ラット視神経への注入のための低侵襲テクニック

サマリー

ラットの視神経への直接注射は、再生研究に役立ちます。私たちは、頭蓋骨を開くことなくラットの視神経に直接注射する低侵襲技術を示しています。この方法を使用すると、外科的合併症が最小限に抑えられ、回復が迅速になります。

要約

ラットの視神経は幹細胞再生研究のための有用なモデルです。ラット視神経への直接注射により、骨を切除することなく低侵襲手術で中枢神経系に送達することができます。この技術は、眼窩隆起からの軽度の筋膜解剖後の視神経の視覚化と直接注入へのアプローチを説明しています。結膜牽引縫合糸を使用して、眼球を穏やかに引き下げて引き抜きます。視神経を注入した代表的な例は、染色したビーズの注入が成功したことを示しています。

概要

視神経は、中枢神経系（CNS）は、視神経炎、緑内障および外傷などの眼科条件を含む再生研究のための理想的なロケーションを提供します。幹細胞の種々の注射は、いずれかの軸索の数を増加させ、および/ ​​または変性疾患を予防効果を示したか、失われたミエリンの取り付けの見込みを示している^。1,2

人間の視神経が約3.0〜3.5ミリメートルの直径を有する視交叉に網膜から走行約120万平行軸索が含まれています^。3、実験室でヒト疾患をモデル化するために、ラットは、頻繁に使用されています。成体ラットの視神経は、約0.5mmの直径内に約10万軸索を含んでいます。CNS再生研究の主な制限の⁴つは、直接骨なしアクセスです。頭蓋骨や脊椎骨が除去されたときに、動物に、合併症、手術リスクが高くなっています。の利点と同様に、頭蓋骨のオファー減少合併症、より迅速な回復を開かずに脊椎における低侵襲アプローチ^、5直接視神経注射。

この技術は、以前の研究で使用されてきた^。6本稿および付随ビデオでは、我々はラット視神経に幹細胞を注入するための低侵襲性の手順を示します。

プロトコル

注：すべての動物の手順は、ジョンズ·ホプキンス大学動物実験委員会によって承認されました。麻酔機は、必要に応じて毎年点検とキャリブレーションが必要です。

1.麻酔とポジショニング

1. 麻酔。
   1. 2〜3％のイソフルラン麻酔下で、すべての外科的処置を実行します。つま先のピンチと呼吸数による麻酔の適切なレベルを確認してください。ラットはつま先のピンチに反応して尻込みしていないことを確認してください。
      注：フリンチは遅すぎる麻酔を示し、開始前に長い麻酔以上イソフルラン濃度を必要とする場合があります。 2秒ごとに麻酔を示す遅すぎる1息未満の呼吸率が高すぎて、イソフルラン濃度の軽量化が必要な場合があります。
   2. 手順中にヘッドの移動を避けるために、必要に応じて動物を固定します。外科的な目にリドカインのドロップを置きます。麻酔下ながら乾燥を防止するために、人工涙液を10分ごとに使用します。与えます0.01ミリグラム/ kgのSC手術前にし、その後、6-8時間のブプレノルフィンの注射は、必要に応じて。
2. ポジショニング。
   1. 定位フレームにラットを配置し、加熱パッドで暖かく保ちます。目の露出を避けるために注意しながらアルコールと頭皮の毛をぬらし。術後感染症のリスクを最小限に抑えるために、滅菌ツールおよび滅菌技術を使用してください。

2. Eyeコントロール

1. 横結膜に4-0縫合糸を置き、穏やかなトラクションを可能にするのに十分な縫合糸でそれを結びます。

3.解剖

1. 最初の解剖。
   1. 図1に示すように、サイズ10メスを用いて軌道尾根の上を覆う皮膚中〜1インチの切開を行います。皮膚とその下の筋膜を引っ込め、慎重に筋膜を離れて解剖。外科的に過度の出血を防止するために、筋膜を切開しながら、血管を切断しないようにします。 PL戦略的に使用します止血を提供するために、綿のヒントを出し抜か。
2. 深く解剖。
   注：ダウンし、ソケットから目を引く結膜にやさしい牽引すると、優れた軌道筋肉が見えてきます。視神経を露出させるために、この筋肉を切断する必要があり、眼窩脂肪を除去しました。脂肪は破棄することができ、注入後に交換するべ​​きではありません。この点から、視神経筋膜は、硬膜に包まれた血管（ 図1）と一緒に、視神経自体の束として表示される必要があります。
   1. 低外傷性穿孔するためにメスまたは31ゲージベベル針を用いて硬膜内の小さな切開を行います。

