このレポートの目的は、胚様体の異なるサイズを使用して人工多能性幹（iPS）細胞から網膜色素上皮（RPE）を導出するためのプロトコルを記述することである。
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この記事について
サマリー
要約
多能性幹細胞は、無限に増殖し、ほぼすべての細胞タイプに分化する能力を持っています。また、体細胞を人工多能性幹細胞(iPS細胞)にリプログラミングする技術の開発は、カスタマイズされたパーソナル再生医療の可能性に対する関心と興奮を呼び起こしています。しかし、幹細胞が目的の系統に分化するための効率は低いままです。この研究の目的は、組織工学的アプローチを適用して、in vitro分化中の一般的な中間体である胚様体 (EB) の均質な集団を生成することにより、iPS 細胞 (iPS-RPE) から網膜色素上皮 (RPE) を誘導するプロトコルを説明することです。このプロトコルは、マイクロウェルプレート技術を使用して特定のサイズのEBの形成を適用します。また、免疫細胞化学や逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)によりRPEのタンパク質マーカーや遺伝子マーカーを同定する方法についても説明します。最後に、RPEマーカーの蛍光活性化セルソーティング(FACS)分析によってモニターされるさまざまなサイズのEBにおける分化の効率について説明します。これらの技術により、iPS細胞のRPEへの分化が促進され、将来の応用が可能になります。
概要
人工多能性幹（iPS）細胞は、外因性因子1成体細胞を再プログラミングすることによって誘導される多能性幹細胞の一種である。対照的に、胚性幹細胞（ESC）、多能性幹細胞の別の型は、胚盤2-3の内部細胞塊から生成される。それらの異なる起源にもかかわらず、iPS細胞およびESCをインビトロおよび任意の細胞型4-5に分化する能力において複製するそれらの無制限の容量が同程度である。 iPS細胞のこれらの特徴は、彼らにパーソナライズされた再生医療への応用のための理想的な候補を作る。最近の研究努力は、網膜色素上皮（RPE）6-11を含む特殊な成体細胞を製造するための堅牢な分化プロトコールを開発することに焦点を当てている。
のiPS由来細胞の潜在的な臨床用途のために、その特定の細胞型に向かう分化が不可欠である。様々な方法があるその効率6-7、12-16で大きく変化したRPEに両方のESCとのiPS細胞の監督分化のために公開。我々はまだ開発または分化中の細胞/組織の運命を支配する分子事象の多くは知らない。近年では、努力は、できる限り胎生発育を模倣することができる分化プロトコルを開発する試みがなされてきた。胚盤胞段階の間に、幹細胞のコミットされていない集団の三次元微小環境で一緒にいる。そのように、様々な戦略を組み立てESC / iPS細胞を作成し、三次元でそれらを成長させ....
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プロトコル
培養試薬および培養プレートの調製
- 幹細胞基礎培地400 mlに5倍の無血清補充を100mlを添加することにより無フィーダー幹細胞培養培地を準備する。培地は、最大2週間と6ヶ月間、-20℃で、4℃で安定である。
- 市販の胚様体（EB）形成培地にRho関連、コイルドコイル含有タンパク質キナーゼ（ROCK）阻害剤（Y-27362）の10μMの溶液を加える。
- （ダルベッコ改変イーグル培地/栄養混合物F-12に0.1 mMのβメルカプトエタノール、0.1mMの非必須アミノ酸、2mM L-グルタミン、10％ノックアウト血清代替物（KSR）および10μg/ mlのゲンタマイシンを添加することによりDMEMを分化培地を調製/ F12）。
- 1×N1サプリメント、0.1mMの非必須アミノ酸、250 / mlのタウリン、13 / mlのトリヨードLチロニンナトリウム塩、を20ng / mlのヒドロコルチゾン、5μg/ mlのゲンタマイシン、および15％添加したiPS-RPEの培地を調製ウシ胎児血清（FBS）最小必須培地イーグル（MEM）に21。 7.4にpHを調整する。
- トリヨード-L-チロニンナトリウム塩ストック溶液を準備します。穏やかに回転させることによって1 N水酸化ナトリウムでトリヨード-L-チロニンナトリウム塩1mgを溶解させる。トリヨード-L-チロニンナトリウム塩20μgの/ mlの50ミリリットルを作るために、MEMの49ミリリッ....
