マルチとシングルセルベース球アッセイを用いてヒト卵巣癌細胞における幹細胞特性の評価

サマリー

In vitro spheresアッセイは、がん幹細胞を同定するために一般的に使用されています。ここでは、シングルセルベースのスフィアアッセイとマルチセルベースのスフィアアッセイを比較します。より手間のかかるシングルセルベースのアッセイやメチルセルロースの補給は、より正確な結果をもたらしますが、液体培地で実施されるマルチセルベースのアッセイは、細胞密度の影響を大きく受ける可能性があります。

要約

長年の研究によると、卵巣がんは、従来の化学療法後の腫瘍の開始、維持、再発に関与する、いわゆる「がん幹細胞」(CSC)の亜集団を含む細胞の不均一な混合物を保有しています。したがって、卵巣CSCの同定は重要な目標です。in vitroでCSCの可能性を評価するために一般的に使用される方法は、成長因子を添加した無血清培地で細胞を非接着培養条件下でプレーティングし、数日後に球体形成をスコアリングするスフィアアッセイです。ここでは、ヒト卵巣がん球アッセイに現在利用可能なプロトコルをレビューし、一般的に使用されるマルチセルベースのアッセイとシングルセルプレーティングに基づくより正確なシステムとの並行分析を行います。私たちの結果は、マルチセルベースとシングルセルベースのスフィアアッセイの両方を使用して、in vitroでスフィア形成を研究できることを示しています。より手間がかかり、高価なシングルセルベースのアッセイは、個々の細胞の機能評価に適しており、全体的により正確な結果につながりますが、マルチセルベースのアッセイは、プレーティングされた細胞の密度に強く影響され、事前に滴定実験が必要です。マルチセルベースのアッセイへのメチルセルロース補給は、機械的アーチファクトを減らすために効果的に使用できます。

概要

卵巣癌は細胞の不均一な混合物で構成されており、従来の細胞傷害性治療^1-3後の疾患の開始、維持、再発に関与するいわゆる「癌幹細胞」(CSC)を保有しているという証拠が増えています。したがって、卵巣CSCを標的とする分子戦略の開発は重要な目標であり、卵巣がん患者の治療を改善することが期待されています。

CSCの分子的特徴を理解するための前提条件は、非CSCからの信頼性の高い分離です。しかし、卵巣CSCの同定は困難であるように思われる。CD133の発現とアルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH)活性^4,5は卵巣CSCをマークすると報告されていますが、一部のデータはこれらのマーカーが不安定であることを示しています⁶。一貫して、卵巣癌では、例えば乳癌⁷以外の卵巣癌では、ALDH1の発現は良好な結果⁸と関連し、提案された幹細胞マーカーCD44変異体の発現は予^後的価値を有さない9。最近では、胚性幹細胞タンパク質SOX2の発現が卵巣癌細胞に幹細胞性を付与すること^を示し10、SOX2の高発現が臨床的に侵攻性の卵巣癌および乳癌と関連することを示しました^11,12。そこで、本報告では、SOX2制御領域によって発現が制御されている赤色蛍光タンパク質(RFP)を含むレンチウイルスレポーターコンストラクトを、推定される卵巣CSCを単離する方法として用いる。

定義上、CSCは自己複製と分化の両方を行うことができ、すべての腫瘍細胞タイプを生み出します。推定されるCSC集団は、in vivoで実施される機能アッセイで分析する必要があります。明らかな理由から、ヒト細胞では、そのような機能試験は異種移植アッセイに限定されており、主にヒト腫瘍細胞の免疫不全マウスへの移植を含む^10,13。

