幹細胞から網膜色素上皮細胞の効率的な導出

サマリー

幹細胞由来の網膜色素上皮(RPE)細胞は、網膜変性のための細胞ベースの治療、疾患モデリング、薬物研究など、複数の用途に使用することができます。ここでは、幹細胞からRPEを再現性よく導出するための簡単なプロトコールを紹介します。

要約

加齢黄斑変性症(AMD)の治療法は発見されていません。これは、55歳以上の人々の視力喪失の主な原因です。AMDは、病因が不明な複雑な多因子疾患ですが、網膜の根底にあり、光受容体の重要なサポートを提供する細胞の単層である網膜色素上皮(RPE)の死または機能不全が原因で発生すると主に考えられています。RPE細胞置換戦略は、AMD患者の大部分に治療的救済を提供する大きな可能性を秘めており、初代ヒト細胞(hRPE)に強く類似したRPE細胞は、私たち自身を含む複数の独立した研究所で生成されています。また、iPS-RPEの用途は細胞を用いた治療にとどまらず、RPE疾患のモデル化にも利用されています。このような研究は、疾患の分子基盤を解明するだけでなく、新薬の開発や試験にも役立つ可能性があります。ここでは、幹細胞からのRPEの指向性分化のための最適化されたプロトコルを紹介します。ニコチンアミドと、その効果を模倣する小分子であるアクチビンAまたはIDE-1を特定の時点で添加すると、RPE細胞の収量が大幅に向上します。この手法を使用すると、早ければ3か月で大量の低通過RPEを導き出すことができます。

概要

網膜を占める様々な細胞タイプは、機能的な構造で組織化されています。網膜の後ろにある光受容体は、光伝達を通じて光を電気インパルスに変換する役割を担っています。しかし、光伝達は、ミューラーグリア細胞や網膜色素上皮(RPE)細胞など、他の隣接する細胞タイプの協調的な努力なしには起こり得ません。RPE細胞の単層は、光受容体の主要な血液供給源である絨毛毛細血管から感覚網膜を分割し、光受容体の恒常性に重要な複数の機能を制御するのに理想的な位置にあります。実際、RPEと光受容体は非常に共依存的であるため、1つの機能ユニットであると広く考えられています。 (RPEのすべての多様な機能のレビューについては、Strauss、2005、¹を参照してください。網膜色素上皮細胞の死滅または機能不全は、先進国における永久的な視力喪失の主な原因である加齢性黄斑変性症(AMD)を誘発する可能性があります^2-4。

AMDは、RPE、光受容体、および脈絡膜血管系の多因子疾患であり、危険因子は多様であり、環境的および遺伝的影響の組み合わせが含まれます^5,6。AMDの治療法は非常に限られていますが、有望な治療法の1つはRPE細胞置換^術です7,8。結果はまちまちですが、AMD患者(および網膜変性症の他の患者)および網膜変性のげっ歯類モデルにおけるRPE細胞の移植は、重大な光受容体萎縮を一過性に防ぐ可能性があります^9-23。 (これらの研究で一般的に使用される動物モデルは、MerTK遺伝子に変異を持つRoyal College of Surgeons(RCS)ラットです。この突然変異により、RPE細胞は光受容体の外側セグメントを貪食できなくなり、網膜変性を促進します²⁴)。RCSラットおよびマウスの網膜下腔に埋め込まれたRPEの報告された生存率は大きく異なるが、それらが数ヶ月または数年生存する可能性がある^9,10,12,20。

RPE細胞は、多能性幹細胞^9-14,25-28からそれらを誘導することにより、移植に十分な数で得ることができます。いくつかの独立したグループは、これらの細胞が体細胞の対応物と同様に機能することを実証しており、長期的な研究では、ラットおよびマウスの疾患モデル^{9,10,12,14,19,20,25,29-32}に移植すると安全であることが示唆されています。胚性幹細胞の代わりに人工多能性幹細胞を使用することは、同種RPEに関連する倫理的問題や免疫学的課題が回避される可能性があるため、有利である可能性がある^33,34。iPS技術のもう一つのエキサイティングなアプリケーションは、疾患モデリング³⁵です。RPE疾患の患者に由来する多数のRPE細胞を調査する能力は、その分子基盤を理解するために非常に貴重です。このタイプの研究は、最近、Best 疾患患者 RPE で実施されており、遺伝性黄斑症の同様の研究への道を開く可能性があります³⁶。

幹細胞からのRPEの導出は比較的単純なプロセスであり、完全にゼノフリーの条件で行うことができます。最も単純な戦略は、RPE細胞の単層を自発的に誘導することですが、指向性分化技術を使用して収量を大幅に改善できます。しかし、これらの技術は、高価で、細菌や他の非ヒト源でしばしば生成される可能性のある外因性タンパク質因子の使用を含む^10,12,37。私たちの研究では、ニコチンアミドとアクチビンAを利用する確立されたプロトコル¹⁰に従いました。これは、RPE仕様³⁸に十分であることが示されているシグナル伝達因子です。ここでは、低分子IDE-1がアクチビンAを適切に置き換えることができることを実証し、したがって、組換えタンパク質の使用に関連するコストを削減し、懸念を軽減する³⁹。また、ゼノフリー血清置換療法を利用し、合成ゼノフリー基質上で分化したRPE細胞を培養します。RPE細胞は、このアプローチを用いて非常に効果的に分化することが以前に示されている⁴⁰。

