マウスの左前下冠動脈の動脈の常設ライゲーション：心筋梗塞後のリモデリングおよび心不全のモデル

サマリー

心不全は入院の主な原因であり、主要な死亡原因です。マウスにおける左前下行冠動脈の永久結紮のモデルを適用して、心室リモデリングと心筋梗塞後の心機能障害を調査します。マウスにおける侵襲的血行動態測定の技術が提示されます。

要約

心不全は、心臓が、安静時またはストレス中の細胞酸素要求に見合った速度で血液を送り出すために失敗する症候群である。これは、労作時、特に、体液貯留、息切れ、疲労によって特徴付けられる。心不全は、成長している公衆衛生問題、入院の主要な原因であり、死亡率の主要な原因である。虚血性心疾患は、心不全の主な原因である。

心室リモデリングは、左心室の構造、大きさ、形状の変化を指す。左心室のこのアーキテクチャのリモデリング（ 例えば、全身性動脈高血圧症または大動脈弁狭窄症）、または容量過負荷による圧負荷により、傷害（ 例えば、心筋梗塞）によって誘導される。心室リモデリングは、壁応力に影響を与えるので、それは心機能及び心不全の発症に重大な影響を与える。左前descendinの永久結紮のモデルマウスにおけるグラム冠動脈心室リモデリングおよび心臓機能心筋梗塞後を調査するために使用される。このモデルは、左冠動脈前下行枝の過渡結紮のモデルに比べて目標や病態生理学的関連性の点で基本的に異なる。虚血/再灌流傷害のこの後者のモデルにおいて、梗塞の初期の程度は、再灌流後の心筋救済に影響を与える要因によって調節され得る。対照的に、左冠動脈前下行枝の永久結紮後24時間での梗塞領域は固定されている。このモデルにおける心機能は、1）梗塞拡大、梗塞の治癒、および瘢痕形成のプロセスによって影響される。 2）左心室拡張、心肥大、及び心室リモデリングの同時開発。

左冠動脈前下行枝の永久結紮モデル、侵襲的血行動態MEAの技術に加えてマウスにおけるsurements詳細に示されている。

概要

心不全は、心臓が安静時またはストレス時に細胞の酸素必要量に見合った速度で血液を送り出すことができない症候群です。これは、体液貯留、息切れ、特に運動時の疲労を特徴としています。心不全は、増大する公衆衛生問題であり、入院の主な原因であり、死亡の主な原因です。虚血性心疾患は心不全の主な原因です¹。

心室リモデリングとは、左心室の構造、サイズ、形状の変化を指します。言い換えれば、心室リモデリングは左心室構造の変更に関係しています。この左心室の構造的リモデリングは、損傷(心筋梗塞など)、圧力過負荷(全身性動脈性高血圧症や大動脈弁狭窄症など)、または体積過負荷(僧帽弁閉鎖不全など)によって誘発されます。心室リモデリングは壁面ストレスに影響を与えるため、心機能や心不全の発症に大きな影響を与えます。

急性心筋梗塞後の心筋組織の喪失は、収縮期駆出の減少と左心室拡張末期の容積と圧力の増加をもたらします。Frank-Starlingメカニズムは、拡張末期の容積の増加が収縮期に発生する圧力の増加をもたらすことを示唆しており、心拍出量の回復に役立つ可能性があります。しかし、それに伴う壁応力の増加は、非梗塞領域では局所肥大を誘発する可能性があるが、梗塞領域では拡大と菲薄化が起こり得る。実験動物実験では、梗塞性心室肥大と肥大の程度は梗塞サイズ²に依存することが示されています。

急性心筋梗塞後の心筋組織の喪失は、負荷条件の急激な増加をもたらします。梗塞後のリモデリングは、伸張および拡張した梗塞組織が左心室容積を増加させるため、ボリュームオーバーロードの設定で発生します。心室容積の増加は、前負荷の増加(拡張期末の受動的な心室壁ストレス)だけでなく、後負荷(収縮期排出時の心筋壁総ストレス)の増加も意味します。収縮期橈骨が大きくなるため、後負荷が増加します。したがって、心筋梗塞後の心室リモデリングは、容積過負荷と圧力過負荷の混合された特徴によって特徴付けられます。

心筋は、心筋細胞、細胞外マトリックス、および毛細血管微小循環の3つの統合されたコンポーネントで構成されています。3つのコンポーネントすべてが改造プロセスに関与しています。炎症細胞によって産生されるマトリックスメタロプロテイナーゼは、筋細胞間コラーゲン支柱の分解と心筋細胞の滑りを誘導します。これは、梗塞セグメントの不均衡な薄化と拡張を特徴とする梗塞の拡大につながります³。リモデリングの後期段階では、間質性線維症が誘発され、心臓の拡張期特性に悪影響を及ぼします。

