方法論記事

IRE / IRP例：RNA - タンパク質相互作用の研究のための電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）

DOI：

10.3791/52230

⸱

2014年12月3日

 ,  , 
1Lady Davis Institute for Medical Research, Jewish General Hospital, 2Department of Medicine, McGill University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、RNA /タンパク質相互作用を分析するためのプロトコルを提示する。電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）は、ネイティブゲル電気泳動中のRNA /タンパク質複合体および遊離RNAの差動移動に基づいている。放射性標識RNAプローブを用いて、RNA /タンパク質複合体は、オートラジオグラフィーによって可視化することができる。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA /タンパク質相互作用は、転写後の調節経路に重要である。最もよく特徴付け細胞質ゾルRNA結合タンパク質のうち鉄調節タンパク質 、IRP1及びIRP2がある。彼らは、それによってmRNAの翻訳や安定性​​を制御する、いくつかの標的mRNAの翻訳領域（UTR）内の応答要素（IRES）を鉄に結合する。 IRE / IRP相互作用は広くEMSAによって研究されている。ここでは、他のRNA結合タンパク質の活性を評価するために一般化することができるIRP1及びIRP2のIRE結合活性を分析するためのEMSAプロトコルを記述する。 RNA結合タンパク質、またはこのタンパク質の精製調製物を含む粗タンパク質溶解物を、複合体形成を可能にする、32 P標識したRNAプローブの過剰と共にインキュベートする。ヘパリン結合プローブする非特異的タンパク質を排除するために添加される。その後、混合物をポリアクリルアミドゲル上で非変性電気泳動によって分析される。遊離プローブRNA /タンパク質複合体の展示遅滞モビリティながら、高速で移動し、。したがって、手順​​は、「ゲル遅延」または「バンドシフト」アッセイと呼ばれている。電気泳動終了後、ゲルを乾燥させ、RNA /タンパク質複合体、ならびに遊離プローブは、オートラジオグラフィーによって検出される。プロトコルの全体的な目標は、IRE / IRP及び他のRNA /タンパク質相互作用を検出および定量化することである。また、EMSAも調査中のRNA /タンパク質相互作用の特異性は、結合親和性、および化学量論を決定するために用いることができる。

概要

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EMSAは、もともとの標的DNA配列1,2-有するDNA結合タンパク質の結合を研究するために開発された。原理は、この記事の焦点であるRNA /タンパク質相互作用3、についても同様である。簡単に言えば、RNAが負に帯電され、ポリアクリルアミド（またはアガロース）ゲル中で非変性電気泳動中に陽極に向かって移動します。ゲル内の移行は、その電荷に比例する、RNAのサイズに依存します。 RNAへのタンパク質の特異的結合は、その機動性を変化させ、そして複合体は、無料のRNAに比べてゆっくりと移動。これは主に、分子量の増加だけでなく、電荷およびおそらく立体配座の変化によるものである。プローブとして標識されたRNAを利用する「ゲル遅延」や「バンドシフト」の容易な監視を可能にする。 32 P標識RNAプローブの使い方は非常に一般的であり、高感度を提供しています。 RNA /タンパク質複合体および遊離RNAの移行が検出されるオートラジオグラフィーによる。欠点は、放射能の仕事、および潜在的なバイオセーフティの懸念のための放射能のライセンスとインフラの要件、32 P（14.29日）の半減期が短いことによる放射線分解へのプローブの品質の漸進的な劣化である。したがって、RNAプローブを標識するための代替の非同位体の方法は、蛍光または化学発光イメージング4,5による検出を可能にする蛍光団又はビオチン、とのインスタンスのために、開発されてきた。これらの方法の限界は、同位体標識、およびRNA /タンパク質相互作用を妨害するための非同位体標識の可能性と比較してより高いコストと多くの場合減少した感受性である。非変性ポリアクリルアミドゲルは、ほとんどのEMSAの用途に適していると一般的に使用される。機会に、アガロースゲルは、大きな複合体の分析のための代替手段をもたらすことができる。

EMSAの主な利点は、シンプルさ、感度、および堅牢性4を組み合わせたということです</ SUP>。アッセイは、数時間以内に完了することができ、洗練された機器を必要としません。 RNA /タンパク質相互作用は、0.1 nMもしくはそれ未満という低い濃度でEMSAによって検出され、結合条件（pHは4.0から9.5、一価の塩濃度が1から300 mMの、温度0から60°C）の広い範囲にすることができる。