ブレント・レイノルズとサム・ワイスによって、神経細胞の幹電位を評価する代理アッセイとして、いわゆるニューロスフィアアッセイを最初に報告した別のin vitro法が提供されました¹⁴。Dontu氏らは後に、このアッセイを乳房細胞の幹細胞電位の評価に使用したことを確認しました^15,16。ここでは、上皮成長因子(EGF)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、B-27、およびヘパリンを添加した無血清培地にヒト乳腺細胞を異なる数でプレーティングし、非接着条件下で7〜10日間培養した後、顕微鏡で球体形成を採点しました。このプロトコルに従って、細胞数、増殖培地、サプリメントを一部調整しながら、いくつかのグループは、乳房¹⁷、脳¹⁸、膵臓¹⁹、結腸²⁰腫瘍などのいくつかの種類のがんからin vitro幹細胞の可能性を調査しました。卵巣癌では、最近、スフィアアッセイの実現可能性を報告し、その結果をin vivoマウス異種移植モデル¹⁰で収集された結果と比較しました。幹細胞タンパク質SOX2の過剰発現が、ヒト卵巣癌細胞のin vitro球形成とin vivo腫瘍形成の両方を促進することを見出しました¹⁰。しかし、球状開始細胞の頻度は、in vivoで測定された腫瘍開始細胞の頻度よりも高かった¹⁰ このことから、球状アッセイが技術的な理由により偽陽性の結果をもたらすか、あるいは、in vivoアッセイが非効率的で偽陰性の結果をもたらす可能性があることを示唆している。

このレポートでは、マルチセルベースの卵巣球アッセイをより詳細に分析し、文献で利用可能なさまざまなプロトコルをレビューし、それらをシングルセルベースのアッセイと比較します。我々は、シングルセルベースのアッセイが、メチルセルロースを培養物に添加して細胞を固定化しない限り、プレーティングされた細胞の密度に大きく影響される可能性のあるマルチセルベースのアッセイよりも正確で再現性のある結果を提供することを示しています。しかし、シングルセルベースのアッセイでも、in vitroの球体開始電位は、in vivoの腫瘍開始電位よりも高い頻度で観察されます。

プロトコル

安定SOX2規制地域レポーター構築物を含むレンチウイルスで形質導入されたOVCAR-3ヒト卵巣癌細胞の1世代

1. ^10,21が説明されているようにSOX2調節領域を認識レポーター構築とHEK 293T-パッケージング細胞株をトランスフェクションすることによってレンチウイルス粒子を生成します。
   注：レポーター構築物はさらに、先にtdTomatoの蛍光タンパク質のProteoTunerシステムシールドシステムの不安定化ドメインを含む。 Shield1を、それにより蛍光タンパク質^22を分解するためのプロテアソームを防止不安定化ドメインに結合する。
2. 24時間の期間にわたって、レンチウイルス粒子を有するOVCAR-3細胞を形質導入する。その後、ウイル​​ス上清を除去し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、完全培地中で培養した（RPMI、10％FBS、100 U / mlのペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン）で細胞を洗浄する。
3. 48時間後、10μg/ mlののプーロマイシンを培養物に添加し、適切に形質導入​​された細胞の選択を可能にするために5日間維持した。