心筋の血管と心筋細胞のコンパートメントは、組織の低酸素状態を避けるために、心室リモデリングの過程でバランスを保つ必要があります^4,5。肥大が心不全に進行するかどうかは、心筋の血管と心筋細胞のコンパートメントとの間のこのバランスに大きく依存している可能性があります。

マウスの左前下行冠動脈の永久結紮のモデルを使用して、心室リモデリングと心筋梗塞後の心機能を調査します。このモデルは、目的と病態生理学的関連性の点で根本的に異なります 左前下行冠動脈の一過性結紮のモデルと比較して。虚血/再灌流障害のこの後者のモデルでは、梗塞の初期範囲は、^再灌流6後の心筋温存に影響を与える要因によって調節される可能性があります。対照的に、左前下行冠動脈の永久結紮後24時間での梗塞領域は固定されています。このモデルの心機能は、1) 梗塞の拡大、梗塞の治癒、および瘢痕形成のプロセスによって影響を受けます。2)左心室拡張、心肥大、および心室リモデリングの付随する発症。

プロトコル

注：この項で説明するすべての実験手順は、動物実験ルーヴェン·カトリック大学の研究諮問委員会によって承認された（プロジェクト：2013分の154-B·デ·沖積層）。

左前下冠動脈の動脈の1常設ライゲーション

1. / kgのペントバルビタールナトリウム70mgの40〜10mg / kgの腹腔内投与によりマウスを麻酔。それはもはやしっかりとつま先のピンチを反応するときに、マウスが麻酔のその適切な面に到達しないことを確認してください。常に適切な麻酔の前に、任意の外科的処置または介入にこの方法を確認する。麻酔下ながら、角膜の乾燥を防ぐために、眼軟膏、潤滑使用してください。手順（ブプレノルフィン0.05 mg / kgをSQ）の開始前に術前鎮痛2-4時間を提供します。
   1. 生存手術中に一貫性のある無菌技術を適用します。最大限可能な範囲で微生物詐欺に抑制する手順を実装tamination重大な感染や化膿が発生しないようにします。これらの手順は、このサイトの手術部位と消毒の上、滅菌器具及び無菌材料の使用、手術領域の消毒、および毛皮/髪の除去が含まれています。
2. 自己準備平滑化20ゲージ針でマウスを挿管。
   1. 頭の過伸展と仰臥位でマウスを置きます。
      1. 首領域に光の焦点を合わせる。鈍いピンセットと舌を持ち上げます。喉頭の入口を明瞭に見ることができる。
      2. 直視下気管内に喉頭を鈍化針を渡します。人工呼吸器にマウスを接続することにより、正しい挿管を評価する（μlのストローク量：3×体重（g）+ 155、周波数：毎分120ストローク）。
   2. あるいは、第慎重に気管を露出することにより、気管内挿管の可視化を強化する。
      1. 5ミリメートル半ば首の切開を作成し、撤回ちょうど気管上記筋肉組織。
      2. 気管の直接可視化のための外科的実体顕微鏡を使用して挿管を実行します。舌を持ち上げ、気管内に自己準備平滑化20ゲージの針を入力してください。人工呼吸器にマウスを接続することにより、正しい挿管の確認（μlのストローク量：3×体重（g）+ 155、周波数：毎分120ストローク）。
3. 仰臥位でマウスを保持し、テープでマウスを修正。低体温症を防ぐために加熱パッド上に手術を行う。
   1. 剃るとベタジンで皮膚を消毒する。左後肢が手術中に左心室に、より良いビューを得るために、右後肢を横切るように注意してください。
4. 胸骨までの小さな横方向の皮膚切開を作成し、下にある皮膚や筋肉を分離する。
5. Mを脇に引き出します。胸マイナーであり、m。 5-0絹縫合糸で大胸筋 。
6. 私を作る鈍いピンセットを挿入することによって第3肋間でncision。
7. 胸骨に到達するまで、外側から内側の側方から肋間筋の下にピンセットを移動します。皮膚に内側からピンセットを押して胸壁を穿刺。慎重にちょうど小さなハサミとピンセットの上肋間筋を切断して開胸を完了します。肺のパンクチャリングを防ぐために、このテクニックを使用してください。
8. 肺を保護するために空洞に0.9％のNaCl中に浸漬したスポンジを入れてください。心臓の左側の露出を得るために、肋間空間に創傷スプレッダ（胸部リトラクタ）を導入する。今のところ、左心房、左心室、および左冠動脈前下行枝は実体顕微鏡下に表示されます。
9. 左心房の先端で約1ミリメートルシングル6-0プロレン合字と左冠動脈前下行枝の結紮を行います。これは最初の対角枝から遠位にある。
   注：または、7-0（00.05ミリメートルの直径）または8-0のスレッド（0.04 mmの直径）を使用することができる。針は、C-1 13ミリメートル3/8円形テーパーポイントの針である。左冠動脈前下行枝の成功ライゲーションは、影響を受けた領土で淡い登場する心筋で、その結果、即時の変色を誘導する。
10. 傷スプレッダー（胸のリトラクター）を取り外します。
    1. 肋間スペースを中心に3 6-0のTi-Cronの縫合糸を配置します。縫合糸を締める前に、胸腔からスポンジを除去し、人工呼吸器の流出を遮断することによって、肺を再膨張する。そうすることによって、肺は壁側胸膜との再接続。
    2. その後、タイトな縫合糸を引っ張り、胸を下に押して、再膨張を繰り返します。生理食塩水を少量使用して胸部の成功した閉鎖を確認して（胸に圧力を適用する際に気泡が見られないことがあります）。
    3. 肺の正常な展開を確認す​​るために、肋間筋に目を通す。 、両方の胸の筋肉を再配置として気胸の予防のための余分な障壁。
11. 5-0シルク縫合糸で皮膚を閉じます。
12. 人工呼吸器からマウスを外し、加熱パッド上で回復を可能に。それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまでは無人の動物を放置しないでください。完全に回復するまで、他の動物の会社に手術を受けた動物を返さないでください。
13. 一貫して術後鎮痛（手術後少なくとも48時間ブプレノルフィン0.05 mg / kgをSQ BID）を提供する。

