方法論記事

スフェロイドにおける哺乳動物細胞の大規模拡張のための連続供給することによって栄養規制

DOI：

10.3791/52224

⸱

2016年9月25日

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1Radiology, University of Minnesota, 2Medicine, University of Minnesota, 3School of Public Health, University of Minnesota, 4Surgery, University of Arizona

この記事について

サマリー

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栄養調整は、攪拌懸濁バイオリアクターでの培養物に対する断続的なバッチ給餌と比較して、哺乳類細胞スフェロイドの増殖速度を改善します。 この研究は、単純な調整レートフェッド培養を確立するために必要な方法を示しています。

要約

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>jove_content<このデモンストレーションでは、β-TC6インスリノーマ細胞株から形成されたスフェロイドを、哺乳類の膵島細胞製品の製造モデルとして培養し、栄養レベルの調節が細胞収量をどのように改善できるかを実証しました。これまでの研究では、バイオリアクターは静止培養よりも培養量の増加を促進しましたが、細胞収量の増加は観察されませんでした。バッチ給餌の合間に消費されるグルコースなどの主要な栄養素の制限は、細胞増殖の制限につながる可能性があります。培地中のグルコース濃度の増加にもかかわらず、グルコースレベルの大きな変動が観察されました。 連続給餌システムの使用により、グルコースレベルの変動がなくなり、バッチ給餌の静的培養法やSSB培養法と比較して細胞増殖速度が向上しました。計算された栄養素消費量に基づいて摂食速度を調整することにより、成長率のさらなる増加が観察され、これにより、培養中で3週間にわたって生理的グルコースを維持できました。この方法は、他の細胞タイプにも適応できます。

概要

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移植のための生存および機能的ヒト細胞を大量に生成するために、培養条件の調節に不可欠です。 3 -代謝老廃物の蓄積に伴う栄養素の枯渇は、細胞産物1の品質を低下させる老化および代謝変化の主な原因です。この手順では、培養期間を通じて生理学的範囲4中のグルコースを調節するために調整されたレート灌流供給システムと組み合わせて攪拌バイオリアクターを用いて、スフェロイドにおける培養哺乳動物細胞への方法を示しています。これらの研究のために、生理学的範囲は、100〜200ミリグラム/デシリットルと定義しました。同方法は、乳酸のような他の栄養素および代謝廃棄物を調節するために使用することができます。

少量の静的培養（1 - 30ml）を、典型的にはexperimeための細胞系を維持し、区別するために、実験室の設定で使用されていますNTAL目的。細胞の継代は、定期的に、必要に応じて完全培地の変更を行います。ほとんどの「従来の」培地は、栄養制限のリスクなしあまり頻繁に培地交換を可能にするために、高グルコース濃度（これらの研究で使用したDMEM 450ミリグラム/デシリットル）を有しています。しかし、このバッチ供給方法はまだ、頻繁な操作を必要とするセル環境の変動を紹介し、汚染5のリスク増加- 9。攪拌した懸濁液バイオリアクター（SSB）より良好な混合を提供し、3,10取り扱い減少- 20が、静的な文化など、栄養と廃棄物レベルの潜在的に有害な変動に貢献マニュアル培地交換を必要とします。 SSB培養の灌流供給は連続注入し、培地を除去することにより、これらの問題を減少するが、細胞増殖に起因する栄養レベルの大きな変化は、問題が残っています。調整後の送りraの使用推定されたセルの要件に基づいて、栄養利用の計算から、TEは、細胞生存率を最適化するために必要な安定な細胞環境を提供し、21機能することができる- 24。

