末梢血からのヒトアロ抗原特異的T細胞の生成

サマリー

この記事は、定義された同種抗原に特異的に応答するヒトT細胞クローンの生成と増殖の方法について説明しています。このプロトコールは、さまざまなペプチド-MHCリガンドに特異的なヒトT細胞のクローニングに適合させることができます。

要約

ヒトTリンパ球の生物学の研究は、しばしば活性化リガンドに対する応答の調査を含みます。T細胞は、T細胞受容体(TCR)を介してMHC(ヒトオルソログHLA)分子によって提示されるプロセシングペプチド抗原を高感度かつ特異的に認識し、応答します。T細胞の主な機能は、自己MHCによって提示される外来抗原に対する防御免疫応答を媒介することですが、T細胞は同種組織における抗原の違いに対して強く応答します。同種抗原に対するT細胞の応答は、直接的または間接的な同種活性として説明できます。アロア活性では、T細胞は、提示されたペプチドとMHC分子の両方を高度に特異的に認識することで応答します。同種刺激に対するT細胞の堅牢なオリゴクローナル応答は、同種組織に存在する多数の潜在的に刺激的な同種抗原を反映しています。同種T細胞応答の幅広さは、移植片対宿主病や同種移植片拒絶反応など、生物学的に関連する同種反応に関連する病理を開始および媒介する重要な要素ですが、同種リガンドに対するT細胞応答の解析を妨げる可能性があります。この目的のために、このプロトコルは、既知のペプチド-MHC(pMHC)同種抗原に応答するナイーブなヒト末梢血白血球(PBL)からアロリアアクティブT細胞を生成する方法を説明する。このプロトコールは、pMHCマルチマー標識、磁気ビーズ濃縮、およびフローサイトメトリーを、同種抗原特異的T細胞クローンを作製するためのシングルセルin vitro培養法に適用します。これにより、同種刺激に応答するT細胞の生化学と機能の研究が可能になります。

概要

Tリンパ球は、適応免疫系の重要な構成要素である。 T細胞だけでなく、直接のエフェクター機構の様々を通して病原体に対する防御免疫応答を媒介するだけでなく、積極的な免疫学的自己寛容を維持し、免疫系の他の細胞の応答を指示するための責任がある。これらの機能は、T細胞受容体（TCR）ライゲーション、サイトカインおよびケモカインを含む統合された信号の数、および代謝産物¹を介して導かれる。これらの信号のうち、TCRは、適応免疫におけるT細胞の役割を定義する特徴的な特異性を提供するので、特に重要である。 TCRは、T細胞エフェクター機能を開始する信号を提供するために、高度に特異的かつ高感度な方法でMHC（ヒトオルソログHLA）分子（pMHC複合体）によって提示された線状ペプチド抗原と相互作用する。 pMHC複合リガンドとTCRとの相互作用の生化学的パラメータだけでなく、Tに対する特異性を提供する細胞の活性化だけでなく、その後のT細胞機能²に定性的な影響を与える。したがって、T細胞の機能を研究することは、多くの場合に定義された抗原特異性を有するクローン性T細胞の応答を調べることが必要である。

約10 ^12αβT細胞を含むヒトT細胞区画、推定された10 ⁷個含まれている- 10 ⁸の異なる^{αβTCRs3-4。}この多様なレパートリーは、防御免疫のためのT細胞応答を必....

プロトコル

注意：このプロトコルは、ヒトボランティアから末梢血サンプルを使用する必要がある。ヒト被験者を持つすべての研究はヘルシンキ宣言（2013）1996年の医療保険の携行性と責任法の遵守を確実にするために人間学部治験審査委員会によって審査され、承認されるべきである。

全血由来のT細胞の単離

1. 開始する前に、室温に密度勾配媒体を温める。アリコート2-4無菌の15ミリリットルの円錐遠心管に密度勾配培地4ml（1チューブは、それぞれ10ミリリットルに希釈した血液の総容積のために使用される）。
2. コー​​ティングされた1-2ヘパリンナトリウムスプレー（緑·トップ）静脈採血管中の血液の10〜20ミリリットル得る。訓練された個人の監督下でヒト検体を収集し、治験審査委員会によるとプロトコルを承認した。
3. 70％エタノールでチューブの外側を拭きます。注意深くFiのの上部を取り外し収集チューブをlledおよび無菌50ml遠心チューブに血液をデカントする。
4. 各採血管10 mlの滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を加える。 、PBSを収集デカント全血に追加し、穏やかに混合する。
5. 25μlのヒトT細胞濃縮カクテル/ 2ミリリットルの合計容量を追加します。 20分間室温でインキュベートする。
6. 密度勾配媒体の上に静かに1希釈した血液10 mlピペットを用いて、1を10mlまで層。密度勾配媒体の表面を乱さない....