細胞選別、めっきの作製

1. 前細胞選別1,000希釈24時間：1でのShield1を追加します。ネガティブコントロールとしてのShield1処理（ 図1）することなく、安定的に形質導入されたOVCAR-3細胞を使用してください。フラスコから培地を吸引除去し、3分間、0.05％トリプシン-EDTAを用いて細胞を1×PBSで細胞を洗浄し、トリプシン処理。
2. 5分間 - （25°C 15）完全培地を使用してトリプシンを停止し（上記参照）、細胞数をカウントし、室温で300×gで遠心分離細胞。
3. 1mlの滅菌PBS - 0.5に慎重に上清を再懸濁細胞をデカントします。
4. 単一細胞懸濁液を得るために、40μmのセルストレーナーキャップフィルタを使用する。
5. ミリリットルあたり5万個の細胞に細胞数を調整します。
6. 培地を100μlの球で超低付着の96ウェルプレートを準備し（MEGMは、増殖因子、サイトカイン、およびサプリメントを補充B-27、ヘパリンナトリウム;またはDMEM / F12）は、 表1を参照して、1％メチルセルロースの添加の有無にかかわらず、成長因子、サイトカイン、およびサプリメント、B-27、ヘパリンナトリウムを補充した。必要に応じて可能な汚染のリスクを最小限にするために100 U / mlのペニシリンおよび100μg/ mlのストレプトマイシンの濃度で培地に抗生物質を加える。
7. ソートRFP +上から調製した96ウェルプレートにRFP-細胞を、ウェルあたり1細胞（単球、細胞ベースアッセイ）及びウェル当たり100細胞（多細胞ベースの球アッセイ）。 100μノズル、シース圧力20 PSI、および歩留まりマスク0、純度マスク32、位相マスク16：シングルセルモード、ソートセットアップを使用して（ 材料を参照）ソートで市販のセルソーターを実行します。
8. 多細胞ベースのアッセイのために（顕微鏡的（単一の細胞ベースのアッセイのために）細胞を含むウェルをスコアによって個々のウェル中の細胞数を計数することにより、めっき効率を評価する; 図2 ）。
9. 37℃、5％CO ₂で（組成についてステップ2.6参照）培地球における標準条件下で細胞をインキュベートする。毎日のbFGF（20ng / ml）およびEGF（20ng / mlの）を補完する。
10. 1週間後、統合されたレポーターシステムからの蛍光シグナルを検出するための4倍または10倍の倍率蛍光顕微鏡で標準的な顕微鏡を使用して、新たな腫瘍球の数を数える。 「大」球としては100μmを超える直径の球をカウントし、直径50球- "小さな"球（ 図3）としては100μm。あなたが本当の球をカウントし、クラスターをセルではないことを確認してください。
    注：単一のセルベースアッセイでは、球形成は文化の10（7対）日後に顕微鏡的に得点する方が簡単です。
11. RFPの+中球形成細胞の割合を計算し、それぞれの単一細胞ベースのアッセイ（各個々の実験のために1枚の96ウェルプレート）または多細胞学士でRFP-細胞ショーらによって提示されたsed球アッセイ（各個々の実験用のウェル^）。16
    注：細胞を形成する球の割合（％）=（球の数）/（播種した細胞数）×100

球の3連続継代

1. RTで10分間300×gで、適切な滅菌チューブと遠心分離機における各ウェルのコンテンツを配置します。マルチセルベース球アッセイのために、1つのウェルから球を一緒に集める。 PBSおよび2分より長い遠心分離機で5回 - よく3を洗う。単一細胞ベースの球アッセイのために、個々の球を集める。起因する細胞の数が少ないために、遠心分離および洗浄工程では1.5 mlチューブを使用しています。
2. 0.05％トリプシン-EDTAの200μlの上清と再懸濁ペレットを削除します。
3. 最適な細胞分離を達成するために、ソフトシェーカーで5分間、37℃で細胞懸濁液をインキュベートする。細胞死率を下げるためにあなたの細胞株について、トリプシン処理時間を最適化：なし大型た場合球は穏やかに100μlのピペットチップを用いて可視粉砕物である。ケースで大球は、まだ存在している別の3分のトリプシンでインキュベートした後、トリチュステップに進みます。シングルセルベースアッセイの場合、トリプシン処理工程中の生きた細胞の最適な細胞収量のための時間を最適化するようにしてください。
4. トリプシンを不活性化するために、単一細胞アッセイの場合には、10分間、500μlのに追加の2分間の遠心分離を300×gで遠心分離し、完全培地を加える。
5. 球培地に注意深く上清および再懸濁細胞を除去する。
6. 単一細胞懸濁液を得るために、40μmのセルストレーナーキャップフィルタを使用する。
7. RFP +および多細胞bassedアッセイにおいてRFP-細胞を用いる場合には、フローサイトメーター分析を介して十分に再懸濁した後、各蛍光細胞の割合を評価する。
8. 上記で詳述したように調製した単一細胞の連続再プレーティングアッセイ、シードウェルあたり1細胞の新しい超低付着の96ウェルプレートに用。 1個々の球体からは、約20個々のウェルをシード。マルチセルベースの​​プライマリ球の再プレーティングアッセイのために、種子細胞を新しい96ウェルプレートに一次球の1つのウェルから得られ、顕微鏡法によって細胞数を翌日カウント。
9. ステップ2.11で説明した式を用いた二球アッセイにおける球形成細胞の割合を評価する。

