このプロトコルを使用して、我々は、シスト化の寄生虫と感染したニューロン間の空間的関係の可視化と分析を可能にする寄生虫トキソプラズマに感染したマウスからの画像160の厚さの脳切片することができました。
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サマリー
要約
トキソプラズマは、ヒト及びげっ歯類を含む広い宿主範囲、との偏性細胞内寄生虫である。ヒトとげっ歯類の両方で、 トキソプラズマは脳内の生涯持続感染を確立します。この脳の感染はほとんどの免疫担当の人で無症候性ですが、発育中の胎児や、後天性免疫不全症候群（AIDS）患者などの免疫無防備状態の個体では、脳内のためと永続この偏愛は壊滅的な神経疾患につながることができます。このように、脳- トキソプラズマ相互作用はトキソプラズマによって生成症候性疾患に重要である、まだ我々は、中枢神経系（CNS）および寄生虫の細胞との間の細胞または分子相互作用をほとんど理解していることは明らかである。 CNSのマウスモデルでは、それが神経細胞は寄生虫が解決している細胞であることを30年以上にわたって知られているが、ほとんど情報がどの程度利用可能であるトキソプラズマ症ニューロンの一部は、一般的に（ソーマ、樹状突起、軸索）を感染していると、この細胞の関係は、株の間で変更された場合。一部では、この欠如は、撮像の困難に二次であり、動物からの全感染ニューロンを可視化する。このような画像は、典型的には、連続切片および電子顕微鏡または免疫染色後に共焦点顕微鏡で画像化した組織のステッチを必要とするであろう。いくつかの技術を組み合わせることにより、ここで説明する方法は、免疫染色を必要とせずに個体、慢性的に感染した神経細胞の三次元可視化および解析を可能にする、厚い部分（160ミクロン）の使用は、嚢胞を含む全細胞を同定し、画像を可能にする、電子顕微鏡法、または連続切片とステッチ。この技術を用いて、寄生虫、感染したニューロン間の細胞の関係を理解し始めることができます。
概要
この方法の全体的な目標は、高解像度、偏性細胞内寄生トキソプラズマ原虫に感染した個々のニューロンの三次元画像を得ることである。
トキソプラズマは、しばしば人間とげっ歯類が含まれ、その大きな中間宿主域、の中で最も成功した寄生虫の一つと考えられている。ヒトとげっ歯類の両方で、汚染された食物や水の摂取を通じて、急性感染後、 トキソプラズマがフォームをそのスロー複製にその速い複製形（タキゾイト）からの変換とシスト化によってCNSの持続感染を引き起こすことが可能である（ブラディゾイト）。免疫応答性個体では、この潜在的な中枢神経系の感染は比較的無症候性であると考えられているが、そのようなエイズ患者や移植レシピエントとして免疫無防備状態の個体では、寄生虫の再燃は、致命的なトキソプラズマ脳炎1,2につながることができます。加えて、最近の研究ヘクタールメカニズムは不明であるもののトキソプラズマと潜伏感染は、げっ歯類3,4における行動の変化につながる可能性があることを示したVEの。
驚くべきことに、CNS- トキソプラズマ相互作用の重要性を強調し、これらのデータにもかかわらず、比較的少ない、特に、細胞および分子レベルで、この関係について知られている。脳寄生虫相互作用のさえ単純な側面を研究する能力は、科学技術の限界によって一部に妨げられてきた。例えば、ニューロンは、嚢胞が持続する細胞であることを示す研究の大半は、電子顕微鏡（EM）5,6を用いて行われてきた。 EMは、高解像度を与えるが、それは時間がかかり、労働集約的で、かつ高価である。免疫蛍光（IF）アッセイは、最近、EM 7によって行われた作業を確認するために、共焦点顕微鏡と組み合わせて使用されてきた。アッセイは、実行することが技術的に容易で、比較的安価な、しかしアンダーにこれらの技術を使用している場合嚢胞、感染したニューロン間の空間的関係は、時間がかかるもの、シリアル再建を必要とする技術的に困難であり、貴重な情報の損失につながる可能性がTAND。したがって、我々は、CNSトキソプラズマ症のマウスモデルで使用し、EMまたは免疫組織化学（IHC）のない画像に感染した神経細胞の全体を私たちを可能にすることができる方法を開発した。このような技術を開発することにより、我々は、比較的迅速かつ安価な方法で感染細胞とシストの間に細胞の関係を探求し始めることができます。