結果

戦略をソーティングサイトメトリー、磁気ビーズ濃縮および単一セルの流れを経由して特異アロ抗原に定義され、このプロトコルは、クローン性ヒトT細胞培養物の生成を説明しています。 図1は 、プロセスの概要を提供します。

図1：プロトコルの概要ここで説明するプロトコルは、末梢血からのアロ抗原特異的ヒトT細胞クローンの生成のための信頼できる方法を提供する。単一のT細胞の単離および細胞培養を設定するプロセスは、約4.5時間かかると予想される。 T細胞クローンの拡大は、各服用14日間、非特異的T細胞の刺激は、培養の複数のラウンドを必要とする。クローン培養は、28日後に分離アロ抗原特異性について試験することができる、そして培養物をさらに繰り返すrounによる追加試験のために拡張す.......

ディスカッション

T 細胞の同種反応性は、長い間研究され、臨床的に関連する現象です。同種刺激に対するT細胞の強力な増殖およびエフェクター応答により、不活化同種細胞に対する末梢血T細胞の比較的単純な混合リンパ球反応を通じて、 in vitroでの ヒトT細胞応答の広範な分析が可能になりました。ただし、これらの一次同種反応性 T 細胞応答はオリゴクローナルであり、特定の同種抗原に応答する多数の個々の T 細胞で構成されています。T細胞応答のこの多様性は、同種反応性T細胞応答を促進するpMHCリガンド認識の生化学を調べる能力を損ないます。この課題に対する標準的な解決策は、特定の同種細胞株による刺激を繰り返し、希釈分析を制限することによってクローンT細胞株を生成することでした。このアプローチは、単一の特異性を持つクローンT細胞株を生成できますが、ナイーブT細胞のオリゴクローナル応答の元の組成を反映していない可能性があります。さらに、このアプローチは、認識された特定のpMHC同種抗原を直接同定しません(単一のHLA分子への応答を狭めても、定常状態で提示された推定2x10⁴ の内因性ペプチドの中から刺激ペプチドを見つけるという.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ナトリウムヘパリン静脈採血チューブ 16 x 100 mm	ベクトン、ディッケンソンアンドカンパニー	366480
Lymphoprep	Stemcell Technologies	7801
ロゼットSepヒトT細胞濃縮キット	Stemcell Technologies	15061
ダルベッコのPBS、CaまたはMgなしの1x	コーニング	21-031-CV
ウシ血清アルブミン	Sigma-Aldrich	A7906
EDTA	Sigma-Aldrich	E6635
Fluorophore-labeled pMHC tetramer	NIH Tetramer Facility	NA
EasySep ビオチン選択キット	Stemcell Technologies	18553
EasySep Selection 磁石	Stemcell Technologies	18000
TruStain FcX Human Fc ブロッキングソリューション	バイオレジェンド	422301
抗 CD5 PE-Cy7 (クローン UCHT2)	バイオレジェンド	300621
抗 CD14 FITC (クローン HCD14)	バイオレジェンド	325603
抗 CD19 FITC (クローン HIB19)	バイオレジェン	302205
イスコーブの DMEM、b-ME または L-グルタミンなし	コーニング	15-016-CV
HEPES	コーニング	25-060-CI
b-メルカプトエタノール	Life Technologies	21985-023
Glutamax	Life Technologies	35050061
ゲンタマイシン硫酸塩 (50 mg/ml)	Omega Scientific	GT-50
ヒトAB血清、男性ドナー	Omega Scientific	HS-30
組換えヒトIL-2	Peprotech	AF 200-02
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28	Lifeテクノロジー	11131D
培地
細胞選別バッファー
PBS、pH 7.4	1 L
BSA	10 g
EDTA (0.5 M)	2 ml
ヒト T 細胞培養培地
Iscove's DMEM	351.6 ml
熱不活化ヒトAB血清	40 ml
HEPES (1 M)	4 ml
グルタマックス (100x)	4 ml
ゲンタマイシン (50 mg/ml)	0.4 ml
b-メルカプトエタノール (14.3 M)	1.4 ml
組換えヒトIL-2 (1 mg/ml)	1 ml

ド