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結果
この実験では、iPS細胞を培養したEBからRPE細胞系統に分化した。制御されたサイズのEBをマイクロウェルプレートを用いて形成された。 図1 EBの形成に見られるように、マイクロウェルプレート中で均質であった。これらのEBは、次いで（ 図2）を回収し、6ウェルプレート上にプレーティングした。
RPEは、古典的な六角形の形態、色素沈着、およびRPEマーカーの発現によって同定することができる。培養12週間後、200細胞EBは、アストロサイトおよび線維芽細胞の形態を開発していた。無色素沈着は、これらの細胞（ 図3A）に観察されなかった。大きなEBを古典RPE形態および色素沈着の単層を開発した（ 図3B及びC）免疫細胞化学は、RPEのマーカーを検出するために、MITFとZO1 500細胞および3000細胞EBから誘導されたこれらのタンパク質の同時発現を明らかにした（ 図4） 。
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ディスカッション
細胞療法のための多能性幹細胞の完全な約束を実現するためには、一貫して再現可能な方法でそれらの分化を調節することが必要である。このレポートでは、マイクロウェルプレート技術を使用してサイズ制御したEBを形成RPEに向かって分化を開始し、RPEのタンパク質と遺伝子マーカーを同定するためのプロトコルについて説明します。 インビトロ分化を同期させるために、EBの均一な大きさは、強制凝集によってマイクロウェルプレート中で遠心iPS細胞の既知の番号を形成した。免疫細胞化学および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）を説明した表現のRPEタンパク質および遺伝子をモニターするために使用される。最後に、EBの異なるサイズの分化の効率は、FACS分析により分析した。これらの技術は、将来のアプリケーションのためにRPEにiPS細胞の分化を促進することができる。
慎重にEに実行する必要があり、この方法でいくつかの重要なポイントがあります。正確なデータのこのプロトコル及び達成の成功をnsure。最初の重要なステップは、iPS細胞培養の間に発生します。 iPS細胞は、幹細胞性を維持するため.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
ここに含まれる意見や主張は著者の個人的な見解であり、公式のものとして解釈されるべきではなく、陸軍省や国防総省の見解を反映したものとして解釈されるべきではありません。この研究は、著者のAlberto Muñiz氏、Ramesh R Kaini氏、Whitney A Greene氏、Jae-Hyek Choi氏がUSAISRでNational Research Councilの博士研究員を務めている間に行われました。この研究は、米国陸軍臨床リハビリテーション医学研究プログラム(CRMRP)および軍事運用医学研究プログラム(MOMRP)の支援を受けました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| mTeSR1培地 + 5倍サプリメント | 幹細胞技術 | 5850 | |
| Y-27632 (岩石阻害剤) | 幹細胞技術 | 72304 | |
| DMEM/F12 | ライフテクノロジー | ズ 11330-032 | |
| 2-メルカプトエタノール | Sigma | M-7154 | |
| 非必須アミノ酸 | ハイクロン(フィッシャー) | SH30853.01 | |
| ノックアウト血清補充 | ライフテクノロジー | 10828-028 | |
| ゲンタマイシン | ライフテクノロジー | ズ 15750-060 | |
| L-グルタミン | ライフテクノロジー | ズ 25030-081 | |
| MEMメディア | ライフテクノロジー | ズ 10370-021 | |
| N1サプリメント | シグマ | N-6530-5ML | |
| タウリン | シグマ | T-8691-25G | |
| ヒドロコルチゾン | シグマ | H0888-1G | |
| ウシ胎児血清 | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
| Triiodo-L-thyronine ナトリウム 塩 | Sigma | T6397 | |
| 水酸化ナトリウム | Σ S5881 | ||
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
| Aggrewell 400 プレート | 幹細胞技術 | 27940 | |
| AggreWell 培地 | 幹細胞技術 | 5893 | |
| Accutase | 幹細胞技術 | 7920 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | |
| Mouse Anti-PAX6 antibody | Developmental Studiesハイブリドーマバンク | ||
| ウサギ抗RX抗体 | カム | Ab23340 | |
| マウス 抗MITF抗体 | Thermo Scientific | MS-772-P | |
| ウサギ 抗ZO-1抗体 | Invitrogen | 40-2200 | |
| RNeasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | |
| PCRマスターミックス | Promega | M7502 | |
| 大容量RNAからcDNAへのキット | Life Technologies | 4387406 |
参考文献
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).
- Reubinoff, B. E., et al. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol
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再版と許可
