懸濁液中の網膜色素上皮細胞を送達するげっ歯類における網膜下注射の実行

サマリー

ここでは、ラットとマウスにRPE細胞のボーラスを網膜下注射するためのマルチメディア形式でコミュニティが受け入れたプロトコルを紹介します。このアプローチは、網膜変性の動物モデルに移植された移植されたRPE細胞のレスキューの可能性、安全性プロファイル、および生存能力を決定するために使用できます。

要約

電気インパルスへの光の変換は、網膜の外側で発生し、桿体および錐体光受容体および網膜色素上皮（RPE）細胞によって主に達成される。 RPEは、光受容体と死亡またはRPE細胞の機能障害、加齢黄斑変性症（AMD）、人々の年齢55歳以上で永久的な失明の主要な原因の特徴であるための重要なサポートを提供します。 AMDの治療法は同定されていないが、罹患した眼における健康RPEの移植が有効な治療であることを証明することができ、RPE細胞の多数は容易に多能性幹細胞から生成することができる。 RPE細胞送達の安全性および有効性に関するいくつかの興味深い問題は、依然として動物モデルにおいて試験することができ、RPEを注入するために使用される広く受け入れられたプロトコルが開発されている。ここに記載された技術は、様々な研究に複数のグループによって使用されており、最初の鋭い針で目に穴を作成することを含む。ブルーレイとシリンジ細胞を装填した針が穴を通って挿入され、それは穏やかにRPEに接触するまで、硝子体を通過するのnt。比較的単純であり、最小限の設備を必要とするこの注入法を用いて、動物モデルにおける光受容体変性のかなりの量を防止するホストRPEとの間に幹細胞由来のRPE細胞の一貫性のある効率的な統合を達成する。実際のプロトコルの一部ではないが、我々はまた、注射によって誘導外傷の程度を決定する方法について説明し、どのように細胞は、生体内の画像診断法で使用して網膜下腔に注入したことを確認します。最後に、このプロトコルの使用は、RPE細胞に限定されるものではない。それが網膜下腔への任意の化合物又は細胞を注入するために使用することができる。

概要

感覚網膜は、ニューロン、グリア、および内皮細胞の機能層に組織化されています。網膜の後ろにある光受容体は光によって活性化されます。光変換を通じて、光子を電気信号に変換し、介在ニューロンによって精製され、脳の視覚野に伝達されます。光伝達は、ミューラーグリア細胞と網膜色素上皮(RPE)細胞の協調的な努力なしには起こり得ません。RPEは、視細胞の真後ろの単分子膜に組織化されており、視細胞機能と恒常性に不可欠な複数の多様な機能を果たします。実際、RPEと光受容体は非常に共依存しているため、1つの機能単位と見なされています。RPEの死または機能不全は、光受容体に壊滅的な二次的影響をもたらし、高齢者の失明の主な原因である加齢黄斑変性症(AMD)に関連しています^1,2。

AMDの治療法は発見されていませんが、いくつかの臨床研究により、RPE細胞の補充が有望な治療選択肢である可能性があることが示されています^3-13。幹細胞技術の出現により、機能的および解剖学的に体細胞に強く類似した胚性および人工多能性幹細胞(hESおよびhiPS)から、in vitroで多数のRPE細胞を生成することが可能になりました^14-26。幹細胞由来RPEは、私たち自身を含む複数の独立したグループによってin vivoで機能し、自発的な網膜変性^{16,18,21,22,25,28,29}のラットおよびマウス系統の網膜変性を大幅に遅らせることが示されています。この臨床的および前臨床的な裏付けとなる証拠の組み合わせは非常に説得力があり、幹細胞由来RPE細胞を用いた網膜変性を予防するためのいくつかの臨床試験が現在進行中である^30,31。

RPEは、hESおよび/またはhiPSから容易に導き出すことができ、種々の誘導および注射技術を用いてげっ歯類の網膜下空間に埋め込むことができる^32,33。(Westenskowらは、私たちが採用している指向性分化プロトコルを示すマルチメディア形式の手法論文を参照してください。³⁴.移植時に外因的に送達されたRPE細胞の安全性、生存率、および機能的能力に関して重要な疑問が残っているため、げっ歯類で網膜下注射を行う能力は重要なスキル^{です16,18,21,29,36,37}。RPEの提供は簡単ではなく、最も効果的な注入技術について分野が分かれています。ここで説明するプロトコルは、RPE細胞のボーラスを網膜下で送達するためのシンプルで効果的な方法であり、幹細胞由来RPE移植の最初の臨床試験で使用された³¹。(読者は、げっ歯類の網膜下注射の別の描写について、Eberle et al.による別のJoVE論文を参照することもできます。³⁸)