25具体的に多能性細胞の培養および拡大のための哺乳動物細胞のスケーラブルSSB培養のための方法について説明する多数の文献がある-他の人と32は 、膵島（ベータ）細胞17,33,34に焦点を当てたが、または生物学的製品24の生産、 35から38。これらの調査の細胞型の多くは、スフェロイド培養物中で成長させてもよいし、使用される細胞型に特異的な手順は、連続的な供給システムを実装する前に最適化されるべきです。 43 -この実証では、灌流供給方法は、撹拌バイオリアクター39におけるスフェロイドとして増殖させ、β細胞株を拡大するために使用されました。本明細書に記載される方法を提供します標的培養条件を達成するために、オフライングルコース測定値に基づいて速度調整を供給する簡単な実装。生理学的なグルコースレベルを維持するために、この方法では供給量を調整すること増加細胞収率を示しています。哺乳動物細胞は、エネルギー産生のために、重要な栄養素、グルコースに依存しているので、この細胞株の使用は、多くの培養哺乳動物細胞44のモデルを表します。また、この線は、グルコース45の慢性的に高いレベルに感受性であるベータ細胞のさらなる複雑性を例示します。この研究のために、β-TC6細胞を、インビボでのランゲルハンス島の平均サイズを近似するために、培養中のスフェロイドを形成させました。灌流バイオリアクターシステム17 -消費グルコース調節供給速度で19,21,46は 、生存率の変化なしに、生理学的条件およびより高い細胞収率を維持することになりました。

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プロトコル

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1.細胞株およびメンテナンス

  1. 得β-TC6細胞（または他の所望の接着性の哺乳動物細胞株）。研究、文化、通路、およびプロバイダの指示に従って細胞を凍結保存するための準備で。

2.連続供給システムを組み立てます

注：49 - - 19,21,47、以下の方法で連続供給システムの設計は、文献17に記載されている同様のシステムに基づいていました。ここで使用されるシステムのアセンブリは、前文献3に詳細に記載されています。

  1. 媒体貯蔵、蠕動ポンプ、撹拌バイオリアクター、廃液溜め、およびカスタム設計されたチューブ/サンプリングセット：5つの主要コンポーネントで構成されて供給システムに必要なコンポーネントを収集します。
    1. 2Lのガラス瓶を使用して廃棄物リザーバ、及びstirre、1リットルのガラス瓶を使用して媒体リザーバを確立します（シェルフバージョンオフ）250mlの容量のガラス反応器を使用してDバイオリアクター。
    2. 培地交換を制御するために、8チャンネルポンプヘッドをデジタル蠕動ポンプまたは類似のポンプを使用してください。
    3. パススルーポートを滅菌フィルターを通して換気を提供し、貯水池やバイオリアクターの間のメディア転送を可能にするために、ステンレス製のパイプで硬く、オートクレーブ可能なプラスチックからリザーバと修正されたバイオリアクターの蓋を製造しています。また、さまざまなベンダーからの流れポートを備えた特殊な蓋を購入します。
      注：バイオリアクターの蓋はオプション機器および監視プローブ（ 例えば、酸素モニター）のための追加のパススルーポートを含んでいてもよいです。
    4. 修正されたSSBの蓋に多孔質40ミクロン〜60ミクロンの平均細孔径範囲のガラス通気管、および40％の孔密度から製作流出管（OT）を取り付けます。また、文化の特定の要件に基づいて、別の流出管を選択します。
      注：選択してくださいOT孔径は（詳細はセクション6及び文献3に記載されるように）培養中の細胞凝集体を残し、培地のみ、細胞破片を除去しました。
  2. ポリフッ化ビニリデン（PVDF）チューブコネクタと耐久性の蠕動ポンプチューブからオートクレーブ可能灌流チューブセットを組み立てます。セクションの長さは、異なる構成要素間の距離に依存します。
    注：チューブ品種を選択する際に長期の実験のための耐久性と信頼性を確保するために特別な注意を払ってください。
  3. 供給ライン、廃液ライン、およびサンプルライン：三つの部分からチューブセットを組み立てます。
    1. 2チューブの直径（L / S 14およびL / S 13）を使用して、供給ラインを組み立てます。 L / S 14は、バイオリアクターから媒体貯蔵までの距離をまたがるし、適切なPVDFアダプタを使用して、ポンプ部のためのチューブの長さの中央にL / S 13の短い長さを挿入するプライマリチューブのために使用します。
    2. 標準PVDFホース-とげTUBIを使用しますngのアダプターは、より短いポンプ部（L / S 13）、チューブの両側にL / S 14、チューブを2枚接合します。
      注：また、チューブの全長は、より小さい直径のL / S 13配管することができ、ポンプ部の整合性に問題がある場合、全体のチューブ長を置き換えることができます。
  4. 大きな直径（L / S 16）チューブを使用して、廃棄物の除去のための第二の管部分を組み立て、ポンプセクションの中央にL / S 14チューブの短い部分を挿入します。これは、PVDFのホースバーブアダプタを使用して、または代替的に、所望のポンプチューブサイズの連続した長さを使用して、必要に応じて置換供給ラインアセンブリと同じ方法で行われます。
    注：同一のポンプ及びポンプヘッドは、給電回路と廃棄回路のために使用される場合、廃棄物除去チューブラインのポンプ部は、供給ラインのポンプ部よりも大きな直径でなければなりません。これは、除去ポンプ速度は供給速度よりも速いことを確実にし、強力が回避され培養容量の大きな変化のためにIAL、およびオーバーフローのリスクを減らします。
  5. サンプル収集アセンブリ：チューブセットの最後のコンポーネントを組み立てます。
    1. この手順では、ポートシステムをサンプリング組み立てカスタムを説明し、あるいは、無菌のサンプリングポートは、様々なベンダーから購入することができます。
    2. T型PVDFコネクタと一緒に接続された3つの短い（1~6センチ）L / S 14のチューブの長さ、およびチューブの長さの2に2つの小さなホースクランプからセットを構築します。
    3. クランプの長さの一つにガス抜きのための滅菌ガスフィルターを取り付け、他方は無菌サンプリングシリンジへの接続に使用され、多くの滅菌フィルターではないとして（無菌ガスフィルターは、滅菌後のバイオ安全キャビネットに追加する必要がありオートクレーブ可能）。
    4. バイオリアクターの蓋に取り付けられたステンレス製のサンプルコネクタに第三の端を接続します。
    5. 始める前にバイオリアクターに接続した状態でサンプリングアセンブリをオートクレーブ実験（以下の手順3を参照してください）。
    6. 連続供給プロセスを妨げることなく、必要に応じてバイオリアクターから無菌のサンプルを収集するために、このアセンブリを使用します。

