胚様体の異なるサイズによって人工多能性幹（iPS）細胞から網膜色素上皮（RPE）の導出

サマリー

このレポートの目的は、胚様体の異なるサイズを使用して人工多能性幹（iPS）細胞から網膜色素上皮（RPE）を導出するためのプロトコルを記述することである。

要約

多能性幹細胞は、無限に増殖し、ほぼすべての細胞タイプに分化する能力を持っています。また、体細胞を人工多能性幹細胞(iPS細胞)にリプログラミングする技術の開発は、カスタマイズされたパーソナル再生医療の可能性に対する関心と興奮を呼び起こしています。しかし、幹細胞が目的の系統に分化するための効率は低いままです。この研究の目的は、組織工学的アプローチを適用して、in vitro分化中の一般的な中間体である胚様体 (EB) の均質な集団を生成することにより、iPS 細胞 (iPS-RPE) から網膜色素上皮 (RPE) を誘導するプロトコルを説明することです。このプロトコルは、マイクロウェルプレート技術を使用して特定のサイズのEBの形成を適用します。また、免疫細胞化学や逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)によりRPEのタンパク質マーカーや遺伝子マーカーを同定する方法についても説明します。最後に、RPEマーカーの蛍光活性化セルソーティング(FACS)分析によってモニターされるさまざまなサイズのEBにおける分化の効率について説明します。これらの技術により、iPS細胞のRPEへの分化が促進され、将来の応用が可能になります。

概要

人工多能性幹（iPS）細胞は、外因性因子¹成体細胞を再プログラミングすることによって誘導される多能性幹細胞の一種である。対照的に、胚性幹細胞（ESC）、多能性幹細胞の別の型は、胚盤^2-3の内部細胞塊から生成される。それらの異なる起源にもかかわらず、iPS細胞およびESCをインビトロおよび任意の細胞型^4-5に分化する能力において複製するそれらの無制限の容量が同程度である。 iPS細胞のこれらの特徴は、彼らにパーソナライズされた再生医療への応用のための理想的な候補を作る。最近の研究努力は、網膜色素上皮^{（RPE）6-11}を含む特殊な成体細胞を製造するための堅牢な分化プロトコールを開発することに焦点を当てている。

のiPS由来細胞の潜在的な臨床用途のために、その特定の細胞型に向かう分化が不可欠である。様々な方法があるその効率^6-7、12-16で大きく変化したRPEに両方のESCとのiPS細胞の監督分化のために公開。我々はまだ開発または分化中の細胞/組織の運命を支配する分子事象の多くは知らない。近年では、努力は、できる限り胎生発育を模倣することができる分化プロトコルを開発する試みがなされてきた。胚盤胞段階の間に、幹細胞のコミットされていない集団の三次元微小環境で一緒にいる。そのように、様々な戦略を組み立てESC / iPS細胞を作成し、三次元でそれらを成長させるために適用した。これらの幹細胞集合体は、胚様体（EB）と呼ばれている。研究は、幹細胞のEBの分化は胚発生の初期段階を模倣し、自発的にその外面に原始内胚葉を生じ得ることを示した。 EBの開発が進むにつれてその後、3つのすべての生殖系列の分化細胞の表現型は^17-18が表示されます。目erefore、EBをベース分化プロトコルは、ESC / iPS細胞のin vitroでの分化のために多くの注目を集め多能性幹細胞¹³からRPE生成のための良い候補であるしている。

EBは、ESC / iPS細胞からのいくつかの方法を用いて製造することができる。最初に、EBを付着コロニーを掻き非接着懸濁培養でそれらを維持することによって作製した。しかし、このアプローチは、低い再現性を引き起こすEBの不均一な集団を生じる。ハンギングドロップ細胞培養およびマイクロウェルベースの​​EB形成が非常に再現性が定義された大きさの均一なEBをを得たEB形成のための他の一般的な技術である。さらに、マイクロ技術は少ない労力で凝集体の大多数を得ることができる。

