ここでは、RNA /タンパク質相互作用を分析するためのプロトコルを提示する。電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）は、ネイティブゲル電気泳動中のRNA /タンパク質複合体および遊離RNAの差動移動に基づいている。放射性標識RNAプローブを用いて、RNA /タンパク質複合体は、オートラジオグラフィーによって可視化することができる。
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この記事について
サマリー
要約
RNA /タンパク質相互作用は、転写後の調節経路に重要である。最もよく特徴付け細胞質ゾルRNA結合タンパク質のうち鉄調節タンパク質 、IRP1及びIRP2がある。彼らは、それによってmRNAの翻訳や安定性を制御する、いくつかの標的mRNAの翻訳領域（UTR）内の応答要素（IRES）を鉄に結合する。 IRE / IRP相互作用は広くEMSAによって研究されている。ここでは、他のRNA結合タンパク質の活性を評価するために一般化することができるIRP1及びIRP2のIRE結合活性を分析するためのEMSAプロトコルを記述する。 RNA結合タンパク質、またはこのタンパク質の精製調製物を含む粗タンパク質溶解物を、複合体形成を可能にする、32 P標識したRNAプローブの過剰と共にインキュベートする。ヘパリン結合プローブする非特異的タンパク質を排除するために添加される。その後、混合物をポリアクリルアミドゲル上で非変性電気泳動によって分析される。遊離プローブRNA /タンパク質複合体の展示遅滞モビリティながら、高速で移動し、。したがって、手順は、「ゲル遅延」または「バンドシフト」アッセイと呼ばれている。電気泳動終了後、ゲルを乾燥させ、RNA /タンパク質複合体、ならびに遊離プローブは、オートラジオグラフィーによって検出される。プロトコルの全体的な目標は、IRE / IRP及び他のRNA /タンパク質相互作用を検出および定量化することである。また、EMSAも調査中のRNA /タンパク質相互作用の特異性は、結合親和性、および化学量論を決定するために用いることができる。
概要
EMSAは、もともとの標的DNA配列1,2-有するDNA結合タンパク質の結合を研究するために開発された。原理は、この記事の焦点であるRNA /タンパク質相互作用3、についても同様である。簡単に言えば、RNAが負に帯電され、ポリアクリルアミド（またはアガロース）ゲル中で非変性電気泳動中に陽極に向かって移動します。ゲル内の移行は、その電荷に比例する、RNAのサイズに依存します。 RNAへのタンパク質の特異的結合は、その機動性を変化させ、そして複合体は、無料のRNAに比べてゆっくりと移動。これは主に、分子量の増加だけでなく、電荷およびおそらく立体配座の変化によるものである。プローブとして標識されたRNAを利用する「ゲル遅延」や「バンドシフト」の容易な監視を可能にする。 32 P標識RNAプローブの使い方は非常に一般的であり、高感度を提供しています。 RNA /タンパク質複合体および遊離RNAの移行が検出されるオートラジオグラフィーによる。欠点は、放射能の仕事、および潜在的なバイオセーフティの懸念のための放射能のライセンスとインフラの要件、32 P（14.29日）の半減期が短いことによる放射線分解へのプローブの品質の漸進的な劣化である。したがって、RNAプローブを標識するための代替の非同位体の方法は、蛍光または化学発光イメージング4,5による検出を可能にする蛍光団又はビオチン、とのインスタンスのために、開発されてきた。これらの方....