3.オートクレーブすべての材料

  1. オートクレーブ滅菌のためのすべてのバイオリアクターの部品を準備します。
  2. 殺菌のための個々のコンポーネントを収集します。中規模および廃棄物貯蔵槽（ステップ2.1.1から組み立て）（2.1.1から組み立て）、250ミリリットルスピナーフラスコ、必要な修正（2.1.3から組み立て）蓋、（2.1.4に記載されている）流出チューブ、3チューブセット（ ）のセクション2.2 through2.5で組み立てられ、流出管（連続供給のために必要に応じて）。
    1. 蓋の上部にカスタム組み立てサンプリングポート（2.5節）、または他のサンプリングポートを、すべてのコンポーネントでスピナーフラスコを組み立て、流出管がしっかりと（セクション2.1.4で説明）スピナーフラスコの内側に装着されていることを確認して、アタッチ。
    2. 自動で全体スピナーフラスコアセンブリを包みますテープを示すクラーベラップ材料、オートクレーブ。ラップが気密ていることを確認してください。注：アンラップ場合、インキュベーター内部チューブセットに非接続時にアルミニウム箔または類似の材料は、コネクタの無菌性を維持するためにバイオリアクターリッドの各アクセスポートの個々の端部をカバーするために使用できる/終了します。
    3. 媒体及び廃棄物貯蔵所の修正された蓋を組み立て、その後、それぞれのガラスボトルに取り付けます。テープを示すアルミ箔とオートクレーブを使用してそれらをカバーしています。
    4. 最終組み立てを支援するために、オートクレーブラップ、テープで - 個別チューブセット（2.5セクション2.2）をラップします。アルミニウム箔または類似の材料がアンラップ時/が終了コネクタの無菌性を維持するために、各チューブセットの個々の端部をラップするために使用することができます。
    5. 標準乾燥オートクレーブサイクルを使用して、すべてのラップされたアイテムをオートクレーブ（ 例えば 、「重力」〜で30分以上、121℃で15 psiの設定）。
      注：無菌接続しないでくださいオートクレーブの前にフィルターそれらはオートクレーブ安全であることが確認されていない限り。

4.スフェロイドの形成

注：この方法は、文献17に記載されたものと同様である-他の哺乳動物細胞培養のための52 - 19,21,50。滅菌後のすべての手順は、層流フード内で行われ、細胞培養のための無菌状態を維持するために、滅菌手袋を使用するべきです。

