蛍光DNAための簡単​​な方法その場でぺしゃんこ染色体へのハイブリダイゼーション

サマリー

ここでは、スライドマウント染色体上の反復ヘテロクロマティック配列を可視化するために、蛍光DNAのin situハイブリダイゼーション(DNA ISH)を行う簡単な方法を紹介します。この分析法は最小限の試薬で済み、短いプローブまたは長いプローブ、さまざまな組織、蛍光または非蛍光ベースのシグナルでの検出に汎用性があります。

要約

in situハイブリダイゼーション （DNA ISH） における DNAは、特定の染色体領域にシーケンスをマッピングするために一般的に使用される方法である。このアプローチは、計算上のアプローチが法外な課題に直面してヘテロクロマチン領域にマッピング高度反復配列に特に有効である。ここでは、他のDNA ISHプロトコルにおける標準手順ですホルムアミドの洗浄を回避するDNA ISHのための合理化されたプロトコルを記述します。我々のプロトコルは、効果的に異なる昆虫の組織タイプの数にわたって異質染色体領域内の反復DNA配列をマークする蛍光色素を担持する短い一本鎖DNAプローブとのハイブリダイゼーションのために最適化されている。しかし、アプリケーションは、単一コピーの大きいプローブおよび可視化（非反復）のDNA配列で使用するように拡張することができる。私たちは、 キイロショウジョウバエの神経細胞とキョウから押しつぶされた染色体に複数の異なる反復配列をマッピングすることにより、この方法を実証するvitripennis精母。我々は両方の小、商業的に合成されたプローブの比較のために、より大きなプローブのハイブリダイゼーションパターンを示している。この手順は、単純な実験室用品および試薬を使用し、DNA ISHを実施するとの経験がほとんどない研究者に最適です。

概要

in situハイブリダイゼーション （DNA ISH） における DNAは、特定の染色体領域にシーケンスをマッピングするために一般的に使用される方法である。長いDNA生成物^1,2及びdeoxygeninの取り込みのニックトランスレーションまたは末端標識（DIG）を含む、ユークロマチン内の単一コピー領域へのプローブのアプローチの一握りを介して生成することができますが、多種多様を通じてヌクレオチドおよびそれらの認識を-attachedグループ標識抗体^1-3。少数または単一のコピー数の真正染色質系列の可視化は、高い特異的活性または集合シグナルを増強複数の、より小さなプローブのカクテルを持つ単一の、大規模なプローブのいずれかを使用する必要があります。

彼らは通常、数万のブロックとして知られている単一の染色体領域に密集反復の千として存在しているのでこれとは対照的に、そのようなサテライトDNAとしてヘテロクロマチンに見られる高度反復配列は、DNA ISHのために簡単にターゲットである。転移因子はまた、であることができる明確な染色体遺伝子座²で高コピー数で発見。これらのケースでは、低い比活性を持つ単一のプローブは、効果的に複数のサイトで彼らのハイブリダイゼーションのためにヘテロクロマチン系列ラベルを付けることができます。反復配列に対するプローブは、市販の短いオリゴヌクレオチド（30-50 bp）を合成し、化学的に異なる複数の蛍光性基のいずれかと結合体化され得る。ゲノム配列決定技術を用いて、ヘテロクロマチン内の反復配列をマッピングすることにより、高度に反復的な衛星のブロック^4-6,7内の建物の足場で遭遇する課題には困難である。現在、ISHは、サブ染色体レベルでのこれらの配列をマッピングする最も効果的な方法として表す。この戦略は、進行中のゲノム及びトランスクリプトーム配列決定研究によって明らかにされている反復配列の多数をマッピングするために重要である。

スライドマウント染色体上の反復配列のマッピングの効率および容易さがGREであろうatly DNA ISHのために単純化されたプロトコルによって強化。例えば、DNA ISHのための既存のプロトコルは、このようにマッピングシーケンスの所要時間と実質的に添加しても高価な試薬のための化学廃棄物を大量に産生する、ホルムアミド溶液中でハイブリダイズ^2,8組織の複数回の洗浄を含む。ここでは、ホルムアミドの洗浄の必要性を回避し、基本的な実験装置および試薬を利用して修正されたDNA ISH方法について説明します。この方法は、本来の蛍光色素とコンジュゲートしている、商業的に合成されたオリゴを用いて、 ショウジョウバエ幼虫の神経芽細胞の異質領域において高度に反復DNA配列の迅速なマッピングのために設計された。しかし、この方法はまた、他の手段^9,10を介して、複数の異なる組織及び染色体タイプにわたって合成された大きいプローブを使用して反復配列をマッピングするために働く。さらに、この方法は、より長いまたはmultip使用してユークロマチンシーケンスをマッピングするために使用することができるル、関心の真正染色質配列内に短いプローブ。