4.ピペットインジェクタ

1. 50〜100ミクロンの直径にガラスマイクロピペットを引き出します。安定性を提供するために、マイクロマニピュレータにマイクロピペットをマウントし、注入ポンプに接続されたハミルトンシリンジに接続します。
2. ビーズを引き上げ（または幹細胞）前後のメチルブルー溶液0.5μlの体積と一緒に逆行マイクロピペットに0.5〜1.0μlのボリュームに再構成しました。
   注：毎分0.5〜2μLに設定注入速度は、視神経への外傷を防ぐことができます。

5.インジェクション

1. ただ、ニックの入った硬膜上記視神経にマイクロピペットの先端を下げます。
   注：少なくとも損傷で視神経結果にガラスチップの小さな、しかし、活発な動き。輸液ポンプが始まると、メチル青色色素を注入視神経の領域を強調表示する必要があります。色素はくも膜下腔に漏出することなく、視神経内に局在したまま必要があります。
2. 幹細胞の注入が完了すると判断し、メチルブルーの第二の用量が注入されるように注入ポンプをオフにするためにメチルブルーの第2帯域に従ってください。高い防ぐために注入し、それぞれ1μlのボリュームの2分間の視神経内にまだマイクロピペットを保ちますマイクロピペットの離脱時の圧力噴出。
   注：別のアプローチは、手動で操作することができ、空気充填された注射器にピペットチップを接続することです。いずれにしても、視神経の損傷を最小限に抑えるために無理な力を避けます。私たちは、それぞれの視神経にボリュームのない2以下μLを注入することをお勧めします。

6.フォローアップ

1. 即時。
   1. 注入が完了すると、止血を提供するために使用される任意の綿のヒントと一緒にマイクロピペットを削除します。 3-0シルクで皮膚を縫合し、結膜縫合糸を除去します。
   2. 彼らは麻酔から出てくるまで、加熱パッド上に暖かいラットをしてください。それは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人動物を放置しないでください。完全に回復するまで、他の動物の会社に手術を受けた動物を返しません。
   3. 動物は、過度の嗜眠、運動失調、またはこじつけbreathin含む痛みの徴候を示している場合gであり、1日3回まで筋肉内ブプレノルフィン（0.05ミリグラム/ kg）で適切な鎮痛を管理します。
2. 長期。
   1. 次の24〜48時間、腫れや放電傷から、またはそのような発声、猫背外観、非グルーミング、または食べていないような痛みの他の徴候を含む、手術の合併症のラットを観察します。必要に応じて獣医師や倫理的安楽死との協議を検討してください。

結果

実験の終わりに、ラットを屠殺し、4％パラホルムアルデヒドで灌流しました。視神経を注意深く切開し、クライオスタット切片のために取り付けられた2はエバンスブルー色素部位を可視化するために注入された低電力でラット全視神経の一例を示す図 。矢印は注射の正確な位置を特定します。神経ダウン色素の制限拡散によって示されるように、この切開は、注射の数分以内に行われました。他の注射では、数時間かけて視交叉に向けて染料の遅い拡散を観察しています。

図1：ビューの外科分野のラットは、この図では、左眼にアクセスするために配置されています。切開を軌道尾根と筋膜の上に作られて組織は、目の後ろにダウン解剖されます。結膜縫合糸は、オペレータが頭蓋骨を開くことなくビューに頭蓋内視神経を引く穏やかなトラク...

ディスカッション

幹細胞または再生を促進することを目的とした他の製品の視神経への直接注射は、CNSへの他の注射手段と比較して便利なモデルを提供します。この技術は、時間がかからず、全麻酔が少なくて済み、頭蓋骨や骨組織の穴あけや除去を回避し、合併症の発生率を減らし、手術後のより迅速な回復を可能にします。

このプロトコルの最も重要なステップには、次のものが含まれます: 1. 視神経束を明確に視覚化できるようにするための手術野での適切な止血、2. 最小限の外傷で視神経に簡単に挿入できるピペットチップの正確な測定、3. 視神経の最適な露出を可能にする結膜縫合糸を使用した眼の厳密な制御。

視神経への代替の側方アプローチは以前に説明されており、頭蓋骨を解剖することなく視神経に直接注射することもできます。⁶ 私たちの経験では、側視は網膜のすぐ後ろの極近位視神経に限定されています。私たちの優れたアプローチでは、視神経の大部分が見えるため、近位視神経と中視神経の両方に注射できます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ルイスラット	チャールズリバー4		ラット株でも機能します。
麻酔器	Surgivet	CDS9000	CDS 9000 小動物麻酔器 - ポールマウント
輸液ポンプ	Stoelting	53129
解剖顕微鏡	National Optical	409-411-1105
光ファイバー光源	フィッシャーサイエンティフィック	12-562-21
解剖および脳定位固定装置	Stoelting	51400
ペットプー	ラーKopf	750
ピペット	世界精密機器	18150-6
使い捨てメスブレードハーバー	ド装置	810-15-021
虹彩切除はさみ	顕微鏡科学	ユニバンドLA-4XF