  1. すべての条件については、文化、十分な細胞量は、バイオリアクターの所望の数を播種するために得られるまで（ベンダーが記載されている）標準接着培養におけるβ-TC6細胞を展開します。
    1. 図1に示され、セクション2で説明したように、流出管との連続的な供給のバイオリアクターを組み立て、サンプリング蓋にサンプリングポートを接続します。注：流出チューブおよびサンプリングポートアセンブリはbioreactに追加されるべきです連続供給が開始されるまで、またはそれ以前のスフェロイド形成に連続的に供給するために、培養培地の外にプルアップする必要があります。
    2. （セクション3で説明）をオートクレーブによって変更SSBアセンブリを滅菌します。
    3. スピナーフラスコの蓋、中、廃棄物の船舶上の適切な場所に無菌の通気口（0.22ミクロン以下の無菌フィルター）を取り付けます。
      注：これは、ベーパーロックを防止することが重要であり、そしてインキュベーター（5％CO 2）環境とバイオリアクターとの間のガス交換を可能にします。ガス交換は、重炭酸塩緩衝化媒体を使用する場合、正しいpHを維持することが必要です。
  2. 2ための機械的撹拌によって補助室温で、（w / v）のトリプシン0.53 mMのEDTA溶液、0.25％を用いて穏やかなトリプシン処理によって細胞を集め- 3分、約1.3×10 6細胞/ mlの密度でバイオリアクターに播種200mLの培地です。
    1. インキュベーターの外に指定されたフラスコを移動し、バイオセーフティキャビネットに。
      注：すべての細胞培養および操作は、適切な滅菌技術を用いたバイオセーフティキャビネット内で行う必要があります。
    2. 吸引することにより、フラスコから培地を除去します。
    3. フラスコに、（++のCa ++又はMgなし）リン酸緩衝生理食塩水の5ミリリットルをピペット、および表面上の細胞を横切ってすすぐことにより細胞を洗浄し、その後PBSを吸引除去します。
    4. 収集される各フラスコにトリプシン-EDTA溶液3ml（典型的には約10倍の175cm 2のT-フラスコ）を追加します。
    5. バイオ安全キャビネットで3分 - 採取した細胞は、2室温でインキュベートすることを可能にします。
    6. フラスコの表面から細胞を緩め、そしてフラスコに（血清）培地を6mlを添加することにより細胞を収集し、50mlチューブに細胞を移すために、手で穏やかに攪拌します。 1 50mlのチューブが一杯になったときに必要な細胞のすべてが収集されるまで、別の50mlのチューブを使用して（約1 50mlチューブは、すべての5 T-175フラスコに必要とされます集めました）。
    7. 静かに細胞をペレットに（約50×重力）回収した細胞懸濁液を遠心してください。
    8. 無傷のペレットを残し、残りの培地を吸引除去します。
    9. 培地（血清含有）にペレットを再懸濁し、ピペットを使用して、同じチューブにすべてのペレットを転送することにより、単一のチューブ内のセルのすべてを収集します。
    10. 文献53に記載されているように、トリパンブルー染色による標準血球計数器を用いて細胞密度をカウントします。
    11. 各条件についてSSBを無菌する全細胞の所望の数を追加（1.3×10 6細胞/ mlは、このデモのために細胞密度を開始を目標としました）。
    12. （200mLの培養容量は、これらの研究に使用した）所望の総培養体積に到達するためにピペットを用いてSSBする（このケースでは、生理的範囲内で媒体グルコースレベルを使用し、所望のグルコース濃度）培地を加えます。
      注：これらの連続FED用SSBは、Cuを研究 ltures培養培地（100ミリグラム/デシリットル）の修正された「低血糖」バージョンを使用して播種しました。これは、培養物が所望の目標グルコース濃度で開始するのではなく、「高血糖」の媒体と給電を開始するために生理学的範囲にダウングルコースレベルをもたらすためにグルコース消費を待ってから始まることができました。これらの研究に供給するための他のすべての媒体が標準「高血糖」培地（500ミリグラム/ DL）を使用しました。
    13. 細胞培養インキュベーター内部の撹拌プレートに細胞をSSBを移動します。
  3. スフェロイドを形成できるようにするために、5％CO 2、相対湿度100％、70回転の撹拌速度で、37℃で3日間給餌することなくバイオリアクターにおける培養細胞。
    注：有意な増殖は3日間のスフェロイド形成の期間中に観察されないはずです。
  4. スフェロイドを形成した後、所望の培養条件でバイオリアクターの中でスフェロイドを分割。
ル "> 5。連続供給培養および調整後送り速度