プロトコル

1.組織解剖および固定（60分）

1. ショウジョウバエの脳の場合は、1×PBS（リン酸緩衝生理食塩水）のドロップ^第3齢幼虫を置く。積極的に過密でないバイアルまたはボトルからクロールされている大規模な^第3齢幼虫を選択してください。
   1. 本体の長さ（ 図1A、B）の下2/3をつかむために、口のフックと、別のピンセットのペアのホールドをつかむために1超微細ピンセットのペアを使用してください。脳、腹側神経節、唾液腺と幼虫の消化管の一部が露出するように口のフックに慎重に引き抜いてください。プラスチックペトリプレート上1X PBT（Tweenでリン酸緩衝生理食塩水）の液滴中の他の組織および場所から脳と腹側神経節（ 図1A、B）を分離するためにピンセットを使用してください。
2. キョウ精巣解剖のために、男性の3日齢の蛹（赤い目と黄色の体）を選択します。雄キョウが ​​fに対する小翼パッドの長さを有する蛹（ 図1C）中にemales。
   1. 1ピンセットペアと胸部領域の近くに腹部の上部に蛹を持ち、他のピンセットのペアを使用して、腹部の非常に遠位先端をつかむと、涙形の精巣を引き出し（彼らは脂肪に囲まれて静かに振とうすることができます体; 図1D）。プラスチックペトリプレート上1X PBTの液滴に適切な押しつぶし、と場所を防ぐことができます精巣、からの外装ボディパーツを取り外してください。
3. 各スライドについて、4つ、又は5つの組織サンプル（ すなわち 、 ショウジョウバエ幼虫の脳またはキョウ精巣 ）の合計を分析。
   注：複数の5つのサンプルは、超満員の核および染色体につながる。
4. 必要に応じて、低張液で組織を治療、有糸分裂染色体の真正染色質領域での姉妹染色分体のいくつかの分離を達成するために：5-10 0.5％クエン酸ナトリウムの低下に1X PBTからの脳を転送する（せいぜい10）分ない
   NOTE：コルヒチン（有糸分裂阻害剤）中期¹¹で有糸分裂像の数を増加させるために有用であることができる。それが否定的な染色体の解像度に影響を与えることができるので、非常に大きな健康な幼虫が広がり、形態、使用、さらに望ましくている場合は、その使用は不要である。
5. クリーンシグマコート処理したカバースリップの表面上に固定液の液滴（〜20μL）（45％酢酸中2.5％パラホルムアルデヒド）を配置します。
   注：各使用日の固定剤溶液は新鮮なことを確認します。 45パーセント酢酸中1.8-3.7％のパラホルムアルデヒドに至るまで固定液ソリューションは、魚のために最良の結果をもたらす。脳や精巣以外の組織を使用して、または免疫FISHのためにこのプロトコルを適応すると、別の固定剤を使って実験が必要な場合があり（異なる固定剤のリストについては^、12を参照^のこと）。
6. 注意深く極細ピンセット、小指と固定液滴に解剖バッファー（1×PBT）から各組織サンプルを転送する固定液にバッファを解剖の転送をシュッ。彼らは一様に固定液滴内の互いに離間されるように、組織サンプルを置きます。室温で4分間固定液中で組織をインキュベートする。
7. 組織とカバースリップ上にダウンポリリジンコートスライド顔を慎重に配置します。この時点で下に押し、その代わりにカバースリップ、スライドの下にスティックように、2つを軽く接触させないでください。カバースリップが上になるようにスライドを反転。
8. ろ紙の折返し片内側スライド/組織/カバースリップを挟む。安定した表面には、非常にしっかりとまっすぐ下に直接カバースリップ上の位置に親指、プレスを使用。 （これは組織の汚れが発生します）カバースリップの滑り横を避けるように注意してください。
9. 液体窒素中にスライド/組織/カバースリップ水没（ 図1E、Fで装置を参照）、および窒素が沸騰（長いをf停止するまで放置するINE）。スライドを削除し、すぐに（カミソリの刃で固定組織を傷つけない）上方向にカバースリップの角をフリックで新鮮なカミソリの刃でカバースリップをオフにスナップ。
   1. ドライアイスのブロックのスライド/組織/カバースリップを予冷、カバーが前に割れからスライドを防ぐことができます液体窒素中に沈めることに1〜2分間、最大スリップ。
10. すぐに室温で100％エタノールを充填したコプリンジャーに組織にスライドを配置し、（必要に応じて、この時間を長くすることができる）は、少なくとも5分間放置する。
    NOTE：冷100％エタノールを使用することもできる。
11. 、組織とスライドを取り外します（固定組織に触れることなく）キムワイプと過剰のエタノールを逃がすし、1時間空気乾燥スライドを残す。
    1. ステップ2またはハイブリダイゼーションを実行する前に、数ヶ月に低湿度空気中または数週間のための乾燥室で乾燥スライドを維持するために直接進む。

