IRE / IRP例：RNA - タンパク質相互作用の研究のための電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）

EMSAは、もともとの標的DNA配列^1,2-有するDNA結合タンパク質の結合を研究するために開発された。原理は、この記事の焦点であるRNA /タンパク質相互作用^3、についても同様である。簡単に言えば、RNAが負に帯電され、ポリアクリルアミド（またはアガロース）ゲル中で非変性電気泳動中に陽極に向かって移動します。ゲル内の移行は、その電荷に比例する、RNAのサイズに依存します。 RNAへのタンパク質の特異的結合は、その機動性を変化させ、そして複合体は、無料のRNAに比べてゆっくりと移動。これは主に、分子量の増加だけでなく、電荷およびおそらく立体配座の変化によるものである。プローブとして標識されたRNAを利用する「ゲル遅延」や「バンドシフト」の容易な監視を可能にする。 ³² P標識RNAプローブの使い方は非常に一般的であり、高感度を提供しています。 RNA /タンパク質複合体および遊離RNAの移行が検出されるオートラジオグラフィーによる。欠点は、放射能の仕事、および潜在的なバイオセーフティの懸念のための放射能のライセンスとインフラの要件^、32 P（14.29日）の半減期が短いことによる放射線分解へのプローブの品質の漸進的な劣化である。したがって、RNAプローブを標識するための代替の非同位体の方法は、蛍光または化学発光イメージング^4,5による検出を可能にする蛍光団又はビオチン、とのインスタンスのために、開発されてきた。これらの方法の限界は、同位体標識、およびRNA /タンパク質相互作用を妨害するための非同位体標識の可能性と比較してより高いコストと多くの場合減少した感受性である。非変性ポリアクリルアミドゲルは、ほとんどのEMSAの用途に適していると一般的に使用される。機会に、アガロースゲルは、大きな複合体の分析のための代替手段をもたらすことができる。

EMSAの主な利点は、シンプルさ、感度、および堅牢性^4を組み合わせたということです^</ SUP>。アッセイは、数時間以内に完了することができ、洗練された機器を必要としません。 RNA /タンパク質相互作用は、0.1 nMもしくはそれ未満という低い濃度でEMSAによって検出され、結合条件（pHは4.0から9.5、一価の塩濃度が1から300 mMの、温度0から60°C）の広い範囲にすることができる。

RNA /タンパク質複合体の形成はまた、フィルター結合アッセイによって研究することができる。フリーRNAプローブ⁶を通過する間に、これは、ニトロセルロースフィルターでRNA /タンパク質複合体の保持に基づいて、簡単、迅速、かつ安価な手順である。 EMSAと比較して、そのRNAプローブは複数の結合部位が含まれているか、または粗抽出物は、同じ部位でプローブと結合する二つ以上のRNA結合タンパク質を含む場合には制限されている。複数のRNA /タンパク質相互作用は、フィルター結合アッセイによる検出を免れるであろうが、それらは容易にEMSAによって可視化することができる。いくつかのケースでは、可視化は前夜ですn個の可能な場合、ゲル上でさらに位相差を生じ、EMSA反応のRNA結合タンパク質のいずれかに対する抗体を添加することによって共移行（例えば、ヒトIRP1 / IRE及びIRP2 / IRE複合体）は、2つのRNA /タンパク質複合体（ 「スーパーシフト^」）7。

EMSAは、広く鉄代謝^8-10の転写後調節因子である、IRP1及びIRP2を研究するために使用されてきた。彼らはいくつかのmRNA ¹¹のUTRを内のIRE、系統発生的に保存されたヘアピン構造に結合することによって作動する。 IREは、最初フェリチン¹²及びトランスフェリン受容体^{1（TfR1）13、}それぞれ鉄貯蔵および取り込み、タンパク質をコードするmRNAで発見された。その後、IRESは赤血球固有のアミノレブリン酸シンターゼ ^{（ALAS2）14、}ミトコンドリアのアコニターゼ^15、フェロポーチン^16、 二価金属トランスポーター^{1（DMT1）17、}低酸素誘導因子2で発見されたM>α（HIF2α）18、および他のmRNA ^19-21。 UTR「TfR1のmRNAはその3で複数のIREが含まれていますが、UTR「プロトタイプH-およびL-フェリチンmRNAは、それらの5で1 IREが含まれている。 IRE / IRPの相互作用は、具体的には、立体的に43Sリボソームサブユニットの関連付けをブロックすることによりフェリチンmRNAの翻訳を阻害。また、それらは、エンドヌクレアーゼ的切断に対してTfR1 mRNAを安定化する。 IRP1及びIRP2を共有広範な配列類似性と鉄飢餓細胞で高IRE-結合活性を示す。 IRP2がプロテアソーム分解を受けながら鉄充実した細胞では、IRP1は、そのIRE結合活性を犠牲にして細胞質ゾルアコニターゼに変換キュバンのFe-Sクラスターを組み立てる。従って、IRE / IRP相互作用は、細胞の鉄の状態に依存するだけでなく、そのようなH ₂ O _2、一酸化窒素（NO）または低酸素症のような他の信号によって調節される。ここでは、Eによって粗細胞および組織抽出物からIRE結合活性を評価するためのプロトコルを記述しMSA。我々は、IRE配列が元々下流T7 RNAポリメラーゼ部位のセンス方向に導入されたプラスミドのDNAテンプレート（I-12.CAT）からのインビトロ転写によって生成した³² P標識H-フェリチンIREプローブを使用アニーリングした合成オリゴヌクレオチド²²のクローニング。