のEB内の細胞の分化は、細胞外および細胞内微小環境から形態形成の合図の多重によって調節される。月における分化とは対照的にフォーマットolayer、EBは^、17を発生する細胞と細胞間シグナル伝達の複雑なアセンブリのためのプラットフォームを提供する。興味深いことに、個々のEBを作製するために使用される多能性幹細胞の数は、細胞の運命に影響を与えることが観察された。 1000セルEBは赤血球系統²⁰に向けてプッシュされ、一方、例えば、ヒトESCの造血分化の研究では、500セルEBは骨髄系統への分化を促進したことが観察された。別の研究では、より小さなEBは、神経外胚葉分化^11、17に向けて推進し、より大きなEBを、一方、内胚葉分化を支持した。

これらの過去の研究は強く個々のEBを作製するために使用されるESC / iPS細胞の数は、任意の細胞型への分化に基づいたEBに影響を与えることを示唆している。しかし、我々の知る限り、RPEに分化するために、その傾向にEBをサイズの影響を解明した電流の研究はありません。本研究の目的は、影響を特徴付けることである網膜色素上皮（のiPS-RPE）分化およびRPE系統に向かって方向付け分化したEBを作るための最適な細胞数を識別するために - 人工多能性幹（iPS）細胞へのEBの大きさ。

プロトコル

培養試薬および培養プレートの調製

1. 幹細胞基礎培地400 mlに5倍の無血清補充を100mlを添加することにより無フィーダー幹細胞培養培地を準備する。培地は、最大2週間と6ヶ月間、-20℃で、4℃で安定である。
2. 市販の胚様体（EB）形成培地にRho関連、コイルドコイル含有タンパク質キナーゼ（ROCK）阻害剤（Y-27362）の10μMの溶液を加える。
3. （ダルベッコ改変イーグル培地/栄養混合物F-12に0.1 mMのβメルカプトエタノール、0.1mMの非必​​須アミノ酸、2mM L-グルタミン、10％ノックアウト血清代替物（KSR）および10μg/ mlのゲンタマイシンを添加することによりDMEMを分化培地を調製/ F12）。
4. 1×N1サプリメント、0.1mMの非必​​須アミノ酸、250 / mlのタウリン、13 / mlのトリヨードLチロニンナトリウム塩、を20ng / mlのヒドロコルチゾン、5μg/ mlのゲンタマイシン、および15％添加したiPS-RPEの培地を調製ウシ胎児血清（FBS）^{最小必須培地イーグル（MEM）に21。 7.4にpHを調整する。}
5. トリヨード-L-チロニンナトリウム塩ストック溶液を準備します。穏やかに回転させることによって1 N水酸化ナトリウムでトリヨード-L-チロニンナトリウム塩1mgを溶解させる。トリヨード-L-チロニンナトリウム塩20μgの/ mlの50ミリリットルを作るために、MEMの49ミリリットルを追加します。アリコートを準備し、必要になるまで-20℃で凍結する。最終培養培地中の所望の濃度を達成するために適切な容量を使用する。
6. ヒドロコルチゾンストック溶液を準備します。穏やかに撹拌し、100％エタノール1ml中ヒドロコルチゾン1mgを可溶化する。 50μg/ mlのヒドロコルチゾンストック溶液20ミリリットルを作るために、MEMの19ミリリットルを追加します。必要になるまで-20℃で小分けして凍結。最終培養培地中の所望の濃度を達成するために適切な容量を使用する。
7. DMEM / F12中1mg / mLのディスパーゼのワーキング溶液を準備します。
8. マトリックスコーティングされたプレートの調製
   1. MOUエンゲルブレス·ホルム - スウォーム（EHS）から抽出したタンパク質基質を準備0.08 mg / mlでのDMEM / F12中でそれ自体肉腫細胞。コー​​トマトリックス溶液1mlを6ウェルプレートの各ウェル。室温で1時間コーティングしたプレートをインキュベートします。
   2. 1時間のインキュベーション後、過剰のDMEM / F12を吸引する。ウェルの乾燥を防ぐために無フィーダー幹細胞培養培地0.5mlを加える。マトリックスでコーティングしたプレートを使用する準備ができている。
9. DMEM / F12の2ミリリットルで、各ウェルをすすぐことによって、マイクロウェルプレートを準備します。 DMEM / F12を除去し、各ウェルにROCK阻害剤を補充したEB形成培地の0.5ミリリットルを追加します。 5分間の気泡を除去するために2,000×gでプレートを遠心する。
10. リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中でアジ化ナトリウムを2％FBSを混合することによって、FACS染色緩衝液を調製し、0.09％。 pH7.4にバッファを調整します。
11. DMEM / F12に10％FBSを添加することによりトリプシン中和溶液を調製する。