私たちが開発した方法は、寄生虫タンパク質9,10に注入された生体細胞内のマークシステムと共焦点顕微鏡8による光学的にクリアとイメージング厚い脳切片の新しい技術を組み合わせたものです。このシステムでは、我々はトキソプラズマとのCre介在組換え後の11緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するのCreレポーターマウスを感染赤色蛍光タンパク質（RFP）を発現する宿主細胞9にCreリコンビナーゼを注入菌株。この組み合わせは、私たちはCNS感染が確立された後、感染したマウスの脳を収穫厚い脳切片を切断し、そして迅速にRFP +嚢胞を見つけることによって、画像に関 連する領域を特定することができる。これは、GFPの宿主細胞発現はGFP +細胞の数は、寄生虫10が含まれていない、感染に寄生虫のCreの注入のみに依存する、としないように留意することが重要である。ニューロン-このプロトコルの目的は、画像全体に感染したニューロンにできることがあるので、焦点は唯一のもRFP +嚢胞が含まれていますが、プロトコルは、GFP + / RFPイメージにも使用することができ、GFP +ニューロンにある。
感染した脳を採取し、区分された後、切片をグリセロールクリアで透明なレンダリングされます。セクションの適切な領域は、その後、共焦点顕微鏡、らで撮像する感染した宿主細胞、および、それらの全体がシスト寄生虫のlowing前例のない可視化。ここでは、識別するための完全なプロトコル、光学的にクリアリング、およびイメージング感染ニューロンを提供する。
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プロトコル
注：マウスは、アリゾナ大学で食物および水を自由摂取との明/暗サイクルを逆に飼育し、12時間と温度及び湿度制御された部屋で維持した。実験はガイドラインとアリゾナ大学の制度的動物実験委員会の承認の下で行った。すべての努力は、苦痛を最小限にするために行われた。のCreレポーターマウスは、C57BL / 6バックグラウンド11上にあり、商業的に入手可能である。
1.マウスの感染
注： - 12 トキソプラズマ後述でマウス感染の方法は、以前に10を発表された研究で使用されている。
- ヒト包皮線維芽細胞におけるトキソプラズマ株を成長ダルベッコ高グルコース中で培養（HFFS）がイーグル培地（DMEM）、10％FBS、100 U / mlのペニシリン、100mg / mlのストレプト変形omycin、および2mM L-グルタミン（CDMEM）、5％CO 2インキュベーター内部にT-25フラスコ中の寄生虫は、大きな寄生虫液胞を形成するまで。
- フラスコの底から細胞を掻き取り、フラスコの内側の3mlシリンジに接続された25ゲージの針に2回得られた溶液を通過させることによって、シリンジ放出寄生虫は、その27ゲージの針に接続された5ミリリットルの注射器の場合に、すべてのソリューションを転送する逆さまの15mlコニカルチューブ内部に配置されている。注射器にプランジャーを接続し、コニカルチューブに寄生虫ソリューションを渡す。
- 遠心分離機300×gで10分間チューブ。上清はその後4〜6ミリリットルの滅菌USPグレード1Xリン酸緩衝生理食塩水（PBS）pHが7.4（原液）にペレットを再懸濁吸引除去する。
- ストック溶液の10μLの血球計数器をセットし、寄生虫はミドル大きな正方形の四隅と中央の正方形で寄生虫の数をカウント後、決済するために5〜10分待ちます。
- パラを希釈100K /200μlの1×PBSの適切な接種サイズのサイトは、その後200μlの総容量で腹腔内（IP）をマウスに注射する。
注：この手順では、マウスを100KタイプIII（CEP）200μlの1×PBSで13タキゾイトを接種した。トキソプラズマの他の株をマウスに感染させる場合には、接種物の濃度は、毒性のレベルを考慮して調整される必要があり得る。