RNA /タンパク質複合体の形成はまた、フィルター結合アッセイによって研究することができる。フリーRNAプローブ6を通過する間に、これは、ニトロセルロースフィルターでRNA /タンパク質複合体の保持に基づいて、簡単、迅速、かつ安価な手順である。 EMSAと比較して、そのRNAプローブは複数の結合部位が含まれているか、または粗抽出物は、同じ部位でプローブと結合する二つ以上のRNA結合タンパク質を含む場合には制限されている。複数のRNA /タンパク質相互作用は、フィルター結合アッセイによる検出を免れるであろうが、それらは容易にEMSAによって可視化することができる。いくつかのケースでは、可視化は前夜ですn個の可能な場合、ゲル上でさらに位相差を生じ、EMSA反応のRNA結合タンパク質のいずれかに対する抗体を添加することによって共移行（例えば、ヒトIRP1 / IRE及びIRP2 / IRE複合体）は、2つのRNA /タンパク質複合体（ 「スーパーシフト」）7。

EMSAは、広く鉄代謝8-10の転写後調節因子である、IRP1及びIRP2を研究するために使用されてきた。彼らはいくつかのmRNA 11のUTRを内のIRE、系統発生的に保存されたヘアピン構造に結合することによって作動する。 IREは、最初フェリチン12及びトランスフェリン受容体1（TfR1）13、それぞれ鉄貯蔵および取り込み、タンパク質をコードするmRNAで発見された。その後、IRESは赤血球固有のアミノレブリン酸シンターゼ （ALAS2）14、ミトコンドリアのアコニターゼ15、フェロポーチン16、 二価金属トランスポーター1（DMT1）17、低酸素誘導因子2で発見されたM>α（HIF2α）18、および他のmRNA 19-21。 UTR「TfR1のmRNAはその3で複数のIREが含まれていますが、UTR「プロトタイプH-およびL-フェリチンmRNAは、それらの5で1 IREが含まれている。 IRE / IRPの相互作用は、具体的には、立体的に43Sリボソームサブユニットの関連付けをブロックすることによりフェリチンmRNAの翻訳を阻害。また、それらは、エンドヌクレアーゼ的切断に対してTfR1 mRNAを安定化する。 IRP1及びIRP2を共有広範な配列類似性と鉄飢餓細胞で高IRE-結合活性を示す。 IRP2がプロテアソーム分解を受けながら鉄充実した細胞では、IRP1は、そのIRE結合活性を犠牲にして細胞質ゾルアコニターゼに変換キュバンのFe-Sクラスターを組み立てる。従って、IRE / IRP相互作用は、細胞の鉄の状態に依存するだけでなく、そのようなH 2 O 2、一酸化窒素（NO）または低酸素症のような他の信号によって調節される。ここでは、Eによって粗細胞および組織抽出物からIRE結合活性を評価するためのプロトコルを記述しMSA。我々は、IRE配列が元々下流T7 RNAポリメラーゼ部位のセンス方向に導入されたプラスミドのDNAテンプレート（I-12.CAT）からのインビトロ転写によって生成した32 P標識H-フェリチンIREプローブを使用アニーリングした合成オリゴヌクレオチド22のクローニング。

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プロトコル

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マウスを用いた実験手順は、マギル大学（プロトコル4966）の動物実験委員会によって承認された。

培養細胞からのタンパク質抽出物の調製

  1. 氷冷したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）10mlで二回培養された細胞を洗浄する。
  2. ラバーポリスまたは1.5 mlマイクロ遠心チューブに氷冷PBS、転送懸濁液1ml中にプラスチック製のセルスクレイパーのいずれかで付着細胞をこすり。
  3. 4℃で700×gで5分間のマイクロ遠心でスピン、。吸引するPBS。
  4. 10 7個の細胞あたりの氷冷細胞質溶解バッファー（ 表1）の100μlのを追加し、上下にピペット。
  5. 20分間氷上でインキュベートする。
  6. 4℃での微量遠心で最高速度で10分間スピン。
  7. ペレットを捨てる。新しい1.5 mlマイクロチューブに上清を移し、氷上に保つ。
  8. DETブラッドフォードアッセイ23を使用して- （を10μg/μL通常1）アーミンタンパク質濃度。
  9. 使用するまで-80℃でアリコートと店舗細胞抽出物。