マウスを用いた実験手順は、マギル大学（プロトコル4966）の動物実験委員会によって承認された。

培養細胞からのタンパク質抽出物の調製

1. 氷冷したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）10mlで二回培養された細胞を洗浄する。
2. ラバーポリスまたは1.5 mlマイクロ遠心チューブに氷冷PBS、転送懸濁液1ml中にプラスチック製のセルスクレイパーのいずれかで付着細胞をこすり。
3. 4℃で700×gで5分間のマイクロ遠心でスピン、。吸引するPBS。
4. 10 ⁷個の細胞あたりの氷冷細胞質溶解バッファー（ 表1）の100μlのを追加し、上下にピペット。
5. 20分間氷上でインキュベートする。
6. 4℃での微量遠心で最高速度で10分間スピン。
7. ペレットを捨てる。新しい1.5 mlマイクロチューブに上清を移し、氷上に保つ。
8. DETブラッドフォードアッセイ^23を使用して- （を10μg/μL通常1）アーミンタンパク質濃度。
9. 使用するまで-80℃でアリコートと店舗細胞抽出物。

マウス肝臓および脾臓からのタンパク質抽出物の調製

1. CO ₂吸入でマウスを安楽死させる。
2. 解剖ボード上のきれいなパッドの上に安楽死させた動物を置きます。はさみで腹部を開きます。
3. ハサミとピンセットを使用して、肝臓および脾臓を分析し、およそ50 mlの氷冷PBSで各組織をすすぐ。
4. すぐにメスで小片に組織をカットし（例：約1〜2ミリメートル^3）。
5. 遅滞なく、新鮮なクライオチューブ内の組織の作品を配置した後、液体窒素でそれらを凍結スナップ。ストアスナップ凍結組織のアリコートを-80℃で使用するまで。
6. の0.25〜0.5ミリリットルに- ^（2〜3約1）凍結組織の一枚を均質化する10秒間、組織ホモジナイザーを氷冷細胞溶解緩衝液（ 表1）。
7. 20分間氷上で1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブと寒さにホモジネートを転送します。
8. 4℃での微量遠心で最高速度で10分間スピン。
9. ペレットを捨て、新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに上清を移す。氷の上に保管してください。
10. ブラッドフォードアッセイ^23を使用して- （を10μg/μL通常1）タンパク質濃度を決定します。
11. 使用するまで-80℃でアリコートと店舗細胞抽出物。

放射標識IRE-プローブの調製

1. 制限エンドヌクレアーゼXbaIで（プラスミドのμg当たり1 U）、IRE配列の下流を切断すると、1時間37℃でインキュベートすることにより、IRE-含むプラスミドI-12.CAT ^22を線形化する。線状化したプラスミドをインビトロ転写の鋳型として使用される。
2. セットアップnは全量20μlのin vitro転写反応において 。 表2に示したストック溶液を使用して追加します。1μlの線形化されたプラスミド鋳型、4μlの転写緩衝液; ATP / CTP / GTPミックス1μlのミックス、10μlの^[α-32 P] -UTP、2μlのジチオスレイトール、1μlのRNase阻害剤と1μlのT7 RNAポリメラーゼ。ピペッティングにより混和する。
3. 1時間²⁴ 40℃でインキュベートする。

放射標識IRE-プローブ4.精製

1. ピペッティングにより、0.5M EDTA、pH8のミックスを1μlを追加することによって、 インビトロ転写反応を終了します。
2. より良い沈殿のためのキャリアとして、10 mg / mlのtRNAの10を添加する。ピペッティングにより混和する。
3. 3 M酢酸アンモニウムの82.5を添加する。ボルテックスで混ぜる。
4. エタノールの273を添加する。ボルテックスで混ぜる。
5. 室温で5分間立ってみましょう。
6. RTで微量全速で10分間スピン。上清を捨てる。
7. ウォッシュは、70％エタノール100μlのペレット。
8. RTで微量全速で10分間スピン。上清を捨てる。
9. 10分間空気乾燥ペレット。
10. 二回蒸留、以前にオートクレーブし、H ₂ O100μlの再懸濁ペレット
11. 使用するまで-80℃で液体シンチレーションカウンターで放射能、アリコートの放射性標識IREプローブおよびストアを定量化する。凍結アリコートを、3週間まで使用することができる。