2.のiPS文化

1. iPS細胞播種、3​​7°C​​まで暖かい無フィーダー幹細胞培地に先立ち、及びミリアンペアを持つ準備がコーティングされたプレートをTRIX。
2. すぐに37℃の水浴中でIMR90-1 iPS細胞を解凍する。水浴からクリオバイアルを除去し、70％エタノールでバイアルを拭く。細胞塊の破壊を最小限にするために2ミリリットルピペットを用いて15ミリリットルコニカルチューブに細胞を移す。
3. 滴下細胞に暖かい無フィーダー幹細胞培養培地5mlを加え、穏やかに混合する。 RTで5分間300×gで細胞を遠心し、上清を除去します。
4. 慎重に無フィーダー幹細胞培地2mlの細胞塊を再懸濁し、基質でコーティングされたプレートのウェル中の細胞塊をシード。 5％CO _2、湿度95％で37℃のインキュベーターにプレートを置きます。
5. 毎日のiPS細胞培養培地を変更します。五から七日播種後の未分化コロニーを観察します。光学顕微鏡下で通過させるための準備ができている未分化コロニー（密集中心としたコロニー）を確認してください。

iPS細胞の3継代

1. 通路の開始前に、iPS細胞、ディスパーゼ溶液を、DMEM / F12、水浴中で37℃に無フィーダー幹細胞培養培地を温める。
2. iPS細胞を継代する前に、領域をこすると培地を吸引することによって分化のいずれかの領域を除去する。慎重に2ミリリットルのDMEM / F12でiPS細胞をすすいでください。
3. / mlのディスパーゼ各ウェルに1 MGの1ミリリットルを加え、7分間37℃でインキュベートする。吸引しディスパーゼ、ゆっくりとDMEM / F12の2ミリリットルで2回細胞コロニーをすすぐ。すすいだ後、各ウェルに無フィーダー幹細胞培養培地2mlを加える。
4. を5mlのピペットを使用して、穏やかに細胞塊を形成するために、プレートのコロニーをこすり。 15ミリリットルコニカルチューブに取り外した細胞塊を転送します。細胞の次の継代をシードするのに十分な無フィーダー幹細胞培養培地を加える。