マウスの生体内侵襲血行動態測定2.

1. 手順の前に、信号ドリフトを最小限に抑えるために、少なくとも30分間37℃で滅菌水中1.0フレンチのMillar圧力カテーテルを沈める。電子的に2000ヘルツを0 mmHgでおよび100mmHgの圧力センサと記録データを較正する。
2. 1.4グラム/ kgのウレタンの腹腔内投与により麻酔を行います。それを確認してくださいそれはもはやしっかりとつま先のピンチを反応するときに、マウスは、麻酔のその適切な面に到達しない。
3. 仰臥位で麻酔をかけたマウスを置きます。テープで手足を固定します。加熱パッドと体温を維持し、直腸プローブで監視。首領域を剃ると甲状腺が露出するように首領域における正中切開を作る。
4. 曲がった針で首を固定します。
5. 唾液腺を脇に引いて、右総頸動脈を公開します。 、白い糸に似ている迷走神経は、動脈に沿って存在する。慎重に湾曲した鉗子を用いて迷走神経から頸動脈を分離する。
6. 他の組織からそれを分離するために右総頸動脈の下に湾曲した鉗子を渡します。動脈周囲の結合組織を除去します。
7. 右総頸動脈の下2 6-0シルクワイヤーを渡します。近い頭に向かって配置され、トップワイヤー、上にタイトな結び目を作り、コッヘル（遠位閉塞性ライゲーション）で固定します。 proxiを渡すMALワイヤは二回から左から右へと2 kochers（近位非閉塞性ワイヤー）で固定します。
8. 無菌の0.9％NaClをドロップすることで、湿った頸動脈にしてください。綿棒で余分な液体をオフに乾燥させます。
9. 遠位連結および近位非閉塞性ワイヤとの間26ゲージ針で右総頸動脈の切開を行います。
10. 動脈に圧力センサを導入する。全く血液の損失がないことを確認します。ゆっくりと前進1.0フレンチのMillar圧力カテーテルをプッシュし、カテーテルが鎖骨の下にワイヤーを通して慎重に渡すことができるような方法で、近位非閉塞性ワイヤーを調整します。
    1. 近位非閉塞性ワイヤーの調整中に血液の損失を最小限に抑えます。それは非常に壊れやすいですので、進めながらあまりにも多くの圧力センサを圧縮しないでください。近ワイヤーが動脈を閉塞してはならないので、血管は血液で満たされたままにしてください。
11. 圧力信号の記録を開始。動脈圧の信号fluctuat70 mmHgで100の収縮期血圧 - - 120 mmHgで60の拡張期血圧の間に健全なマウスにおけるES。
12. 無名動脈を介して左心室に大動脈を経由してカテーテルを向ける。 120 mmHgで - 心室の圧力が0ミリメートルHgのと100の間で変動する。カテーテルが左心室の内部で安定化させる。実験の要件に応じて60分まで30分間の信号を記録します。
13. 実験終了後、30分間、1％Alconoxカテーテルを浸す。 Milli-Q水でカテーテルを洗ってください。フォームブロックにカテーテルを保管してください。
14. さらなる分析のために記録ソフトからデータを取得します。
    1. データ分析のために、圧力信号が安定している時間間隔を考える。興味のある記録されたデータの少なくとも10の連続した​​心臓サイクルを選択してください。
    2. 心拍数、最大収縮期左心室圧、最小の拡張期左ventrを分析するLabChartソフトウェアバージョン8.0または類似を使用icular圧力、等容性左心室収縮（のdP / dtの_最大 ）、等容性左心室弛緩（のdP / dtの_分 ）、拡張終期左心室圧のピークレートのピークレート、及び等容性左心室の時定数圧力秋（タウ^）7。
       注：拡張末期圧は直ちに等容性収縮によって誘発される圧力サージの前の時点での圧力に対応する。タウの計算は、単一指数減衰曲線に左心室圧を適合に基づいており_、P（t）として表さこの式において、P ₀電子^{-t /τの} + bを_{=、P（t）は、}時間における左心室圧であるDP / DTの最大の負の値の後トンに達しました。パラメータbは、簡略化されたアプローチではゼロであると仮定することができる理論的な漸近線に対応する。強化された等容性弛緩は、タウの小さい方の値になる。