EMSAのネイティブポリアクリルアミドゲルの5準備

1. 1.5ミリメートルスペーサーと櫛を使用してゲル（16×16 cm）を組み立てます。
2. 表3に示したストック溶液を使用し、6％未変性ポリアクリルアミドゲルを調製するために、7.5ミリリットルの40％アクリルアミドミックス：ビスアクリルアミド、5×TBE 5mlの37.5ミリリットル二重蒸留H ₂ O
3. 10％の新たに調製された過硫酸アンモニウム（APS）と25μlのテトラメチルエチレンジアミン（TEMED）の0.5ミリリットルを追加します。
4. すぐにゲルへのアクリルアミド溶液を注ぎ、それが重合してみましょう。約30分間待ちます。
5. ゲル電気泳動装置を組み立て、0.5×TBEでタンクを記入し、電源に接続します。

6.電気泳動移動度シフトアッセイ

1. 10μlの（より低いタンパク質濃度を用いてもよい）で総体積細胞溶解緩衝液（ 表1）を用いて細胞または組織からのタンパク質抽出物25μgを希釈する。氷の上に保管してください。必要に応じて、11μlの追加^：25：4を休眠IRP1（最終濃度2％）を活性化するために2-メルカプトエタノール（2-ME）で希釈した。
2. 二重蒸留H ₂ O 200,000 CPM /μL、95℃での熱変性に放射性標識されたIREプローブを希釈する1分間のCと、少なくとも5分間、室温で冷却。
3. タンパク質抽出物に放射性標識されたIREプローブの1μLを添加することにより、EMSA反応をセットアップします。
4. 室温で20分間インキュベートする。
5. （プローブ⁹との非特異的タンパク質相互作用を阻害するために）、さらに10分間インキュベーションを継続し、反応を50 mg / mlのヘパリンの1μlを添加する。 -80℃でストックヘパリンの溶液（50mg / ml）とストアを分注し。
6. 長い放射性標識プローブ（> 60ヌクレオチド）を使用する場合、1μlのRNase T1（1 U /μl）を追加し、室温で10分間インキュベートしたプローブへの非特異的タンパク質結合を減少させるため、およびRNA /タンパク質の良好な分離を可能にする電気泳動中に複雑。
7. ローディングバッファー（80％グリセロール+ブロモフェノールブルー）の3μl加え、混ぜると、6％非変性ポリアクリルアミドゲル上にロード。
8. 130 V（5 V / cm）ので60分間ゲルを実行します。
9. Transfer大きな濾紙上に乾燥ゲル。
10. フィルムに露出させ、オートラジオグラフィーを開発しています。露光時間は、1時間（あるいはそれ以下）からO / Nまでの範囲であり得る。

プロトコルのセクション3と4で説明したように、放射性標識IREプローブを調製した。プローブの配列は、5'-GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC CUG C UUCAA C AGUGC UUGGA CGGAUCCU-3」だった。太字のヌクレオチドは、重要な特徴であるIRE不対C残基およびループを表す。プローブの比放射能は、RNAの4.5×10 9 CPM /μgのだった。

IRE結合活性に対する鉄の摂動の効果を評価するために、マウスRAW264.7マクロファージは、未処理のまま、またはヘミン（鉄源）またはデスフェリオキサミン（鉄キレート剤）で処理した。溶解物を調製し、IREプローブ（8000のcpm /μgタンパク質）でEMSAにより分析した。代表的なデータは、それぞれ、左お ​​よび右のパネル上のオートラジオグラムの短い及びより長い曝露で、 図1に示されている。マウスIRE / IRP1とIRE / IRP2複合体は、異なるモビリティと2の明瞭なバンドを示し、未処理の細胞に対応する、レーン1に表示されます。鉄補給は、それら（レーン3）を減少しながら、鉄キレート化は深く、両方IRP1及びIRP2（レーン2）のIRE結合活性を誘導した。でも鉄処理した細胞の抽出物中の2％の2-MEは、完全に活性化IRP1（下のパネル）、の前処置。これは鉄の摂動がIRP1の安定性に衝突し、また、ローディングコントロールとして働くていないことを示している。これとは対照的に2-ME前処理はIRP2のIRE結合活性を阻害した。速い移行非特異的バンドは鉄の影響を受けません。