  1. オートクレーブやガスは、全ての成分を滅菌し、無菌技術（ステップ2から4）を使用して、生物学的安全キャビネット内で組み立てます。
  2. スフェロイドを形成した後、インキュベーターからSSBを削除し、生物学的安全キャビネット内で連続供給システム用のコンポーネントを組み立てます。
    1. まず希望する培地で新鮮な媒体リザーバを記入してから、給電線の一方の側に接続します。また、新鮮な培地リザーバが適切に滅菌フィルターで通気されていることを確認してください。
    2. 無菌状態でバイオリアクターに供給入口ポートへの給電線の一方の側を接続します。滅菌フィルターは、バイオリアクターに入る前にメディアをフィルタリングするために供給ラインとバイオリアクターの入口ポートとの間に設置する必要があります。
    3. バイオリアクターの流出管と中廃棄物容器への廃液ラインを接続し、廃棄物容器が適切sterilで通気されていることを確認電子フィルタ。
  3. 生物学的安全キャビネットの外にアセンブリを移動（これはおそらく、血管やチューブのすべてを運ぶために2人が必要になります）、および長期培養のためのすべてのコンポーネントを出します。
    1. スフェロイド形成のための同じ培養パラメータを使用して培養器の内側撹拌プレート上にSSBを入れ（37°C、5％CO 2、100％湿度、70 RPM）。注：行がドアガスケットを介してインキュベータの側ではなく、外にスルーホールを実行する必要がある場合は、一時的にバイオリアクターから管セグメントを切断する必要があるかもしれません。これは、オートクレーブの前にアルミ箔（ステップ3）とチューブセットの端を包む、およびバイオリアクターは、インキュベータ内にあるまで、フィード、廃棄物管セクションのバイオリアクター側を接続するために待機することにより無菌の方法で行うことができます。チューブラインの場所に置くことができ、アルミニウム箔をインキュベーター内部を除去し、すぐにバイオリアクターに付着させることができます。
    2. （パススルー）インキュベーターのアクセスポートを介して外チューブセット（バイオリアクターリッドに接続されていないもの）の残りの端を実行するか、インキュベーターのドアガスケットのノッチを通して。
    3. （近くの生物学的安全キャビネットの中で可能な場合）インキュベーターの外では、すぐに新鮮な培地リザーバに供給ラインを接続し、メディア廃棄物容器に廃液ライン、および廃棄物容器が適切に滅菌フィルターで通気されていることを確認してください。注：、無菌の方法でこれを行うチューブと容器のコネクタからアルミ箔を除去し、（この接続はバイオセーフティキャビネットの外で実行する必要がある場合は特に）できるだけ迅速にそれぞれの容器に接続します。
    4. 近くのミニ冷蔵庫内（希望フィード培地で満たされた）新鮮な媒体リザーバを置きます。フィード、廃棄物ラインが閉鎖からそれぞれのドアを妨げることなくインキュベーターを終了し、冷蔵庫に入ることができることを確認してください。これは、フィードリットルということも重要ですINESは、冷蔵庫やインキュベーターのいずれかのドアによって閉じ挟まれていません。
      注：これらの研究のために使用される培地は、この細胞型のためのベンダが推奨する標準的な高グルコース（500ミリグラム/デシリットル）培養培地でした。任意の高グルコース培地は、培養される細胞型の特定のニーズに基づいて、使用することができます。供給システムは、合理的なフィード速度を維持しながら、培養物中の適切な血糖値を維持するために、高グルコース培地の供給速度を増加させることに依存しているように、フィード培地のグルコース濃度は、培養中の所望の濃度よりも（2倍以上）合理的に高くなければなりません。
    5. 次に、廃棄物媒体リザーバは、便利な場所にあるインキュベーター外の作業台の上に置くことができます。
    6. 次に、給電線がSSBに新鮮な培地容器から媒体を励起するように正しい向きを確保するポンプヘッドへの供給と廃棄物ラインの「ポンプ部」、および廃棄物のラインを配置SSBから、廃棄物媒体貯蔵に媒体を励起します。
  4. 希望の送り速度へのポンプの電源を入れます。
    1. 文献3および以下に提供代表的な結果のセクションに記載調整さ送り速度式を使用して送り速度を計算します。
    2. 培養中の所望のグルコース濃度を維持するために必要な供給量を推定するために、成長予測とともに、最新のセル数情報（ステップ5に記載された手順）を使用し、培地のグルコースの測定。
      注：細胞成長率とグルコース消費速度は、これらの手順を実行する前に得ることが必要になります。
    3. 計算された送り速度に基づいて、ポンプ速度を設定します。
  5. （記載されている方法のために3日ごとに）送り速度の計算を繰り返し、各サンプリングポイントのためにポンプ速度を調整します。