マイクロウェルプレートを使用したEBの4世代

1. iPS細胞の単一細胞懸濁液の調製
   1. mediuを削除iPS細胞からmおよびDMEM / F12の2mlでiPS細胞をすすぐ。 6ウェルプレートの各ウェルでのiPS細胞にACCUTASE750μlのを追加します。細胞がプレート（約5〜10分）から分離することを可能にするために37℃、5％CO ₂で細胞をインキュベートする。
   2. 優しく残りの細胞を解離するために、プレート表面に残った細胞を剥離するためにピペットを使用してください。 50ミリリットルコニカルチューブに細胞を移す。 DMEM / F12の5ミリリットルでプレートをすすぎ、コニカルチューブ内の細胞ですすぎDMEM / F12を兼ね備えています。すべての可能な残余の細胞塊を除去するために40μmのセルストレーナーを通して細胞懸濁液を渡します。
   3. ACCUTASEを削除するには、室温で5分間300×gで細胞を遠心します。細胞濃度が約0.5〜1.0×10 ⁷細胞/ mlになるようにEB形成培地中で細胞ペレットを再懸濁する。
   4. トリパンブルーと血球計数器を用いて細胞を計数することにより生存細胞の数を決定します。
2. Adjustin整粒したEBを形成するためのマイクロウェル内gの細胞密度
   1. 所望のEBのサイズを生成するためにマイクロウェルプレートの各ウェルに細胞数を調整する。均等に優しく細胞を数回ピペッティングして細胞を配布、ステップ1.9で作成プレートのマイクロウェルに細胞を追加します。
      注：ウェル当たりマイクロウェルのEBのx個当たりのセルのウェルあたり必要な細胞の数=所望の数。
   2. 2.0ミリリットルの最終容量にウェル中のROCK阻害剤を補充したEB形成培地を調整します。静かに各ウェルにピペッティングして細胞を再配布。遠心分離機3分間100×gでマイクロウェルプレートは24時間、5％CO _2、95％湿度で37℃のインキュベーターでプレートを置きます。
3. マイクロウェルプレートから収穫したEB
   1. よくEBの大部分を除去するための1ミリリットルピペットで上下に培地をピペットによってマイクロウェルから収穫したEB。反転した40μmのセルを介してのEBサスペンションを渡す単一細胞を除去するために50mlコニカルチューブの上にストレーナー。
   2. すべてのEBを削除するにはDMEM / F12 1mlのマイクロウェルプレートを5回洗浄する。回の洗浄を収集し、反転したセルストレーナーを通過。新しい50ミリリットルコニカルチューブにアップセルストレーナー右サイドに回します。 EB形成培地で洗浄することによりEBを収集します。収量を決定するために、EBをカウント。

5.めっきしたEBと開始分化

1. タンパク質マトリックス上にプレートEBは、EB形成培地+10μMのROCK阻害剤で千のEB /ウェル<の密度で（ステップ1.8.1のように）6ウェルプレートをコーティングした。 24時間、5％CO _2、95％湿度、37℃でのEBをインキュベートする。
2. 24時間のEBめっき後、分化を開始するために分化培地と交換してください。細胞は、さらなる分析のために収集されるまで、一日おきに分化培地の半分を変更します。
3. RT-PCR、immにを実施する日にサンプル6、17、29及び60を収集特徴的なRPE遺伝子およびタンパク質の発現を検証するunocytochemistryおよびFACS。

6. RNA抽出およびPCR

1. 市販のキットで提供される指示に従って、EBサンプルからRNAを抽出します。分光光度計を使用してRNA濃度を決定します。
2. cDNAを逆転写キットに市販のRNAによると、全RNA 100ngのに逆転写を行います。
3. cDNAの10マイクロモル/ 10 NGの濃度でのcDNAの10 ngの以下のプライマーを用いた（ 表1）を用いてPCRを行います。次のようにPCRを設定：72℃での最終サイクルに続いて、1分間、30秒間、72℃で、5分間、95℃でDNAを変性15秒間95℃、35サイクルで増幅し、60°C 10分間、C。 1％アガロースゲルでPCR産物を実行します。

7.免疫細胞化学

1. RTでPBSで2回のEBを洗ってください。 4％paraformaldにRTでのEBを修正10分間ehyde。 RTでPBSで一度すすぐ。 PBSで保管してサンプルを4℃で染色に使用するまで。
2. 染色日には、固定および透過試薬で固定した細胞を扱う。 RTで1時間（透過処理溶液中の10％ヤギ血清）をブロッキング溶液でサンプルをインキュベートする。
3. 抗Pax6の（1:10）、抗RX（1：200）で示される希釈度以下の一次抗体を使用して透過処理溶液中の10％ヤギ血清で免疫化学を実行し、抗MITF（1:30）、および抗ZO1（1：100）。 4℃で対応する抗体O / Nを有するサンプルをインキュベートする。
4. 翌日、細胞からの一次抗体を除去し、PBSでサンプルを3回すすいでください。 RTで1時間フォア結合二次抗体とサンプルをインキュベートする。
5. 細胞から二次抗体を除去し、PBS中のサンプルを3回すすいでください。カバーが封入剤を含むDAPIをガラススライド上にスリップマウントサンプルは暗室でO / Nを設定することを可能にする。染色を可視化する蛍光顕微鏡を使用してください。

