する、すべての手術器具をオートクレーブ。
   注：このプロトコルでは、生後10〜12（P10-12）FVBマウスを使用しています。異なる年齢のマウスの株は、特定のプロジェクトのニーズを満たすために使用することができる。水疱の骨が難しくなりますので、P40より古いマウスは、挑戦することができます。
2. 塩酸ケタミン（100mg / kg）の混合物の腹腔内注射、塩酸キシラジン（10mg / kgの）、およびアセプロマジン（2mg / kgの）でマウスを麻酔。動物は、もはやそのようなつま先のピンチのような痛みを伴う刺激に応答した後にのみ、外科準備を開始します。もしnecessaryは、オリジナルの麻酔薬平面を復元するために麻酔薬カクテルのブースター用量（五分の一のオリジナル用量）を管理する。
   注：この年齢で観測された死亡率のほとんどは麻酔薬の過剰投与によって引き起こされるので、この段階では注意してください。
3. 動物のまばたき反射を抑制し、麻酔中湿った目を保つために、保護眼軟膏で動物の目をカバーしています。
4. マウスが完全に目を覚ましになるまで、麻酔後の低体温を防ぐため、作業中は加熱パッド上に拡張され、首にマウスを置きます。
5. バリカンで左ポスト耳介地域を剃ると外科的操作の前に70％エタノール及びポビドンヨードで消毒する。

2.手術手順とベクター注入

1. 鼓室胞を露出させるためにポスト耳アプローチを使用してください。ポスト耳介筋肉を露出させるために、小さなハサミで皮下組織を切開。目に脂肪組織を後退後切開部の電子後方側は、側頭骨を露出させるために切開に垂直な左右の筋肉を分離する。この切開は十分な可視化と快適に作業するのに十分な長さであることを確認してください。
2. 25 G針で鼓膜胞を穿孔し、蝸牛の基底回転へのアクセスを許可するように戻って骨を剥離することにより、鉗子で、必要に応じて穴を展開し、[あぶみ骨動脈と丸い窓膜を可視化するために十分に広げる（RWM） 。
3. ホウケイ酸キャピラリーピペットで中央に優しくRWMをパンク。この時点ではRWMを通して流体流出を観察する。これは正常です。流出が安定するまで待ちます（蝸牛から流出した流体は、滅菌濾紙で乾燥させる）。
   注：保持とRWMの穿孔ができるだけ小さくなるように、ガラス針を進める際には注意してください。使用される顕微鏡に応じて、ピペットがピペットを用いてマイクロマニピュレーターを用いて、または手で保持するホルダー。
4. パッチクランプピペットが用意されているのと同じ方法プラーピペットを用いて注入するためのピペットを準備します。内と外のウイルスをピペットが簡単に行われますように（直径約15μm​​）先端径が大きいことを確認してください。
5. インジェクションピペットにAAV1-VGLUT3の1から2μL、AAV1-GFPまたはAAV2-GFPを策定する。流出（5〜10分）、安定化、microinject同じ穴を通して鼓室階にこの固定ボリュームは、以前RWMに行われた後。
6. 筋肉の小さなプラグをピペットを引き出した後、すぐにRWのニッチを密封し、ラウンド窓からの漏れを回避するために、筋肉に置かれた組織接着剤の小滴で固定します。
   注：非常によく、針が蝸牛-このステップからの外リンパの漏出を防止するために、筋肉の小さなプラグを除去した後、この穴をシール聴力を維持することが重要です。完全にRWMをシールに失敗すると、時間をかけて難聴になります。
7. 注射後、カバー脂肪組織と聴覚の水疱の穴、彼らの通常の位置にポスト耳介筋や脂肪組織を返し、6-0または小さい吸収性クロム縫合糸で層に傷を縫合。
8. ポビドンヨードと傷口を消毒する。

3.術後ケア

1. 暖かいケージにマウスを置き、彼らが完全に戻っ母親とそれらを移動回収されるまで、それらを無人のままにしないでください。それは、母親と一緒に戻って子犬を置く前に、ケージから男性を削除することを推奨します。
2. 炎症および疼痛を管理するために、3日間その後術後鎮痛と、24時間の皮下カルプロフェン（2ミリグラム/ kg）を投与する。苦痛、異常な体重減少、痛み、または感染の徴候について毎日動物を監視します。一般的に、すべてのマウスが正常に機能するべきである手術後3 ^日目による。苦痛や病気の徴候は^3日後にマウスに表示された場合は、Tを安楽死を検討施設のガイドラインに従って、彼はマウス。

聴覚脳幹反応（ABR）録画を用いてウイルス送達後の蝸牛機能4.評価

NOTE：聴性脳幹反応（ABR）は、聴覚が潜在脳における進行中の電気的活動から抽出され、頭皮の下に配置された電極を介して記録された誘発である。動物は、音で刺激される。結果の記録は、聴覚刺激の発症後最初の10ミリ秒で聴覚路に連続する点の電気的活動を反映して5波で構成されています。

