神経細胞型の表面抗原および/または細胞内抗原のフローサイトメトリー分析のためのプロトコルの詳細な説明を提供します。実験計画の重要な側面、段階的な方法論的手順、およびフローサイトメトリーの基本原理が説明され、神経生物学者がこの強力な技術を活用できるようになります。
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この記事について
サマリー
要約
フローサイトメトリーは、免疫学、血液学、腫瘍学における細胞集団を定義するために広く使用されてきました。ここでは、神経細胞型における分化(CD)表面抗原および細胞内抗原のクラスターのフローサイトメトリー解析のためのプロトコルについて詳しく説明します。方法論的手順の段階的な説明には、神経in vitro培養物の回収、オプションのカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)標識ステップ、その後の標識CD抗体(CD24、CD54など)による表面抗原染色、その後の一次/二次抗体または蛍光標識Fabフラグメントによる細胞内抗原検出(ゼノン標識)が含まれます。このビデオでは、最も重要な手順を示しています。さらに、実験計画の原則、重要なコントロールの包含、およびフローサイトメトリー解析の基本(ターゲット集団の特定とデブリの排除、ゲーティング戦略、スペクトルオーバーラップの補正)について簡単に説明し、フローサイトメトリーの予備知識が限られている神経生物学者がその有用性を評価し、この強力な方法論をより有効に活用できるようにします。
概要
フローサイトメトリーを広範囲に固有の散乱特性、細胞表面抗原の発現、および他の蛍光パラメーター1-3を介して細胞集団を定義するために、免疫学、血液学および腫瘍学に おいて利用されてきた。血液系統の開発および疾患に私達の洞察は、その初期の実装4,5の後にこの方法論の連続洗練の有意な程度の結果である。フローサイトメトリーの定量的および全体的な分析的な潜在意識の高まりは、最近、幹細胞研究におけるそのより広範な使用を奨励している短い時間枠6と同様に深い進歩を可能にすることができる。しかし、特に神経集団を分析し、単離するためのフローサイトメトリーの適用は、長い挑戦として認識されている。当然、懸濁液中に存在する造血細胞とは対照的に、神経細胞型は、典型的には、グリアおよび様々Oを含んでいてもよい過度に複雑なソースから収穫するTHER周囲の細胞ならびにプロセス有利子ニューロンの複雑なネットワーク。したがって、神経生物学、毎日研究ルーチンでの完全な電位にフローサイトメトリーの多様性を実現するために至っていない。しかし、神経生物学における分析レパートリーの貴重な要素とみなすことができる限り、生存単一細胞懸濁液を生成することができる（およびプロトコルは、その目的の7のために考案し、最適化されている）として、フローサイトメトリーおよび蛍光活性化細胞選別（FACS） 8-11。
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プロトコル
1.神経細胞の回収
- 顕微鏡による評価：
- 実験を開始する前に、明視野または位相差顕微鏡による培養物の状態を確認。
注：解剖から得られた一次神経組織ではあるが、原則的に、均等に影響を受けやすいサイトメトリー分析14,28を流れるように、プロトコルの焦点はインビトロ神経細胞システムから得られた細胞であることに注意してください。
- 実験を開始する前に、明視野または位相差顕微鏡による培養物の状態を確認。
- 収穫細胞7：
- RT（ 例えば 、T75フラスコに5 mlの6ウェルプレートにウェル当たり3ミリリットル、または10 mlの優しく/ Ca 2+のMgを有する接着細胞の皿/フラスコを洗浄2+を含まないリン酸緩衝生理食塩水（PBS） 10cmディッシュ）。
注：PBSをプロトコル全体で使用さは、Mg 2+ / Ca 2+の自由である。- ビデオ例えば、80％のコンフルエンシーでSH-SY5Y神経芽細胞腫細胞のT75フラスコを使用する。例ここで追加の洗浄工程を適用しますかなりの破片が皿の中の存在である。
- 血清アルブミンを含むPBS 48を 、パーコール、またはフィコール49遠心分離勾配および/ または市販のビーズ50,51との洗浄を考慮して....
- RT（ 例えば 、T75フラスコに5 mlの6ウェルプレートにウェル当たり3ミリリットル、または10 mlの優しく/ Ca 2+のMgを有する接着細胞の皿/フラスコを洗浄2+を含まないリン酸緩衝生理食塩水（PBS） 10cmディッシュ）。
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結果
ここで紹介するプロトコルは、汎用性の実験的アプローチ（ 図2）を可能にします。その短いバージョン（1、3、6ステップ ）においては、表面抗原の単純な染色のためのガイドと考えることができる。そのより複雑な形態において、細胞内抗原の範囲で共標識パラダイムの数は（2および/ または4〜5の任意の工程 ）を追求することができる。また、CFSE標識工程は、細胞-細胞相互作用の研究またはフローサイトメトリーバーコード実験（ ステップ2）における集団の細胞標識/追跡のための有用性を例示する。 （ ステップ2及び/又は3から得られた）、生存細胞集団は、細胞選別パラダイム（FACS）およびポストソート細胞培養を含む下流の分析に適している。一方、組み合わせた細胞表面抗原染色（3〜5ステップ ）独自の権利で、分析読み出しの機会を提供します。例えば、（ <.......