6.細胞数、生存率、およびグルコース濃度の測定値

<オール>
  • 3日ごとに、各バイオリアクターからのサンプルを収集し、又は所望のように。
  • ポートは、上記特殊なサンプリングを使用して連続的に供給SSB培養物から培養サンプルを取ります。
    1. バイオリアクターの内部に連続的に供給SSBを残して、サンプリングポートの未ろ過接続に（5ミリリットルの容量の注射器は、これらの研究のために使用された）無菌注射器を取り付けます。
    2. 培養培地中にダウンサンプリングチューブを移動します。
    3. シリンジに行くチューブセクションをアンクランプし、所望の全サンプル体積を撤回。
    4. それはもはや文化の中に沈められるようにサンプリングチューブを上に移動しない、と空気が除去されるまで、シリンジを撤回し続けています。
    5. 注射器を供給管をクランプし、サンプルを含む注射器を取り外し、脇に置き。
    6. 空気と第二の新鮮な無菌の注射器を事前にロードし、サンプリングポートの滅菌フィルター側に取り付けます。
    7. のシリンジフィルター側に行くチューブのクランプを解除次いで、サンプリングポート、および穏やかに滅菌フィルターを介して注射器内の空気を排出することにより、サンプリングポートをパージします。これは、サンプリングポートは、任意の残留培地のは明らかであろうことを保証します。
    8. 、フィルタに行くチューブを再クランプ無菌注射器を外して、それを捨てます。
  • 培養物からの細胞サンプルが含まれている注射器を取り、10 mlチューブにそれを追放します。既知の体積のサブサンプルを、このチューブから直接取得することができます。
  • 細胞計数のために、細胞の既知のボリュームを削除し、マイクロ遠心チューブに移し、穏やかに1遠心する - 2分（約50×重力）。
  • グルコース測定のために別のチューブに上清を移し、トリプシン-EDTA溶液の同一量（0.25％（w / v）のトリプシン、0.53mMのEDTA）に再懸濁ペレットとを有する標準的な血球計を用いて三重にカウント文献53に記載されているようにトリパンブルー染色。
    1. に培地を（血清を含む）を追加します必要に応じて希釈用のサンプル。
    2. 細胞を計数し、生の（未染色）細胞を記録することによって、細胞の生存率を計算し、そして独立して死んだ（染色）細胞（生存率％=生細胞/総細胞）。
  • 血糖計及び使い捨て試験ストリップを使用して三連で培地のグルコース濃度を測定します。
    1. 血液のための培養培地を置換グルコース計命令で説明したように、グルコース測定を行います。
    2. （上記のカウントサンプルから収集）試験すべき媒体中のテストストリップを浸し、そして複製の所望の数（3つの複製が推奨されている）のために繰り返します。
    3. グルコース濃度のために新鮮な培地と廃培地の両方をテストします。
      注：一部の計器は、測定値がより低い20ミリグラム/デシリットル（メーターの検出閾値）、計出力の誤差として観察することができます。