2.灌流および脳収穫
注：これはシストのピーク数がマウスの脳に見出されるが、他の時点が使用される時点を表すように、このプロトコルは、21日後に感染数（dpi）で行った。 17 -サイズ、数、位置、および嚢胞の有無マウス系統、寄生虫株型、ならびに接種サイズ7,14を含む多くの要因に依存する。調べでは、個別に、マウスとToxoplasのための適切な接種材料を決定する必要がありますMA株は彼/彼女が使用しています。
- セットアップすべての手術収穫ツール（ 図1）。
- 各マウスについて、準備し、氷上に保つ：1X無菌のUSPグレードPBS（ヘパリン/生理食塩水）で0.9％の塩化ナトリウム（NaCl）を+ 10 U / mlのヘパリンで満たされた20mlの注射器。 4％パラホルムアルデヒド（PFA）を充填した20mlの注射器。 15ミリリットル、4％PFAでシンチレーションバイアル。複数のマウスの場合、各灌流のためのソリューションの完全な新鮮な注射器を策定した後、全てのマウスに必要な各溶液の全体量を満たしたビーカーを準備します。
- 興味のある日に200μL/ケタミン/キシラジンのカクテルの体重の25グラム（24 mg / mlの＆4.8 mg / mlのそれぞれ）で、マウスの腹腔内麻酔。つま先ピンチ反射をチェックすることによって、麻酔のレベルのためのマウスを監視します。マウスがしっかりとつま先のピンチへの応答を示していないだけで、一度プロトコルを続行します。
注：麻酔の適切なレベルが前に到達するように、麻酔の他の方法があればよいプロトコルを進める。 - カバーされたフォームプラットフォーム上仰臥位でマウスを置きます。その後、70％エタノール（EtOH）（ 図2A）と胸部と腹部をスプレー足元にすべての4つの手足をピン。マウスの下のいくつかの滅菌ペーパータオルの添加は、灌流液のオーバーフローを吸収助けるために使用することができる。
- その後切開を作るためにハサミを使用してピンセットでちょうど胸骨下の皮膚を持ち上げます。胸（ 図2B）を露出するために皮膚を引き戻す。
- 剣状突起を持ち上げて、ちょうど横隔膜下の腹部切開を行い、ぶっきらぼうに、振動板から離れて解剖された肝臓を露出させる。 2切開、左側の1と絞りを右肋骨の底に1を加えます。その後胸腔（ 図2C）を開くために戻って反映されている胸郭、約1 / 2-2 / 3の方法が左と右の切開を拡張します。
注：すべての臓器や主要な血管デュをカットしないように注意してください灌流の品質を損なうなりそうとして、この手順を鳴らす。 - 10〜20ミリリットル4％PFAに続く10〜20ミリリットルヘパリン/生理食塩水で経灌流。
注：灌流が適切に行われた場合、肝臓は赤から黄褐色（ 図2D）に変わります。適切に行われない場合は、血管が目に見える（ 図2E）となる。 - その腹部の上にマウスを裏返し、再びピンの足は、70％EtOHで頭と首をスプレー。首の付け根から肌を持ち上げて、切開する。頭蓋骨（ 図2F）を露出するために皮膚を削除します。肩のレベルで頭を首を切る。頭蓋骨を外し、静かに脳を削除し、4％PFA（ 図2G-H）で満たされたシンチレーションバイアルに配置します。
注：よく灌流した場合、脳は目に見える血管（ 図2I）と白表示されます。脳が十分に灌流されていない場合は、血管が目に見える（ 図2J）となる。 - Scintillaのを置きます4℃で4％PFA中脳とションバイアルを一晩、光から覆った。非USPグレード1X PBS中に脳をすすぎ、チルド1×PBSで満たされた新しいシンチレーションバイアルに移す。光からカバーし、4℃で1×PBS中の脳を、保管してください。
注：成功清算およびイメージングは、最大1ヶ月1X PBS中に保存セクションで達成されてきたが、PBSで長期保存がPFA固定を逆にすると、最適な画像を以下につながる可能性としては、数日以内に脳セクションに最適です。自家蛍光の増加ブラーは1ヶ月以上のための1×PBSで貯蔵した後に画像化され、いくつかのセクションに記載されています。