単層として分化させると、RPE細胞を含む色素沈着コロニーを早くも5週間後に視覚化します¹²。十分なサイズに達したら、手動で切除し、別の皿に移して拡張することができます。RPE細胞は、継代ごとに脱分化することで有名であり、5継代より古いものの使用は避けるべきです(動物モデルでの特性評価と移植に十分な数の細胞は、2つまたは3つの継代後に簡単に生成できることがわかりました)。完全に分化した後は、複数の技術を用いて細胞を解剖学的および機能的に特徴付け、疾患のあるRPEの適切な代替品として機能するようにします。これらの技術の説明、およびげっ歯類の網膜下空間にiPS-RPEを移植するためのプロトコルは、この方法の論文の範囲を超えており、以前に発表されています^12,32,41。

iPS-RPEの効果的な導出のための標準化されたプロトコルの開発が臨床にとって明らかに重要である一方で、動物モデルではまだ重要な前臨床研究が行われています。iPS細胞由来細胞の免疫原性が懸念されており、人工基質への細胞移植など、複数の異なる移植技術が検討されている^42,43。これらの理由から、標準化されたプロトコルの公開は、臨床研究と前臨床研究の両方を促進するために有益であると感じています。特に、異なる研究グループによって異なる研究室で得られたiPS-RPE細胞を直接比較する場合。

プロトコル

幹細胞由来のRPEの1.ダイレクト分化

注：全てのインキュベーションステップを、5％CO ₂中で37℃で実施される

1. 維持培地（; 表1 MM）でのhESまたはHIPSライン（毎日餌）を維持する。ラインは、品質管理の十分な基準に達したら、マウス胚性フィーダー細胞（MEFの）の層の上にそれらを維持する6ウェルプレート250,000 /ウェルの密度で播種した。異種非含有培養もタッカーらによって設立されたプロトコルに従って生成することができます^。40。
2. 幹細胞のコロニーがコンフルエントに到達できるように。
3. ニコチンアミド（; 表1 DM / NIC）に分化培地に切り替え。毎日食べます。
4. RPE分化を強化するために、培養3週間後、ニコチンアミドのいずれかアクチビンAまたはIDE-1（ 表1 DM / NIC / AAまたはDM / NIC / IDE1）で分化培地に切り替える。
5. 培養での5週間後、DM / NICに切り替える。メディア停止中のpH指示薬が給餌の翌日黄色回し一日一回の授乳は、もはや必要ありません。
6. （ 図2D-Fおよび3Aを参照してください）を切断して除去するのに十分な大きさであることを表示する色素性細胞の小島のを待ちます。

2.単離色素性島

1. コー​​ト天然の細胞環境を模倣マトリックスと24ウェルプレートのウェル（異種非含有であることが好ましい）。
   注：角膜ブレードと鋭い、先の細い鉗子は、ピッキングのために非常に有用である。ピッキングしながら、分化した細胞のシート全体を切り離すことができます。慎重に作業し、当初は皿の中央にコロニーを拾い、この問題を回避してください。
2. 必要に応じて、分化培地（ 表1 DM）を24ウェルプレートのような多くの井戸を埋める。この決定は、着色されたコロニーの数に依存する集めた。
3. 解剖スコープを持つ細胞培養フードでは、手動で着色された島を切り出す。約2-6バラバラにメスを使用して、元のプレートの下にあるそれぞれの膵島を切り刻むと鋭いピンセットで着色された部分をつかむ。
4. 各24ウェルに1-2着色された部分を転送します。
5. 細胞が接着するまで、メディアを1週間に3回の変更を開始、その後、3〜5日間のメディアを変更しないでください。 （彼らはこの時間後に付着していない場合は、可能性が、彼らは決して良いことである）。
6. 分化培地（DM; 表1）で3~4週間細胞を増殖-典型的な培養物の画像を図3Bに示されている。細胞はまだ全体をよく埋めないかもしれないが、より長い待っていることは助けていないようです。細胞を1週間に3回を養う。
7. 必要に応じて、約3週間後に、手動で鋭いピンセットで塊の白い細胞のクラスターを削除します。それが必要でない限り、この手順を実行しないでください - それは、汚染物質を導入することは容易である。 〜するのは理想的です。ステップ1.6で、元の着色されたコロニーからRPEの最も純粋な集団を得ることを試みる。