    • 7.スフェロイド沈降速度測定

    1. そのセルを確保するために、L個のクラスターが、連続供給システムによって除去されていない、大口径のプラスチックピペットでそれらの沈降を観察することによりβ-TC6スフェロイドの沈降速度を測定します。
    2. 上記のようにSSBバイオリアクターにおける培養β-TC6細胞を、スフェロイドを形成します。
    3. 培養の3日後、50mlチューブに回転楕円体の懸濁液と場所30mlのサンプルを取ります。
    4. 静かにアップピペットとサスペンションに均等に分配するために広い直径25ミリリットルピペットを使用してダウンし、ピペットで既知のレベル（ 例えば、20ミリリットルのマーク）で懸濁液をピペット操作を停止し、その後にスフェロイドのすべての時間を記録します5センチ落ち着きます。
    5. 統計的信頼を達成するには、この手順を十分な回数を繰り返して（通常のn> 3）。
      注：生物学的研究のために、0.05未満のp値は、測定値を比較するときに、統計的に有意であると考えられます。平均の標準誤差は、報告エラーのために使用された、と2は未対応のあるスチューデント-t検定を尾行します提示されたデータのための条件を比較しました。

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    結果

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    ミディアムグルコースレベルと変動が標準SSB培養における細胞増殖を制限します

    グルコース濃度は培養期間3を通して静置培養し、SSB培養で変動します。これらの変動は、21日間の培養期間中の細胞数の増加に伴って強化し、静的およびSSB培養物の両方においてほぼ同じでした。これらの観察は、我々の以前の出版物3に示されています。血糖値は、両方の方法のための培養期間の持続時間の超生理学的であることができます。この慢性暴露は、細胞増殖54を阻害することができるので、連続供給システムは、グルコース変動を排除し、スフェロイド培養中の栄養管理を改善するために開発されました。

    スフェロイド培養のための連続供給システム

    継続的に新鮮な培地を添加し、培養期間中の古い培地を除去単純な培地補充システムを用いて達成することが...

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    ディスカッション

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    58 -生物学的薬剤の製造のための、および細胞治療のために哺乳動物細胞産物の生成は、大規模での哺乳動物細胞55の文化と監視が必要です。さらに、これらのアプリケーションは、定義され、検証された培養条件を求めます。単純にこれらの要件のすべてを満たしていないであろう研究技術を用いて細胞の量を増加させます。栄養素や老廃物の蓄積の変動を引き起こすマニュアルの媒体の変更は、細胞質、生存率および収量を減らします。バイオリアクターの使用は、生物医薬用途のための微生物の商業的培養のために確立され、同様の戦略は、哺乳動物細胞培養物に適用されています。それらの環境と、哺乳動物細胞の複雑な相互作用は、細胞増殖の可能性を最適化するために、栄養素のレベルを調節するために特定の変更を必要とします。

    これらの問題に対処するために、我々はstraightfoを開発しました変動金利灌流送り機構と攪拌懸濁液バイオリアクター内の生理学的レベルを近似する、特定の目標範囲内にグルコースレベルを維持するrward方法。これを達成するために、β細胞株のスフェロイ...

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    開示事項

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    著者らは開示するものは何もない。

    謝辞

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    著者は、有益なコメントをいただいたMichael Garwood氏とSam Stein氏、そして原稿の準備を手伝ってくれたKristen M. Maynard氏に感謝します。