3.脳セクショニング
- 1×PBSから脳を取り出し、脳を通してカットしても、より正確で可能にするために、脳のマトリックス（ 図3A）にそれを配置します。存在する場合、小脳および嗅球を切り落とす、その後2または3つのセクションに冠状脳をカット。 注：トリミング及び脳の切断は、脳マトリックスを用いずに行うことができる。冠状に切断部の数は、使用されているビブラトームの切削距離に依存する。矢状及び冠状切片が、最も一般的に神経解剖学的同定のために使用されても脳には、任意の方向に切断することができる。
- シアノアクリレートで試料取付ブロックの上にそれぞれの脳切片を貼付。サポートのための脳切片（ 図3B）の後ろに5％のアガロースゲルの小さなブロックを貼付。
注：他の支持機構を用いることができるが、サポートなし、ビブラトームムラセクショニングを引き起こす脳に押すことができる。 - ビブラトームとの厚いセクションでは、4の速度と9の振幅に設定さ160ミクロン（イメージングに使用目的の作動距離）に組織を切断。
注：速度及び振幅の設定があっても、滑らかな部分を得るために使用される特定のマシンに応じて調整することができる。設定がある場合正しくない場合、結果は不均一な切片、組織またはびびりマークの引き裂きすることができる。 - 彼らは1週間以内にクリアしようとしている場合には、新鮮な、冷蔵1×PBSで満たされたシンチレーションバイアルに組織切片を収集します。の項では、1週間以内にクリアする予定がない場合は、-20℃で凍結保存液と店舗で満たさ1.5ミリリットルのマイクロチューブに場所セクション。
脳組織切片の4オプティカルクリア
注：このプロトコルは、以前に公開されたメソッド8から変更されている。
- 1×PBS + 2％のTween-20（胃腸/ PBST）中で25％、50％、75％及び90％容量/容量のグリセロールを準備する。
- 凍結保存剤であれば、1×PBSですすぎ、25％GL / PBSTの10ミリリットルを含むシンチレーションバイアルに移し、1×PBSからセクションを削除するか。 12時間、暴露からの光に覆われて4℃でシェーカー、の上に置いてバイアル。
- すべてのセクションは、BOに沈んでいることを確認してくださいバイアルのttom。の項では、その後12時間、光への暴露からカバーし、4℃でシェーカー上で10ミリリットル50パーセントGL / PBSTでバイアルと場所を埋めるカバーするだけの十分な残して、25％のGL / PBSTを吸引。 75％のGL / PBSTその後90％のGL / PBSTこのプロセスを繰り返します。最大のクリアリングに到達するために24時間90％のGL / PBST中のセクションのままにしておきます。クリア処理の過程で、緩やかな光学クリアします（ 図4）を観察。
注：セクションでは、バイアルの底に沈んでた後に解決策がすぐに変更された場合は、このプロセスが迅速ことができる。 75パーセント＆90％のソリューションでは、セクションでは、すべての方法をバイアルの底に沈むことはありませんが、途中でフロートします。
5.取付脳組織切片
- スペーサーを作成するために5個に第1.5カバースリップをカット。 図5（a）に示す点線に沿ってカバースリップを獲得し、破壊するために定規とダイヤモンドひっくり返された鉛筆を使用してください。破棄トン彼は、作品を中心にウィンドウを作成するために、プレーンガラススライド上に4アウターピースを配置してから、正しい構成（ 図5B）でスライドにスペーサーの部分を接着するために縫い目上に明確なマニキュアを磨く。
NOTE：スペーサスライドクリア部分を取り付けるためのカバーガラスの間に必要なスペースを作成するために使用される。カバーガラスは、必要な任意のサイズのウィンドウを作成するための様々な方法で切断されてもよい。プレカット発泡スペーサーも市販されている。マニキュアが完全に乾燥させるためには、少なくとも1日前取付部にスペーサーを有するスライドを作るのがベストです。 - 先端がプラスチック製のトランスファーピペットを用いてスライドに転写部を切断。 90％のGL / PBSTで周辺地域に記入してください。慎重に確認してくださいすべての気泡を導入しないことセクション上にカバースリップを下げる。過剰GL / PBSTは糸くずの出ないワイプで離れて吸い上げてよい。