3.継代幹細胞由来のRPE

1. 37℃で5-8分間（好ましくは、トリプシンの希釈を通して不活性化することができる試薬であることが好ましいていない）細胞解離溶液と200μlの持つ細胞を剥離し、DMで希釈し、それを不活性化する。すべてのセルを洗い流すためにと（2つの24ウェルから細胞をプールすることを検討、数個の細胞のみが含まれているだけでなく、選択している場合）、それらを再懸濁し、200μlのピペットを使用してください。
2. 遠心機（5分間800×gで）、上清を捨て、そして3ミリリットルDMのメディアで再懸濁します。
3. 再プレート細胞1つ（または2つ）ウェル当たりDM 3ml中の一つのマトリックスコートした6ウェルに24ウェルから（1：5の拡張）。
4. 細胞が約90％コンフルエントになるまで1〜2週間を展開。完全に分化した純粋培養の画像は、図3Cに示されている。
5. 1ミリリットルの細胞dで細胞を剥がし37℃で約5-8分間issociation溶液は、DMで希釈し、それを不活性化する全ての細胞を洗い流す1,000μlのピペットを使用し、それらを再懸濁する。
6. スピンダウン（5分間800×gで）、上清を捨て、そして18ミリリットルのDM培地で再懸濁します。
7. （6展開1）又は1でコーティングされた75センチメートル²フラスコ（1：7.5の拡張）は、6マトリックスに1つの6ウェルの各々から再プレートの細胞をウェルあたりDM 3mlの6ウェルをコーティングした。
8. 十分な細胞が得られるまで繰り返して、必要に応じて3.4から3.8を繰り返します。
   注：むしろ各通路はRPEの脱分化を誘導するので、継代を経由しての文化を増幅することを計画よりも拡大のための可能な限り多くのコロニーを収集してみてください。

結果

図1に示すように、本 ​​稿で説明する手順は、以前に報告されているように^10,12を容易に幹細胞からRPEを生成するために使用することができる。数週間のiPSラインを維持した後、着色されたコロニーが5-7週間後（7週齢の培養物は、図2A-Cに示されている）の後にコロニーに現れ始める。これらのコロニーは培養が維持されているように週間成長し続けることができます。 図3Aに示すように、 図2D-F（8週目の培養）に示すように、十分な大きさに達したら、それらを手動で切り出すことができる。非RPE細胞の混入を避けるために慎重な切除が大幅に十分に純粋RPE培養（ 図3B-C）の生成を促進する。

ディスカッション

この原稿では、効率的に純粋なIPS-RPE培養を大量に生成するための手順の概要を説明します。私たちは強くトランスクリプトミクス、プロテオミクス、メタボロミクス、および機能性に基づいてhRPEに似たiPS-RPEを生成することができますアクチビンAと、この指示分化プロトコルを使用して、以前に示されており、RCSラット^12,31,32のに移植するとき、彼らは網膜変性を遅らせること。のiPS-RPEを生成するプロセスは、時間がかかり、面倒ではない（ 図1）である。のiPS培養物がコンフルエントに達すると、彼らは日常的に分化培地を供給する必要があります。私たちは、アクチビンAまたはより安価な低分子IDE-1のいずれかでメディアを補完し、一般的には5-7週間後（ 図2A-C）の後に表示される着色されたIPS-RPEコロニーのための文化を監視しながら、2週間の餌を続ける。一度十分な大きさに達した（ 図2D-Fおよび3A）、コローニESは手動で削除すると拡大のための新たなプレートに移す。これは8...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
角膜ナイフ	Surgipro	SPOI-070	ナイフx 1
DMEM / F-12、HEPES	Life Technologies	11330-032	500 ml x 4
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、1X w/out CaまたはMg	VWR	45000-434	500 ml x 6
ウシ胎児血清、レギュラー (熱不活性化)	VWR	45000-736	500 ml x 1
FGF-Basic (AA 10-155) 組換えヒトタンパク質	ライフテクノロジー	PHG0021	100 & マイクロ;g x 1
IDE-1	ステムジェント	04-0026	2 mg x 1
ノックアウト DMEM	ライフ テクノロジー	10829-018	500 ml x 1
ノックアウト セラム リプレイスメント	ライフ テクノロジー	10828-028	500 ml x 1
L-グルタミン 200 mM	Life Technologies	25030-081	100 ml x 1
MEM 非必須アミノ酸溶液 100X	Life Technologies	11140-050	100 ml x 1
ニコチンアミド	Sigma-Aldrich	N0636-100G	100 g x 1
ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-148	20 ml x 1
組換えヒト/マウス/ラット アクチビン A	ペプロテック	120-14E	10 & マイクロ;g x 2
Synthemax-T 表面 6 ウェルプレート	Corning	3877	ケース(12) x 1
TrypLE-Express 酵素 (1X)、フェノールレッドなし	ライフテクノロジー	12604-021	500ml x 1
真空フィルター/保存ボトルシステム、0.1µmポア、500ml	コーニング431475		ケース(12)×1