マウス肝臓および脾臓からのタンパク質抽出物の調製

  1. CO 2吸入でマウスを安楽死させる。
  2. 解剖ボード上のきれいなパッドの上に安楽死させた動物を置きます。はさみで腹部を開きます。
  3. ハサミとピンセットを使用して、肝臓および脾臓を分析し、およそ50 mlの氷冷PBSで各組織をすすぐ。
  4. すぐにメスで小片に組織をカットし（例：約1〜2ミリメートル3）。
  5. 遅滞なく、新鮮なクライオチューブ内の組織の作品を配置した後、液体窒素でそれらを凍結スナップ。ストアスナップ凍結組織のアリコートを-80℃で使用するまで。
  6. の0.25〜0.5ミリリットルに- （2〜3約1）凍結組織の一枚を均質化する10秒間、組織ホモジナイザーを氷冷細胞溶解緩衝液（ 表1）。
  7. 20分間氷上で1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブと寒さにホモジネートを転送します。
  8. 4℃での微量遠心で最高速度で10分間スピン。
  9. ペレットを捨て、新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに上清を移す。氷の上に保管してください。
  10. ブラッドフォードアッセイ23を使用して- （を10μg/μL通常1）タンパク質濃度を決定します。
  11. 使用するまで-80℃でアリコートと店舗細胞抽出物。

放射標識IRE-プローブの調製

  1. 制限エンドヌクレアーゼXbaIで（プラスミドのμg当たり1 U）、IRE配列の下流を切断すると、1時間37℃でインキュベートすることにより、IRE-含むプラスミドI-12.CAT 22を線形化する。線状化したプラスミドをインビトロ転写の鋳型として使用される。
  2. セットアップnは全量20μlのin vitro転写反応において 。 表2に示したストック溶液を使用して追加します。1μlの線形化されたプラスミド鋳型、4μlの転写緩衝液; ATP / CTP / GTPミックス1μlのミックス、10μlの[α-32 P] -UTP、2μlのジチオスレイトール、1μlのRNase阻害剤と1μlのT7 RNAポリメラーゼ。ピペッティングにより混和する。
  3. 1時間24 40℃でインキュベートする。

放射標識IRE-プローブ4.精製

  1. ピペッティングにより、0.5M EDTA、pH8のミックスを1μlを追加することによって、 インビトロ転写反応を終了します。
  2. より良い沈殿のためのキャリアとして、10 mg / mlのtRNAの10を添加する。ピペッティングにより混和する。
  3. 3 M酢酸アンモニウムの82.5を添加する。ボルテックスで混ぜる。
  4. エタノールの273を添加する。ボルテックスで混ぜる。
  5. 室温で5分間立ってみましょう。
  6. RTで微量全速で10分間スピン。上清を捨てる。
  7. ウォッシュは、70％エタノール100μlのペレット。
  8. RTで微量全速で10分間スピン。上清を捨てる。
  9. 10分間空気乾燥ペレット。
  10. 二回蒸留、以前にオートクレーブし、H 2 O100μlの再懸濁ペレット
  11. 使用するまで-80℃で液体シンチレーションカウンターで放射能、アリコートの放射性標識IREプローブおよびストアを定量化する。凍結アリコートを、3週間まで使用することができる。

EMSAのネイティブポリアクリルアミドゲルの5準備

  1. 1.5ミリメートルスペーサーと櫛を使用してゲル（16×16 cm）を組み立てます。
  2. 表3に示したストック溶液を使用し、6％未変性ポリアクリルアミドゲルを調製するために、7.5ミリリットルの40％アクリルアミドミックス：ビスアクリルアミド、5×TBE 5mlの37.5ミリリットル二重蒸留H 2 O
  3. 10％の新たに調製された過硫酸アンモニウム（APS）と25μlのテトラメチルエチレンジアミン（TEMED）の0.5ミリリットルを追加します。
  4. すぐにゲルへのアクリルアミド溶液を注ぎ、それが重合してみましょう。約30分間待ちます。
  5. ゲル電気泳動装置を組み立て、0.5×TBEでタンクを記入し、電源に接続します。