この原稿で概説されている技術は視覚化できず、トラウマは避けられません（他の網膜下注射技術と同様です。これは、輪血管のすぐ下に穴を開け、経強膜経路に沿って鈍い針を挿入して、正反対の網膜の下に細胞のボーラスを注入することによって行われます。注射をする人は、鈍い針が網膜に触れると抵抗を感じます。ただし、細胞は注射後に直接視覚化でき、誘導された網膜剥離の程度は、RPE細胞を一過性蛍光マーカーで標識し、共焦点走査型検眼鏡(cSLO)で検出することで決定できます。光干渉断層撮影(OCT)システムを使用して、外傷を監視し、注射部位を簡単に特定することもできます。

プロトコル

注：すべての動物は、スクリップス研究所によって確立倫理指針に従って処理した。

注射用材料の作製（〜20分）

1. 前加温細胞解離溶液（好ましくは血清を、希釈によって不活性化されているもの）、滅菌PBS、および培養培地（ 表1）。
2. それを分解し、15分間水で部品を沸騰させることによりブラントニードル付きシリンジを殺菌する。

注射用RPE細胞の調製（1時間に約30分）

1. 37℃で5-8分間予め温め細胞解離溶液を使用してRPE細胞を切り離す。
2. まだ接続されているものを解放するために静かに細胞をこすり。
3. 解離溶液を不活性化し、それらをカウントする（15mlチューブを埋める）培地の大容量で細胞を希釈する。
4. 細胞をペレットに5分間800×gで遠心分離する。
5. 無菌予め温めPBSに（0.5μlのボリュームに100,000細胞を提供するために）/μL200,000細胞で細胞を​​再懸濁し、1.5 mlのマイクロ遠心チューブにそれらを転送する。
6. 必要に応じて、生細胞一過性の蛍光マーカーを追加し、30〜45分間37℃でインキュベートする。
7. 細胞の0.5μlの鈍針で注射器をロードします。できるだけ早く細胞を注入する。

3.網膜下注射（注射当たり〜5分）

注：可能であれば、輪部の血管が視覚化する方がはるかに簡単であるため、大人のアルビノラットとテクニックを学ぶ。より簡単に注射部位の視覚化を容易にするために、（細胞を注入しようとする前に）学習するときにファストグリーンソリューションを注入。

1. 齧歯類を麻酔。 100 mg / mlのケタミンおよび10mg / mlのキシラジンの腹腔内注射（20μL/ 10グラムボディWを使用して、イソフルラン吸入以上8個）が、げっ歯類を操縦し、吸入器で鼻と眼の中に注入することが困難であるため。
   1. 動物が深く、その足の1をつまんで麻酔をかけていることを確認します。それはフリンチ行動する場合は、さらに数分待ってから網膜下注射を開始する前に、再試行してください。
2. 注入されます目を天井に直面しているように、その側に齧歯類を配置します。
3. 目がソケット（一時的な眼球突出）からわずかに浮き上がるとちょうど耳の上とその顎によると優しくまぶたに皮膚と平行に伸びる2本の指で頭を保持することで、よりアクセス可能になるように解剖顕微鏡下で優しく肌を伸ばす目が（ 図1Cを参照してください）わずかにソケットから飛び出して外れるようにします。喉に近すぎる齧歯類を把握しないでください。
4. 30 Gシャープ使い捨て滅菌済み注射針を使用すると、血管がヒットしている場合は、出血をbします（すぐに輪部の下に穴を作る重要なメールと、後で穴を見つけることは困難である）との角度で針（ 図1D）でレンズに触れないように。発生するシャープ（または鈍い）針または即時白内障形成のレンズに触れないようにしてください。
   注：注射は2人とのより良い仕事。このように1人は、彼らが穴がどこに焦点を維持するために、鋭利な使い捨て針で最初の穴を作成した後に注入を行う人に鈍い針で注射器を渡すことができます。
5. 頭の上にグリップを維持しながら、眼から使い捨て鋭い針を撤回。穴がある場所を正確に覚えておいてください。
6. マイクロマニピュレータに鈍い針で事前にロードされた注射器を取り付けたり、手でそれを保持しているいずれかの後、穴を介して鈍針で注射器の先端を挿入し、レンズに触れないように再び注意しながら、静かに目を通してそれをプッシュするとても優しく感じ抵抗（ 図1D）まで、。
7. K最小限にすべての動きをeeping、慎重にゆっくりと網膜下腔へのRPE細胞を注入する。
   注：RPE /網膜剥離が誘発されます。これは避けられない。しかし、クリーナー注入は剥離を最小限に抑え、大幅に再付着（ 図1E）の可能性を向上させます。任意の誇張された動きが戻って網膜に針を移動させることができる、と横の動きが網膜を損傷することがあります。噴射ポンプの使用は任意であるが、非常に正確な送達を可能にする。
8. ゆっくりと注射器を撤回。目の保湿を適用することは、水和目を維持するためにドロップされます。
9. それは胸骨横臥位を取り戻すまで、動物を監視し続ける。それは胸骨横臥位を取り戻すまで、無人の動物を残したり、他の警報動物とケージに戻らないでください。