FACS分析のために8染色

1. PBS中で培養したEBを2回洗浄します。単一細胞懸濁液を作製するために5〜10分間0.25％トリプシンを0.5mlとしたEBをインキュベートする。トリプシン中和溶液（1ml /ウェル）でトリプシンを中和する。
2. 10分間、600×gでの15mlコニカルチューブと遠心分離機に単一細胞懸濁液を移す。
3. 上清を捨て、チューブ中の細胞にDMEM / F12の10ミリリットルを追加します。穏やかに細胞を混合することが反転。 600×gで遠心分離する。遠心分離後、上清を廃棄し、FACS染色緩衝液中で細胞を再懸濁する。
4. 細胞の総数を数えます。 10分間600×gで遠心分離する。遠心分離廃棄上清の後。すぐに4％パラホルムアルデヒドの0.5ミリリットルを添加して細胞を固定します。穏やかにボルテックスでよく混ぜる。 20分間、4℃で細胞をインキュベート。
5. 10分間600×gで遠心分離し、削除する上清。渦穏やかに細胞ペレットを破壊する。冷却された透過化溶液1mlを添加して細胞を透過性。ボルテックスは穏やかに混合し、30分間氷上でインキュベートする。
6. 10分間600×gで遠心分離し、上清を除去します。 FACS染色バッファーに再懸濁の3ミリリットルを追加します。 1より多くの時間のために、この手順を繰り返します。 5×10 ⁶細胞/ mlの最終濃度でFACS染色緩衝液中で細胞を再懸濁。
7. 各マイクロチューブに100μlの細胞懸濁液（0.5×10 ⁶細胞）を転送し、一次抗体の推奨されるボリュームを追加。 Pax6のために、細胞懸濁液を100μlのPE抗Pax6のの5μlを添加する。 MITFのために、細胞懸濁液を100μlの抗MITFの5μlを添加する。
8. 混合し、60分間RTでインキュベートする。 FACS染色バッファーの3ミリリットルを追加します。 10分間600×gで混合し、遠心。上清を除去し、さらに2回のために8.16を繰り返します。
9. MITF染色のために、二次antiboで細胞をインキュベートdyは、1の希釈でヤギ抗マウスアレクサフルオロ488：4°Cで1時間、2000。 Pax6の染色のために、このステップを回避する。
10. 10分間600×gでのFACS染色バッファーと遠心機の5ミリリットルで細胞を洗浄。 2回以上のプロセスを繰り返します。
11. 細胞ペレットを破壊する優しくFACS染色バッファーと渦の500μlの細胞を再懸濁。サンプルは、フローサイトメトリー分析のために準備ができている。

9. IPS-RPEの単離および培養

1. 29日目に、慎重に200μlのピペットチップを用いて培養プレートから選択着色されたコロニーの周囲に切断した。 15ミリリットルコニカルチューブに浮動コロニーを転送します。 RTで10分間600×gでコロニーを遠心し、上清を除去します。
2. 10分間600×gでDMEM / F12と遠心機の10ミリリットルで細胞コロニーを懸濁します。上清を取り除きます。
3. 7-10分間37℃で0.25％トリプシン2mlを有するコロニーをインキュベートすることによって、単一細胞懸濁液を調製。穏やかにコロニーを解離細胞懸濁液をボルテックス。
4. のiPS-RPE培地2mlを添加することによりトリプシンを中和する。 10分間600×gで遠心分離し、上清を捨てる。のiPS-RPE培地2ml中で単一細胞を再懸濁する。 37℃、5％CO ₂および湿度95％のインキュベーター内タンパク質マトリックスコートした6ウェルプレートを所定の位置に細胞を移す。