1. このプロトコルのセクション1.2で説明したようにアセプロマジンなし除き、塩酸ケタミンとキシラジン塩酸塩の混合物の腹腔内注射によりマウスを麻酔。
2. マウスが完全に目を覚ましになるまで、麻酔後の低体温を防ぐために、聴力検査を通じて加熱パッド上にマウスを置きます。
   注：使用この実験では、次の音の刺激：（5ミリ秒の期間; 31 Hzのプレゼンテーション率）をクリックします。
3. 頂点で、左耳（参照）の耳介の下、および対耳（グランド）の下に皮下針電極を配置し、以前に防音室^27,28で説明したようにのABRの記録を開始。ダウン最大振幅から5デシベルの音圧レベル毎のレコードABR波形。
4. 早けれウイルス送達後4日間などの術後のABR閾値を決定
   注：閾値は波の応答のピークI-Vは、明らかに繰り返し目視上に存在していた最低の刺激レベルとして定義される。
5. 私は蝸牛神経からのアクティビティを分析するために波を測定します。検出可能なABR波形が得られる最低刺激レベルを閾値として定義される。

免疫蛍光を用いて5蝸牛導入遺伝子タンパク質発現

1. intrapの過剰摂取によりマウスを麻酔塩酸ケタミンとキシラジン塩酸塩の混合物のeritoneal注入アセプロマジンなしを除いて、このプロトコルのセクション1.2で説明したように。
2. 動物は、もはやそのようなつま先のピンチのような痛みを伴う刺激に応答した後にのみ頭を首を切る。
3. ^26を説明するように全体のマウント免疫蛍光のためにアウトとプロセス蝸牛を解剖。抗VGLUT3および抗ミオシン7aの抗体を用いて蝸牛全体マウント免疫蛍光法の詳細なプロトコルはアキールら 、2013 ²⁹に記載されている。
4. 250希釈：GFP標識のために、1でウサギ抗GFP抗体を用いて4℃で一晩蝸牛全体のマウントをインキュベートする。
5. PBSで10分間、二回蝸牛をリンスした後、Cy2とコンジュゲートしたヤギ抗ウサギIgGで2時間インキュベート1に希釈した：PBSで4000。
6. 10分間、2回PBSで蝸牛をすすぎ、15分間DAPIでそれらを培養する。
7. スライドガラス上に蝸牛をマウントし、ウントを観察共焦点免疫蛍光顕微鏡えー。

結果

蝸牛分子治療のための技術的特徴とポスト耳アプローチの有用性を確認するには、AAV1-VGLUT3、AAV1-GFPおよびAAV2-GFPはRWM経由P10-12マウス内耳に送達された。このアプローチは、内有毛細胞内で正常に導入遺伝子発現（IHC）（VGLUT3 図1及びGFP 図2及びGFP 図3A）、外有毛細胞（OHC）（GFP 図2）および支持細胞（GFP、図2および図^{3A）26 を}示し^ているコルチ傷害の重要な臓器なし。蝸牛全載免疫蛍光画像（ 図2及び図3A）に見られるGFPを発現する異なる細胞型の観察は、AAV血清型の選択は、形質導入される細胞型と適合しなければならないことを示している。 図2及び図3A図1を ^26は

ディスカッション

本研究では、遺伝的欠陥によって損なわれている通常の聴覚機能を回復または救助を目的とし、詳細に蝸牛遺伝子治療に使用することができる技術が記載されている。それは典型的に非外傷性であるように、このアプローチは、人工遺伝子導入または他の潜在的な分子の治療法³⁰に安全である。蝸牛療法のための他のアプローチは、腹側のアプローチ^24、マウスおよびモルモットにおける蝸牛^31,32と内リンパ嚢配信³³を含む、記載されている。我々の経験では、耳介後部のアプローチは、より速く、より簡単で、かつ減少した傷害や動物の死亡率に関連付けられている。さらに、ポスト耳介のアプローチは、外傷の少ないチャンスと^34,35,36を聞くの関連する損失とRWMの改善された可視化を提供しています。このレポートは、番目にAAV1-VGLUT3の配信を実証することによって蝸牛分子治療のためのポスト耳アプローチの技術的側面と実用性を文書化RWM経由E内耳、（ 図1と図2と図3A）VGLUT3

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ケタミン	バトラー シャイン
キシラジン	アナセド
アセプロマジン	UCSF提供 LARC
カルプロフェン鎮痛	UCSF提供 LARC
ベタジン	ピュアデュー製薬
デキサメタゾン眼科軟膏 (TobraDex)	アルコン
ヒーティングパッド	Braintree scientific, inc.
25Gニードル	BD	305127
ホウケイ酸キャピラリーピペット	World Precision instruments, inc.	1B100F-4
縫合糸 PDS*plus 抗菌	性 Ethicon	PDP149
組織接着剤 (Vetcode)	Butler Schein	31477
ウサギ 抗 GFP 抗体	Invitrogen	A11122
解剖顕微鏡	ライカ		MZ95
フレーミング/ブラウンマイクロピペット	サッターインスツルメント コ
プーラー P-97型
TDT BioSig IIIシステム	タッカー・デイビス・テクノロジー

ズ