- / -次に、IRP1、野生型の肝臓におけるIRE結合活性を分析し、IRP2 - / -以前に標準または鉄に富む食（ 図2）で1週間飼育したマウス、。 IRP1 - / - 及びIRP2 - / - マウスは博士の好意MW Hentze（EMBL、ハイデルベルグ）により提供された。野生型の肝臓抽出物では、IRP1はIRE結合活性の主要画分を占め、IRE / IRP2複合体はほとんどなかった以前の観察26と一致して見える（レーン1,2）、。 - / - マウス（レーン3,4）IRP2がIRP1の肝臓抽出物において強力IRE結合活性を示した。これらの条件の下ではIRE / IRP1複合体は観察されなかった。 - / - 同様に、全くIRE / IRP2複合体は肝臓IRP2の抽出物中に形成されなかったマウス（レーン5,6）。高鉄の食事療法をマウスに給餌することはIRP1及びIRP2の両方の肝IRE結合活性を減少させた。この効果は、IRP2（レーン7-12）でより劇的だった。尚、野生型またはIRP2の治療後 - これは明らかにオートラジオグラムの短い露光で観察された（2-ME、IRP1のIRE結合活性は、それはほとんどすべてのIREプローブをシフトしたポイントに増強されたとの肝臓抽出物 - /左のパネル）。

- / -マウス（ 図3）最後に、我々は、野生型とHJVの肝臓と脾臓にIRE結合活性を評価した。 HJV - / - マウスは親切に博士NC·アンドリュース（デューク大学、ノースカロライナ州）によって提供された。これらの動物モデルを表す遺伝性ヘモクロマトーシス27、細網内皮マクロファージは、鉄が28を欠損したままで、過剰な鉄は、実質細胞に蓄積全身鉄過剰、の病気の。予想されるように、HJVの肝臓 - / - 示した（鉄負荷肝細胞）マウスは、野生型（レーン1~4）に比べIRE結合活性を減少させた。逆に、IRE-結合活性は、HJVの脾臓に高かった - / - マウス（鉄欠損マクロファージを含む、5-8レーン）。ここで再び、2-ME処理は肝臓抽出物（左パネル上のオートラジオグラムの短い露光を参照）におけるIREプローブのほぼ完全なシフトを推進しました。

表1.細胞質溶解バッファー。

1. ソリューションべきオートクレーブ処理し、室温で保存する。
2. プロテアーゼ阻害剤、例えば10μg/ mlのロイペプチンおよび0.1mMフェニルメタンスルホニルフルオリド（PMSF）は、使用前に添加することができる。
3. 新鮮な1mMのdithiotheritolの添加はIRP2活性の検出のために推奨されます。

インビトロ転写反応の表2.ストック溶液。

<非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動のための強力な>表3.ストック溶液。

5×TBEの1 Lを作るために、トリス塩基54gを、ホウ酸27.5gを、0.5MのEDTA（pH8.0）を20mlのを使用する。

RAW264.7マクロファージにおけるIRE-結合活性の図1.鉄依存性調節。10 7細胞を未処理のまま、または100μMのヘミンまたはデスフェリオキサミンでO / N扱わのいずれかであった。細胞溶解物を、2％の2-MEを（下の非存在下（上）または存在下で32 P標識したIREプローブでEMSAにより調製し、分析した。）。 IRE / IRP1及びIRE / IRP2複合体、および遊離IREプローブの位置を矢印で示している。スターは、非特異的バンドを示す。オートラジオグラムの短い方と長い露光は、それぞれ、左と右のパネルに示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2は、野生型の肝臓におけるIRE結合活性の分析（重量）、IRP1 - / -及びIRP2 - / -マウス 5週齢のマウス（n =各遺伝子型2）、C57BL / 6バックグラウンド29内のすべて、。標準または高鉄食（2％のカルボニル鉄を含む）上に置いた。一週間後、動物を安楽死させた。肝臓タンパク質抽出物を32 P標識したIREプローブでEMSAにより調製し、分析した。2％の2-ME（下）の不在（上）または存在下で。 IRE / IRP1及びIRE / IRP2複合体、および遊離IREプローブの位置を矢印で示している。スターは、非特異的バンドを示す。オートラジオグラムの短い方と長い露光は、それぞれ、左と右のパネルに示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

- / -肝臓における活性と野生型（wt）およびHJVの脾臓IRE結合性の、図3の分析マウス （各遺伝子型についてn = 2）の10週齢のマウスを、C57BL / 6バックグラウンド30内のすべてが、安楽死させた。肝臓および脾臓タンパク質抽出物は、非存在（上）または存在下で32 P標識したIREプローブでEMSAにより調製し、分析した。2％2-ME（下）。 IRE / IRP1及びIRE / IRP2複合体、および遊離IREプローブの位置を矢印で示している。スターは、非特異的バンドを示す。オートラジオグラムの短い方と長い露光は、それぞれ、左と右のパネルに示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。