6.電気泳動移動度シフトアッセイ

  1. 10μlの（より低いタンパク質濃度を用いてもよい）で総体積細胞溶解緩衝液（ 表1）を用いて細胞または組織からのタンパク質抽出物25μgを希釈する。氷の上に保管してください。必要に応じて、11μlの追加：25：4を休眠IRP1（最終濃度2％）を活性化するために2-メルカプトエタノール（2-ME）で希釈した。
  2. 二重蒸留H 2 O 200,000 CPM /μL、95℃での熱変性に放射性標識されたIREプローブを希釈する1分間のCと、少なくとも5分間、室温で冷却。
  3. タンパク質抽出物に放射性標識されたIREプローブの1μLを添加することにより、EMSA反応をセットアップします。
  4. 室温で20分間インキュベートする。
  5. （プローブ9との非特異的タンパク質相互作用を阻害するために）、さらに10分間インキュベーションを継続し、反応を50 mg / mlのヘパリンの1μlを添加する。 -80℃でストックヘパリンの溶液（50mg / ml）とストアを分注し。
  6. 長い放射性標識プローブ（> 60ヌクレオチド）を使用する場合、1μlのRNase T1（1 U /μl）を追加し、室温で10分間インキュベートしたプローブへの非特異的タンパク質結合を減少させるため、およびRNA /タンパク質の良好な分離を可能にする電気泳動中に複雑。
  7. ローディングバッファー（80％グリセロール+ブロモフェノールブルー）の3μl加え、混ぜると、6％非変性ポリアクリルアミドゲル上にロード。
  8. 130 V（5 V / cm）ので60分間ゲルを実行します。
  9. Transfer大きな濾紙上に乾燥ゲル。
  10. フィルムに露出させ、オートラジオグラフィーを開発しています。露光時間は、1時間（あるいはそれ以下）からO / Nまでの範囲であり得る。

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結果

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プロトコルのセクション3と4で説明したように、放射性標識IREプローブを調製した。プローブの配列は、5'-GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC CUG C UUCAA C AGUGC UUGGA CGGAUCCU-3」だった。太字のヌクレオチドは、重要な特徴であるIRE不対C残基およびループを表す。プローブの比放射能は、RNAの4.5×10 9 CPM /μgのだった。

IRE結合活性に対する鉄の摂動の効果を評価するために、マウスRAW264.7マクロファージは、未処理のまま、またはヘミン（鉄源）またはデスフェリオキサミン（鉄キレート剤）で処理した。溶解物を調製し、IREプローブ（8000のcpm /μgタンパク質）でEMSAにより分析した。代表的なデータは、それぞれ、左お ​​よび右のパネル上のオートラジオグラムの短い及びより長い曝露で、 図1に示されている。マウスIRE / IRP1とIRE / IRP2複合体は、異なるモビリ...

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ディスカッション

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ここで、我々はIRP1及びIRP2のIRE-結合活性を研究するために開発されたプロトコルを記述し、我々は代表的なデータを示している。異なるプローブを使用することによって、このプロトコルは、他のRNA結合タンパク質の研究のために調整することができる。重要なステップは、プローブのサイズです。正確な結合部位が不明な場合に共通している長いプローブの使用方法は、無料のRNAとは異なる方法で移行しないRNA /タンパク質複合体になることができます。この場合には、RNアーゼT1（ ステップ6.6）での処理によって結合していないRNAを除去することが望ましい。プローブの質も非常に重要である。最良の結果は、新たに調製した放射性標識されたRNAを用いて得られる。ゲル精製10は必要ではないが、（無RNアーゼT1消化ステップが含まれていない場合）は、プローブを調製するためのインビトロ転写反応は、早期終結産物が得られた場合EMSAの外観を改善することができる。ネイティブゲル電気泳動速すぎメートルを実行するyのRNA /タンパク質複合体の解離をもたらし、ファジーバンドが生じることがあり、過熱...

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開示事項

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この作業は、Canadian Institutes for Health Research（MOP-86514）からの助成金によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ロイペプチンSIGMA L2884
PMSFSIGMA78830
BioRad Protein AssayBIORAD500-0006
T7 RNA ポリメラーゼThermoscientificEPO111
RNase InhibitorInvitrogen15518-012
UTP [alpha-32P]Perkin-Elmer
シンチレーション液体ベックマン・コールター141349
ヘパリンSIGMAH0777
Rnase T1ThermoscientificEN0541
機器
組織破裂器Qiagen9001271
シンチレーションカウンターベックマン・コールターLS6500
Protean II xi CellBIORAD165-1834
20 ウェルコームBIORAD165-18681.5
mm スペーサーBIORAD165-1849
PowerPacBIORAD164-5070
NEG507H名 厚さ

参考文献

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RNA

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