- RFP +を含む画像は、GFP +ニューロン共焦点顕微鏡すぐに（ 図7A-B）、ストアのスライドを平らにし、4℃で光からカバーとトキソプラズマ嚢胞。
注：あるいは、シールは保存し、後で画像化するために、すべてのエッジの周りに完全にスライドさせる。スライドをシールする明確なマニキュアの使用はオプションであり、1つは、さらなる処理のため、後日スライドからセクションを削除した場合、それがより困難にカバースリップを削除することがあります。
6.イメージング
注：すべての顕微鏡は、高解像度のzスタックを取得する能力を有することを使用することができる。
- 当初は10倍で、焦点面を見つけた後、20Xの目的に変更し、GFP +細胞の内側に位置する嚢胞を識別するためにセクションをスキャン。視野内の関心領域（ROI）を中心。
- 対物レンズ40倍に変更します。ことを確認するためにROI全体を通して上下にフォーカス細胞全体とCYSTは、表示されます。
注：画像は、40X / 1.30オイルDIC M27の目的とした共焦点顕微鏡を用いて得られた。 - インストールイメージングソフトウェアを使用して、嚢胞全体セルを含むzスタックを得る。画像を得るために使用される平均の設定は、図6に示されている。
NOTE：設定は、各研究者の組織切片を、顕微鏡能力に応じて調整する必要がある。 - 64への投影の数を設定することにより、完全な回転のビューを取得し1に投影数を設定することにより、zスタックの最大投影画像を得る。
注：他のソフトウェアパッケージが利用可能であり、最大値投影、回転ならびにzスタック画像の他のビューを得るために使用することができる。 - 画像解析ソフトで画像を分析します。
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結果
図7は、2つの異なる160μmの厚さの切片だけでなく、 図7Bのための嚢胞対細胞体からの距離の代表的測定から2嚢胞含有GFP +ニューロンの代表的な画像が含まれています。7 AとBは 、この新しいことを示してプロトコルは、その全体が感染したニューロンの可視化を可能にする。 図7Cは、この撮像技術では、嚢胞細胞体（IMARIS 7.7）との間の距離を定量化することが可能であることを示している。 図7Dは、図の完全な回転の図である。 7B。このように、zスタックの可視化は、細胞と嚢胞の完全な捕捉を検証することを可能にする。 図7Eは、図7Dの画像がに嚢胞からの距離を測定するIMARIS 7.7ソフトウェアによって分析することができるかを示す3次元回転映画である細胞体のいずれかからミドル·ツー·ミドルORのエッジ間。示...
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ディスカッション
感染した宿主細胞における細胞変化は、HIV、狂犬病、およびクラミジア18,19などの他の細胞内生物による感染症の疾患転帰にリンクされていることを考えると、私たちは私たちがCNSとの間で発生する親密な相互作用を研究することを可能にする技術を開発セルおよびトキソプラズマを開催。ここで説明する方法は、慢性的に感染した神経細胞の効率的なイメージングを可能にすることによって、この目標を達成する。この方法の開発に先立ち、そのようなイメージングは、時間がかかり、高価な、または不可能であった。
当社は、現在、そのような寄生虫の標的と特定の神経領域であるとしてトキソプラズマ -neuron相互作用に関する基本的な質問に答えるために、このテクニックを使用できますか？これはトキソプラズマ株の間で違うのでしょうか？嚢胞は、セルの残りの部分とは異なる存在する細胞の領域が（ すなわち 、同じニューロンからの感染と感染していない樹状突起は、スパインの数が同じでないでください）？感染したニューロンによって共有細胞の特...