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    材料

    この記事で使用された材料の一覧
    名前会社カタログ番号コメント
    βTC-6細胞ATCC、マナッサス、VACRL-11506マウスインスリノーマ細胞株(接着細胞型)
    DPBSいいえCa、No MgInvitrogen、カールスバッド、CA14190-144https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144?ICID=search-14190144
    >Dulbecco's Modified Eagles MediumInvitrogen, Carlsbad, CA製品番号については以下を参照してください 
    DMEM High Glucose (500 mM)Invitrogen, Carlsbad, CA11965-092http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092
    DMEM Low Glucose (100 mM)Invitrogen, Carlsbad, CA11885-084http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084(この培地にはすでにピルビン酸が含まれていることに注意してください)
    >L-glutamineInvitrogen, Carlsbad, CA25030081http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-product
    ピルビン酸ナトリウムInvitrogen, Carlsbad, CA11360070https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070?ICID=search-product
    Heat Inactivated Burcine SerumGibco - Life Technologies10082147http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147
    Trypsin-EDTAInvitrogen, Carlsbad, CA25200056https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056?ICID=search-product
    T-150 組織培養処理フラスココーニング, コーニング, NY430825http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(Lifesciences)
    &categoryname=
    NuAire細胞培養インキュベーターミネソタ州US Autoflow.ウォータージャケット付きのCO2調整細胞培養インキュベーターであれば、どれでも使用できます。
    遠心分離機Sorvall RT 7 (同様の卓上型遠心分離機を使用できます)
    冷蔵庫任意の実験室用冷蔵庫を使用できます (これらの研究では、小さな卓上型バージョンが使用されました)
    1 L ガラス瓶Corning, Corning, NY1395-1Lどのベンダーも使用できます。 http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L(Lifesciences)
    &categoryname=
    2 L ガラス瓶コーニング, コーニング, NY1395-2Lどのベンダーでも使用できます
    250 ml 攪拌バイオリアクター コーニング、コーニング、ニューヨーク4500-250http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(ライフサイエンス)
    &categoryname=
    攪拌板フィッシャーサイエンティフィック11-496-104A任意のインキュベーターの安全な攪拌板を使用でき、どのベンダーでも使用できます
    組織培養皿 直径100 mmヌンク、ロチェスター、ニューヨーク(フィッシャーサイエンティフィック)1256598 任意のベンダーを使用できます(Fisher Sciを通じて注文)
    FALCON 50 ml Conical TubesFalcon, San Jose, CA1256598Any vendor could be used
    to custom partsMcMaster CarrVariousどれでも使用できますが、Deranはオートクレーブで安全で、非反応性で、加工が容易なため、Deranが選択されています。
    蓋用 http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac ステンレス鋼パイプMcMaster CarrVarious任意のベンダーを使用できます。
    http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91 連続供給用のカスタム改変デルランバイオリアクター蓋カスタムメイド同様の製品を製造しているベンダーを認識していません
    連続供給用のカスタム改質ガラス瓶蓋カスタムメイド一部のベンダー(例:、Fischer Sci、Corning)は、以下のリンクで同様の製品を製造しています。
    Masterflex デジタル蠕動ポンプCole Parmer, Vernon Hills, ILEW-77919-25任意の精密蠕動ポンプを使用できます。 http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_
    Cartridge_Pump_System_115_230
    _VAC/EW-77919-25
    PVDF Tubing Connectors (various)Cole Parmer, Vernon Hills, ILリンク参照どのベンダーでも使用できます。 http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium
    _Luer_Fittings/55889
    Pharmed BPT Tubing L/S 16Cole Parmer, Vernon Hills, ILWU-06508-16任意のベンダーを使用できます。http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
    _L_S_13_25/WU-06508-16
    Pharmed BPT Tubing L/S 14Cole Parmer, Vernon Hills, ILWU-06508-14Any vendors could be used . http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
    _L_S_13_25/WU-06508-14
    Pharmed BPT Tubing L/S 13Cole Parmer, Vernon Hills, ILWU-06508-13Any vendor could be used . http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing
    _L_S_13_25/WU-06508-13
    ミリポアMillex GP PESメンブレン0.22µl 滅菌シリンジフィルター(ベントおよび中ろ過に使用)フィッシャーサイエンティフィSLGP033RS任意のベンダーを使用可能
    25 ml 目盛り付きピペットフィッシャーサイエンティフィック13-678-11任意のベンダーを使用でき、さまざまなサイズを使用可能
    ピペッターッシャーサイエンティフィック13-681-15E任意のベンダー、または類似の製品を使用可能
    血球計算盤フィッシャーサイエンティフィック02-671-6任意のベンダー、または同様の製品を使用できます
    Trypan BlueGibco - Life Technologies15250-061任意のベンダー、または同様の製品を使用できます。
    https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061 倒立型光学顕微鏡ライカ任意のベンダー、または同様の製品を使用できます
    ワンタッチウルトラ血糖値計フィッシャーサイエンティフィック22-029-293任意のベンダー、または同様の製品を使用できます(例:、バイエル)
    ワンタッチウルトラストリップフィッシャーサイエンティフィック22-029-292 任意のベンダー、または同様の製品を使用できます(例:、バイエル)
    プリンストン の 材料は カスタムックフィ

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