4.結果解析

1. 独立した三連で行われた実験の結果を分析し、統計分析のために、正規分布の値とそれ以外のマン - ホイットニー·テストを分析するために、両側スチューデントのt検定を使用しています。

結果

従来の球アッセイにおいて、RFP + OVCAR-3細胞の約40％対RFP-細胞の20％が一次球アッセイにおける個々の腫瘍球（ 図4A）を生じた。また、RFP +細胞によって形成球体はRFP-細胞によって形成されたものよりもサイズが大きかった。

単一細胞に基づくアッセイでプレーティングすると、RFP +細胞はまた、上記の結果を確認し、RFP-細胞より球を形成した。しかし、多細胞ベースのアッセイ（ 図4A、B）対単一に播種あたり少ない球体の発生傾向が、このアッセイにおいて、球体の形成は、機械的な球融合または解離などの技術的成果物を介してバイアスされてもよいことを示してあった非接着性培養培地中。

さらにこれらの側面を探るために、我々は、球形成に及ぼす細胞播種密度の影響を比較した。私たちは96でウェルあたり1セルに1,000個の細胞から限界希釈を用いて細胞をメッキ型ウェルプレートおよび新興球の数が最初に播種した細胞の数に大きく依存していたことがわかった。驚くべきこと...

ディスカッション

球培養物は、癌幹細胞は、潜在的なアッセイおよびヒト腫瘍細胞^15,25,26広範囲の幹様細胞を濃縮するために広く用いられている方法である。これらの培養条件下で、自己複製能を欠く癌細胞は分化し、最終的に細胞死を受けることが予想される。彼らは当初、特に第一のアッセイであっても腫瘍球を細胞クラスターを形成するか、またはかもしれないが、それらは、自己複製の特性の欠如にシリアル再プレーティングの際に球形成能力を維持することができません。球アッセイのCSCを識別し、全腫瘍細胞集団におけるそれらの頻度を評価するための代理アッセイとして使用されている。

球アッセイは、異なる公開されたプロトコル^{5,10,27-35（} 表1）に続いて実行の間しかし、実質的な変動を観察することができる。私たちの研究室では、以前にMEGMを用いて、ヒト卵巣癌細胞から球形成を公開しているB-27を補った、bFGFを、ヘパリンおよびSingleQuot ^TM（インスリン、REGFおよびヒドロコルチゾンを含む）。一部のみB-27と...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
低アタッチメントプレート	コーニング	3474
MEGM	ロンザ	CC-3151
インスリン	ロンザ	CC-4136	SingleQuots™キット
ヒドロコルチゾン	ロンザ	CC-4136	SingleQuots™キット
	EGFロンザ	CC-4136	シングルクォート&貿易;キット
EGF	Sigma	E9644	末端濃度: 20 ng/ml
FGF	PeproTech	100-18B	末端濃度: 20 ng/ml
B-27	Invitrogen/ Gibco	17504-044	末端濃度: 1X
Heparin-Natrium-25000 IE	Ratiopharm	N68542.02	希釈率 1:1,000
Pen/Strep	Gibco	15140-122
FCS	Gibco	10500-064
RPMI 1640	Gibco	21875-034
トリプシンEDTA	Gibco	25300-054
Dulbecco 's PBS (1X)	Gibco	14190-094
Shield1	Clontech	632189	希釈 1:1,000
DMEM/F12	Gibco	21041-025
DMEM/F12 (粉末)	Gibco	42400-010
メチルセルロース	Σ	M0387
ピュロマイシン二塩酸塩	Applichem	A2856
セル選別機	BD		Aria III 細胞選別機
FACS アナライザー	BD		Accuri c6 フローサイトメーター
顕微鏡	オリンパス		IX50 オシリス