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開示事項
著者らは、開示することは何もない。
謝辞
我々は有用な議論のための全体Koshyラボを感謝。私たちは、イメージングとのアドバイスや助けをパティジャンスマとアリゾナ大学の神経科学省に感謝します。我々はまた、彼らのビブラトームを使用するためのPorrecaラボに感謝。この研究は、米国国立衛生研究所（NIH NS065116、AAK）によってサポートされていました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ビブレータ 1000 シリーズ セクショニングシステム | テクニカルプロダクツインターナショナル株式会社 | 他のビブラトームは互換性があります | |
| グリセロール | フィッシャーサイエンティフィック | BP229-1 | |
| Tween-20 | フィッシャーサイエンティフィ | BP337-500 | |
| プレミアムスライド | フィッシャーサイエンティフィック | 12-544-2 | |
| #1.5 カバースリップ | VWR | 48393 251 | |
| ダイヤモンドスクライバー | VWR | 52865-005 | |
| ツァイス LSM 510メタ共焦点顕微鏡 | Zeiss | LSM 510 | |
| Ketaject®ケタミンHClノズル、USP 100 mg/ml | ウエスタンメディカルサプライ(株) | 4165 | |
| AnaSed®注射:キシラジン20 mg / ml | ロイド株式会社 | ||
| ZsGreenマウス | ジャクソン研究所 | 7906 | B6。CG-GT(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J |
| 外科用機器 | 親指鉗子;細かいはさみ-側面に角度が付けられ、鋭利で鋭い。鋭利なハサミ。ケリー止血剤;マヨハサミ;マイクロヘラ。 | ||
| ヒト包皮線維芽細胞(HFF)細胞 | これらは、ヒト包皮からの初代細胞です。 これらは社内で製造していますが、外部のベンダーから購入することもできます。 | ||
| ダルベッコの高グルコース修飾イーグルスミディアム(DMEM) | HyClone | SH30081.01 | |
| ペニシリンストレプトマイシン溶液、100x | Corning | 30-002-Cl | |
| 200 mM L-アラニル-L-グルタミン | Corning | 25-015-Cl | |
| 25 cm2 傾斜ネックフラスコ | フィッシャーサイエンティフィ | 1012639 | |
| リン酸緩衝生理食塩水、1x なしカルシウムとマグネシウム | VWR | 45000-446 | |
| リン酸緩衝生理食塩水、10x、USP 滅菌超高純度グレード | amresco | K813-500ml | |
| ウシ胎児血清 | Gibco | 26140-079 | |
| ブライトライン血球計算盤 | Sigma-aldrich | Z359629-1EA | |
| マウス脳スライサー マトリックス | Zivic インスツルメンツ | BSMAS005-1 | |
| 塩化ナトリウム | フィッシャーサイエンティフィ | BP358-1 | |
| 豚腸粘膜からのヘパリンナトリウム塩 | シグマアルドリッチ | H3393-100KU | |
| パラホルムアルデヒド | フィッシャーサイエンティフィック | O4042-500 | |
| 20 ml 使い捨てシンチレーションバイアル | フィッシャーサイエンティフィ | FS74500-20 | |
| アルコール、エチル、95%、190 プルーフ | 社内 | 17212945 | この商品は社内のストックルームから購入しています。 他社対応です。 |
| イマリスソフトウェア | ビットプレーン | ||
| クリアマニキュア | 他のブランドは互換性があります | ||
| ルアーロックVWR BD309604と10mlシリンジ | 他のシリンジは互換性があります | ||
| 三方活栓 | どのブランドも互換性があります | ||
| 下注射針 | どのブランドも互換性があります - マウスを固定するために使用されます。 | ||
| セルスクレーパー | どのブランドにも対応 | ||
| 25 G x 12インチチューブ、安全採血セット、ルアーアダプター付き | Greiner Bio-One | 450099 | 他のブランドも対応しています |
参考文献
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再版と許可
訂正
Formal Correction: Erratum: 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii
Posted by JoVE Editors on 9/01/2015. Citeable Link.
A correction was made to "3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii". The ordering of the authors was inverted. The order has been updated from:
Anita A. Koshy, Carla M. Cabral
to:
Carla M. Cabral, Anita A. Koshy