結果

この実験では、iPS細胞を培養したEBからRPE細胞系統に分化した。制御されたサイズのEBをマイクロウェルプレートを用いて形成された。 図1 EBの形成に見られるように、マイクロウェルプレート中で均質であった。これらのEBは、次いで（ 図2）を回収し、6ウェルプレート上にプレーティングした。

RPEは、古典的な六角形の形態、色素沈着、およびRPEマーカーの発現によって同定することができる。培養12週間後、200細胞EBは、アストロサイトおよび線維芽細胞の形態を開発していた。無色素沈着は、これらの細胞（ 図3A）に観察されなかった。大きなEBを古典RPE形態および色素沈着の単層を開発した（ 図3B及びC）免疫細胞化学は、RPEのマーカーを検出するために、MITFとZO1 500細胞および3000細胞EBから誘導されたこれらのタンパク質の同時発現を明らかにした（ 図4） 。

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ディスカッション

細胞療法のための多能性幹細胞の完全な約束を実現するためには、一貫して再現可能な方法でそれらの分化を調節することが必要である。このレポートでは、マイクロウェルプレート技術を使用してサイズ制御したEBを形成RPEに向かって分化を開始し、RPEのタンパク質と遺伝子マーカーを同定するためのプロトコルについて説明します。 インビトロ分化を同期させるために、EBの均一な大きさは、強制凝集によってマイクロウェルプレート中で遠心iPS細胞の既知の番号を形成した。免疫細胞化学および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）を説明した表現のRPEタンパク質および遺伝子をモニターするために使用される。最後に、EBの異なるサイズの分化の効率は、FACS分析により分析した。これらの技術は、将来のアプリケーションのためにRPEにiPS細胞の分化を促進することができる。

慎重にEに実行する必要があり、この方法でいくつかの重要なポイントがあります。正確なデータのこのプロトコル及び達成の成功をnsure。最初の重要なステップは、iPS細胞培養の間に発生します。 iPS細胞は、幹細胞性を維持するため...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
mTeSR1培地 + 5倍サプリメント	幹細胞技術	5850
Y-27632 (岩石阻害剤)	幹細胞技術	72304
DMEM/F12	ライフテクノロジー	ズ 11330-032
2-メルカプトエタノール	Sigma	M-7154
非必須アミノ酸	ハイクロン(フィッシャー)	SH30853.01
ノックアウト血清補充	ライフテクノロジー	10828-028
ゲンタマイシン	ライフテクノロジー	ズ 15750-060
L-グルタミン	ライフテクノロジー	ズ 25030-081
MEMメディア	ライフテクノロジー	ズ 10370-021
N1サプリメント	シグマ	N-6530-5ML
タウリン	シグマ	T-8691-25G
ヒドロコルチゾン	シグマ	H0888-1G
ウシ胎児血清	Hyclone(Fisher)	SH3008803HI
Triiodo-L-thyronine ナトリウム  塩	Sigma	T6397
水酸化ナトリウム		Σ S5881
Dispase	Life Technologies	17105-041
Matrigel	BD Biosciences	354277
Phosphate buffered saline	Hyclone(Fisher)	10010-023
Aggrewell 400 プレート	幹細胞技術	27940
AggreWell 培地	幹細胞技術	5893
Accutase	幹細胞技術	7920
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit	BD Biosciences	554714
Mouse Anti-PAX6 antibody	Developmental Studiesハイブリドーマバンク
ウサギ抗RX抗体	カム	Ab23340
マウス 抗MITF抗体	Thermo Scientific	MS-772-P
ウサギ 抗ZO-1抗体	Invitrogen	40-2200
RNeasy plus mini kit	Qiagen	74134
PCRマスターミックス	Promega	M7502
大容量RNAからcDNAへのキット	Life Technologies	4387406

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