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プロトコル
マウスを用いた実験手順は、マギル大学（プロトコル4966）の動物実験委員会によって承認された。
培養細胞からのタンパク質抽出物の調製
- 氷冷したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）10mlで二回培養された細胞を洗浄する。
- ラバーポリスまたは1.5 mlマイクロ遠心チューブに氷冷PBS、転送懸濁液1ml中にプラスチック製のセルスクレイパーのいずれかで付着細胞をこすり。
- 4℃で700×gで5分間のマイクロ遠心でスピン、。吸引するPBS。
- 10 7個の細胞あたりの氷冷細胞質溶解バッファー（ 表1）の100μlのを追加し、上下にピペット。
- 20分間氷上でインキュベートする。
- 4℃での微量遠心で最高速度で10分間スピン。
- ペレットを捨てる。新しい1.5 mlマイクロチューブに上清を移し、氷上に保つ。
- DETブラッドフォードアッセイ23を使用して- （を10μg/μL通常1）アーミンタンパク質濃度。
- 使用するまで-80℃でアリコートと店舗細胞抽出物。
マウス肝臓および脾臓からのタンパク質抽出物の調製
- CO 2吸入でマウスを安楽死させる。
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結果
プロトコルのセクション3と4で説明したように、放射性標識IREプローブを調製した。プローブの配列は、5'-GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC CUG C UUCAA C AGUGC UUGGA CGGAUCCU-3」だった。太字のヌクレオチドは、重要な特徴であるIRE不対C残基およびループを表す。プローブの比放射能は、RNAの4.5×10 9 CPM /μgのだった。
IRE結合活性に対する鉄の摂動の効果を評価するために、マウスRAW264.7マクロファージは、未処理のまま、またはヘミン（鉄源）またはデスフェリオキサミン（鉄キレート剤）で処理した。溶解物を調製し、IREプローブ（8000のcpm /μgタンパク質）でEMSAにより分析した。代表的なデータは、それぞれ、左お よび右のパネル上のオートラジオグラムの短い及びより長い曝露で、 図1に示されている。マウスIRE / IRP1とIRE / IRP2複合体は、異なるモビリ.......
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ディスカッション
ここで、我々はIRP1及びIRP2のIRE-結合活性を研究するために開発されたプロトコルを記述し、我々は代表的なデータを示している。異なるプローブを使用することによって、このプロトコルは、他のRNA結合タンパク質の研究のために調整することができる。重要なステップは、プローブのサイズです。正確な結合部位が不明な場合に共通している長いプローブの使用方法は、無料のRNAとは異なる方法で移行しないRNA /タンパク質複合体になることができます。この場合には、RNアーゼT1（ ステップ6.6）での処理によって結合していないRNAを除去することが望ましい。プローブの質も非常に重要である。最良の結果は、新たに調製した放射性標識されたRNAを用いて得られる。ゲル精製10は必要ではないが、（無RNアーゼT1消化ステップが含まれていない場合）は、プローブを調製するためのインビトロ転写反応は、早期終結産物が得られた場合EMSAの外観を改善することができる。ネイティブゲル電気泳動速すぎメートルを実行するyのRNA /タンパク質複合体の解離をもたらし、ファジーバンドが生じることがあり、過熱.......
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開示事項
著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。
謝辞
この作業は、Canadian Institutes for Health Research（MOP-86514）からの助成金によって支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ロイペプチン | SIGMA L2884 | ||
| PMSF | SIGMA | 78830 | |
| BioRad Protein Assay | BIORAD | 500-0006 | |
| T7 RNA ポリメラーゼ | Thermoscientific | EPO111 | |
| RNase Inhibitor | Invitrogen | 15518-012 | |
| UTP [alpha-32P] | Perkin-Elmer | ||
| シンチレーション液体 | ベックマン・コールター | 141349 | |
| ヘパリン | SIGMA | H0777 | |
| Rnase T1 | Thermoscientific | EN0541 | |
| 機器 | |||
| 組織破裂器 | Qiagen | 9001271 | |
| シンチレーションカウンター | ベックマン・コールター | LS6500 | |
| Protean II xi Cell | BIORAD | 165-1834 | |
| 20 ウェルコーム | BIORAD | 165-1868 | 1.5 |
| mm スペーサー | BIORAD | 165-1849 | |
| PowerPac | BIORAD | 164-5070 |
参考文献
- Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981).
- Garner, M. M., Revzin, A.
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再版と許可