結果

心筋梗塞の程度は、エバンスブルー/塩化2,3,5-トリフェニルテトラゾリウム（TTC）の二重染色によって評価することができる。 TTCは、NADH ⁸の存在下で様々なデヒドロゲナーゼの活性による生体組織の深い赤1,3,5- triphenylformazanに変換され、酸化還元指示薬、ある。 図1は、24時間後に心臓の代表的な断面を示している左冠動脈前下行枝の結紮。ブルー染色領域が非虚血/正常な領域を示している。リスクのある心筋の領域は、左冠動脈前下行枝の結紮から遠位ベッド灌流内の心筋組織として定義されている。ネガティブ染色領域（淡赤色）が梗塞領域を示すのに対し、深い赤色に染色された領域は、虚血が、実行可能な領域（リスクのある非梗塞面積）領域を示している。このモデルでは、リスクのある非梗塞領域は、目の永続的なキャラクターを反映したこの画像、で無視できなく見える左冠動脈前下行枝のEライゲーション。総左心室壁領域^9,10の60％ -梗塞領域は、典型的には50の間である。梗塞ゾーンの進化の二成分は識別されるべきである：1）梗塞の三次元形状）は、梗塞の総容積をより薄く...

ディスカッション

慢性心筋の構造および機能の変化、左心室機能不全の発症、および心不全への進行は、いくつかのマウスモデル¹²で調査することができる。心臓リモデリングおよび機能不全は、心筋障害、または圧力大動脈狭窄を横断する第二過負荷、または拡張型心筋¹²の遺伝モデルで研究することができることによって誘導することができる。明らかに、マウスモデルの最も顕著な利点は、トランスジェニックおよび細胞型特異的および誘導性トランスジェニックモデルを含むノックアウト株の多数の利用可能性がある。これらのモデルにおける心臓リモデリングの評価は非常にmicromanometryを用いて超解像度2D-及び3次元心エコー検査、マイクロ磁気共鳴イメージング、血行力学的評価のような技術の開発により容易化されており、圧力容量ループの微圧計コンダクタンス技術は、分析する。本稿では、MODに焦点を当てている心筋傷害のelは左心室micromanometryにより冠動脈および左心室機能の評価を左前の永久結紮により誘発される。

心筋梗塞の最初のマウスモデルはZolotareva ら

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ブプレノルフィン(ブプレネックス)	ベッドフォード研究所
ナトリウムペントバルビタール(ネンブタール)	セバ
ベタジン	VWR国際	200065-400
5 - 0シルク縫合	チコン、ジョンソン&ジョンソンメディカル	K890H
6 - 0プロレン縫合糸	エチコン、ジョンソン&ジョンソンメディカル	F1832
6 - 0 Ti-Cron 縫合糸	Ethicon, Johnson &ジョンソンメディカル	F1823
ウレタン	シグマ	94300
アルコノックス	アルコノックス株式会社
人工呼吸器、MiniVent Model 845	Hugo Sachs	73-0043
胸部リトラクターまたは胸部リトラクター	Kent Scientific Corporation	INS600240	ALM 自己保持、鋸歯状、長さ 7 cm、4 x 4 "L" 字型プロング、3 mm x 3 mm
1.0 フレンチミラー圧力カテーテル	ミラー・インスツルメンツ	SPR - 1000/NR
Powerlab	ADInstruments Pty Ltd.
LabChart®	ADInstruments Pty Ltd.
直腸ゾンデ	ADInstruments Pty Ltd.

エ ソフトウェア