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ディスカッション
ここに提示されたプロトコルがよくヒト幹細胞由来の神経細胞培養のために確立されているが、同様の一次組織または神経細胞株を含む他の神経細胞供給源に適用することができる。胚のソースに加えて、神経幹細胞または前駆細胞は、成人の脳27の神経原性領域から抽出することができる。また、フローサイトメトリーおよびFACSが成熟ニューロン54、アストロ33、ミクログリア55、オリゴデンドロサイト56、または出生後の脳組織からの内皮細胞57を含む様々な細胞集団を定量分析し、単離するために利用することができる。
手順のいずれかの過剰なフローサイトメトリーの読み出しに影響を与える散乱特性の大規模な変化につながる可能性に関係なく、ソースの、固定および透過化のための最適条件は、実験的に各細胞型について決定される必要がある。プロトコルの効率もSTABILに依存表面分子のityが透過処理を投稿。これは、異なる表面エピトープは、種々の程度の手順の一部として細胞操作によって影響され得ること.......
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開示事項
著者らは、潜在的な利益相反はないと宣言している。
謝辞
私たちの研究プログラムは、ドイツ研究財団（DFG）のエミー・ネータープログラム、助成金PR1132/3-1を通じて資金提供を受けています。フライブルク大学のミュラー・ファーネンベルク財団によるさらなる支援に感謝します。この研究は、ドイツ研究財団(GSC-4、シュペーマン大学院)のエクセレンスイニシアチブによって部分的に支援されました。
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材料
| DMEM/F12 (1:1) (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) |  Life Technologies | 11330057 | |
| DPBS (Ca2+ Mg2+ 不含) | Life Technologies | 14190169 | |
| ウシ胎児血清、認定品、EU承認、南米産 (FBS) | Life Technologies | 10270-106 | |
| MEM 非必須アミノ酸 (100x) | Life Technologies | 11140035 | |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604013 | |
| トリパンブルー溶液、0.4% | Life Technologies | 15250061 | |
| パラホルムアルデヒド | Carl Roth | 335.3 | |
| ウシ血清アルブミン (BSA) 分画 V | PAA Laboratories, Coelbe | K41-001 | |
| Tween-20 洗浄剤 | Calbiochem | 655205 | |
| カルボキシフルオレセイン・スクシンイミジルエステル (CFSE) | eBioscience | 65-0850-84 | |
| DMSO | AppliChem | A1584 | |
| ボトルトップフィルター express plus 0.22 µm, 250 ml | Millipore | SCGPU02RE | |
| 細胞培養処理済みフラスコ (T 25) | NUNC | 156367 | |
| 細胞培養処理済みフラスコ (T 75) | NUNC | 156499 | |
| コニカルチューブ (15 ml) | Greiner Bio-One | 188271 | |
| コニカルチューブ (50 ml) | Greiner Bio-One | 227261 | |
| パステールピペット、ガラス製 (150 mm) | STEIN Labortechnik, Remchingen | S03710150 | |
| ピペットチップ (0.1-10 µl) | Corning | 4125 | |
| ピペットチップ (1-200 µl) | Corning | 4126 | |
| ピペットチップ (100-1000 µl) | Corning | 4129 | |
| セロロジカルピペット, 5 ml | Corning | 4051 | |
| セロロジカルピペット, 10 ml | Corning | 4101 | |
| セロロジカルピペット, 25 ml | Corning | 4251 | |
| マイクロセントリフュージチューブ (0.5 ml) | Sarstedt | 72,699 | |
| マイクロセントリフュージチューブ (1.5 ml) | Greiner Bio-One | 616201 | |
| マイクロセントリフュージチューブ (2.0 ml) | Sarstedt | 72,695,500 | |
| 抗ヒト CD24 APC モノクローナル抗体 | eBioscience | 17-0247-42 | 使用希釈倍率 1:50 |
| 抗ヒト CD54 PE モノクローナル抗体 | eBioscience | 12-0549-42 | 使用希釈倍率 1:50 |
| Neuronal Class III β-Tubulin (Tuj1) ポリクローナル抗体 | Covance | PRB-435P | 使用希釈倍率 1:2,000 |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti Rabbit | Life Technologies | A21206 | 使用希釈倍率 1:2,000 |
| Zenon® Fluorescein Rabbit IgG Labeling Kit | Life Technologies | Z-25342 | |
| Neubauer改良型血球計数器 | Marienfeld | 0640010 | |
| ボルテックスミキサー | Scientific Industries | G560E | |
| Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.001 | |
| Accuri C6 フローサイトメーター | Becton Dickinson (BD) | 653118 | |
| 冷却マイクロセントリフュージ, PerfectSpin 24 R | Peqlab | 91-PSPIN-24R | |
| オービタルシェーカー, Unimax 1010 | Heidolph | 543-12310-00 | |
| 冷却遠心機, Rotanta 96 RC | Hettich | 4480-50 | |
| クラスII生物安全キャビネット Safe 2020 | Thermo Scientific | 51026640 | |
| CO2 インキュベーター, Heracell 240i | Thermo Scientific | 51026331 | |
| 真空システム, Vacusafe comfort | Integra Biosciences | 158320 | |
| 顕微鏡, Axiovert 40 CFL | Zeiss | 451212 | |
| ピペットコントローラー, accu-jet pro | Brand | 26303 | |
| マイクロピペット, Pipetman neo P20N (2-20 µl) | Gilson | F144563 | |
| マイクロピペット, Pipetman neo P200N (20-200 µl) | Gilson | F144565 | |
| マイクロピペット, Pipetman neo P1000N (100-1000 µl) | Gilson | F144566 |
参考文献
- Herzenberg, L. A., et al. The History and Future of the Fluorescence Activated Cell Sorter and Flow Cytometry: A View from. 48 (10), 1819-1827 (2002).
- Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Cytometry: today’s technology and tomorrow's horizons. <....
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再版と許可