結果

我々は、この原稿に記載された技術を使用して迅速かつ一貫してげっ歯類の網膜下腔へのRPE細胞の懸濁液を提供することができます。必須ではありませんが、外傷が大幅に図1A＆Bでマイクロマニピュレーターで示した設定を使用して最小限に抑えることができます。一時的な眼球突出については、図1（c）に示すように齧歯類を持ってください。マイクロマニピュレーターで、または手動で実行した場合の手順は同じです。これらは、 図1Dにおける漫画に描かれている。実行したときにきれいに標識されたRPE細胞からの蛍光CSLOを用いて検出することができ、誘導された網膜剥離は、OCTシステム（ 図2）を使用して見ることができる。 図3にCSLO（ 図2および図3からの画像が網膜下注射直後捕獲された）全体の注射部位の周りの複数の画像をキャプチャするために使用した。 mは剥離に注意してください中央の画像（3-5）で深遠な（しかし激しい）OST。...

ディスカッション

この記事では、ラットおよびマウス中に懸濁したRPE細胞の網膜下注射を実行するための比較的簡単な方法を記載する。プロトコルは、学習が容易で技術に多くの経験が（ 図3;これは、より良い注射のうちの1つを表す）より少ない外傷に翻訳し、マイクロマニピュレーターが（ 図1A）を使用している場合は特に。任意の外傷CSLOおよびOCTシステム（ 図2）利用可能な場合に、in vivoでモニターすることができる。高い解像度とノイズの少ない画像が所望される場合、技術の画像化プラットフォームの状態は、マウス疾患モデル^39-41でOCTを行うための優れたプロトコルと共に利用可能である。

この技術に関連した最も一般的な合併症は、脈絡膜出血を引き起こし、過剰な網膜剥離を誘導手術中に動物の位置ズレに起因し、針からRPE細胞の逆流。配置した場合不適切に、それは最初に穴を作成することは困難、と後にそれを見つけることがさらに困難になります。目のシフトが不可能な鈍針で貫通を作り...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2-メルカプトエタノール (55 mM)	Gibco	21985-023	50 ml x 1
Cell Scapers	VWR	89260-222	ケース x 1
CellTracker Green CMFDA	Molecular Probes	C34552	50 & micro;g x 20
DPBS、カルシウム、マグネシウムなし	Gibco	14190-144	500 ml x 1
ファストグリーン	シグマ-アルドリッチ	F7258	25 g x 1
Genteal Geldrops中等度から重度の潤滑剤点眼薬	ウォルマート	4060941	25 ml x 1
ハミルトン モデル 62 RN SYR	ハミルトン	87942	シリンジ x 1
ハミルトン針33 G、0.5インチ、ポイント3(304ステンレス鋼)	ハミルトン	7803-05	針x 6
ノックアウトDMEM	Gibco	10829-018	500 ml x 1
ノックアウト セラム リプレイスメント	Gibco	10828-028	500 ml x 1
L-グルタミン 200 mM	Gibco	25030-081	100 ml x 1
マグネットスタンド	ライカバイオシステムズ	39430216	スタンド x 1
MEM 非必須アミノ酸溶液 100X	Gibco	11140-050	100 ml x 1
マイクロマニピュレーター	Leica Biosystems	3943001	マニピュレーター x 1
ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/ml)	Gibco	15140-122	100 ml x 1
スリップチップシリンジ 針なし BD (3ミリリットル)	VWR	BD309656	パック×1
特殊針 BD (30 g、1インチ)	VWR	BD305128	Box x 1
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Gibco	12604013	100ml x 1