図1：脳を解剖するための幼虫ダウン方法の口のフックをつかむためにどこにするために示された位置との（A） ^第3齢ショウジョウバエ幼虫（右）、（*で示される）と2/3。 ^第3齢ショウジョウバエ幼虫（右）と、このの概略から解剖（左）同じ発達段階A幼虫の概略、幼虫の頭の中の脳の相対的な位置を示した。（B）は 、脳と腹側神経節蛹をつかむために示す位置に3日齢のキョウオス蛹（右）から解剖組織（左）。黄色のボディ·赤目の段階で（C）3日齢キ ​​ョウ蛹 。（D）精巣組腹部の後部に（*で示される）と体の途中。 （左）は概略を描いた男性と女性だったp個の蛹。雄の蛹は、プロファイルを越えて延びる翼を有する雌とは対照的に、矢状プロファイル（黒矢印）を越えて延びない翼によって区別す​​ることができる。精巣ペアの相対位置は、雄蛹に示されている。液体窒素の容器中にスライドを浸漬するために使用されるペーパークリップ、及び（F）方法の（E）の装置列。複数のクリップ列が複数のスライドの同時浸漬のために使用することができる。

in situハイブリダイゼーション 2（1日目の30分、長いプローブ·オン2日のために1時間〜2.5時間）

1. 1.1倍のハイブリダイゼーション緩衝液20μlに各プローブの1μL（100 NG）を追加します。固定組織の表面上にピペットプローブ/ハイブリダイゼーション緩衝液（組織には手を触れないでください）​​。
2. 慎重にカバースリップが組織の真上に中央に配置されていることを確認して、プローブ/ハイブリダイゼーション緩衝液に直接カバースリップを配置。バッファが目に移行する必要があります気泡を残さず、カバースリップの電子外縁。
   注：組織と接触しない小さな気泡がプロシージャに何の問題も引き起こさない。慎重にカバースリップの角を持ち上げ、慎重にスライドの上にバックドロップすることで、大きな気泡を除去します。
3. 95°C（カバースリップ上）に予備加熱ブロックの表面上にスライド/組織/カバースリップを置きます。露光を防止するためにアルミホイルの大きなピースでカバー。スライドを5分間95℃でインキュベートしましょう​​。
   注：チューブ用の穴を持つ典型的なヒートブロックがスライド/組織/カバースリップを配置する平坦な表面を提供するために裏返しすることができます。
4. それは触ると暖かくなるまで、それは少し冷却させる、スライドを削除します。慎重に、その下に液体を密封するために、カバースリップに張架パラフィルムの一部を包む。
5. 湿度チャンバ内の密封されたスライドを配置し、30℃に予熱インキュベーターにチャンバーを配置。 4時間一晩に30℃でインキュベートする。
   1. 下部に配置湿らせたキムワイプまたはペーパータオルで空の先端ボックスから湿度室または蓋付きタッパーウェアコンテナを作成します。
      注：一本鎖DNAオリゴプローブは45-47℃の理論上の融解温度（T _m）を達成するために、28〜33塩基であるように設計されている。これらの長さおよびT _mの範囲は、我々が研究してきた多くの反復配列がATリッチであるため、非常に低いGC含量を有するという事実を反映する。より長いプローブは、おそらく、より高いT _m値を有することになる。これは、30℃の標準的なハイブリダイゼーション温度で、より高いバックグラウンドハイブリダイゼーションを生じ得る。したがって、ハイブリダイゼーション温度を有するいくつかのトラブルが最良の結果を達成するために必要とされてもよい。段階的に、5℃で最高のハイブリダイゼーション温度、増加（または減少）温度を検索するには。
6. 慎重にスライドからパラフィルムを除去した後、丁寧にゆっくりと1コーナーを持ち上げてカバースリップを取り外します。ワ0.1×SSC緩衝液中でのshスライドを15分間3回洗浄。光の露出を最小限にするための洗浄中にアルミホイルでコプリンジャーをカバーしています。
7. 長いビオチン化プローブを使用していない場合は、2.8に進みます。
   1. 長いビオチン化プローブを使用している場合は、組織自体に触れないように注意しながら、キムワイプで組織周辺を乾燥させます。組織上のブロッキング溶液を100μlを置き、トラップ気泡を避けるように注意しながら、カバーガラスで優しくカバーしています。パラフィルムでカバースリップ上にスライドをラップし、30分間37℃で配置します。
   2. 慎重にカバースリップを削除し、キムワイプで組織を中心にブロット。ピペットローダミン - アビジン希釈した1100μlの：組織上のSBTで千とトラップの泡を避けるように注意しながら、カバーガラスで優しくカバーすること。パラフィルムでカバースリップ上にスライドをラップし、30分間37℃で配置します。
   3. 慎重その後カバースリップを削除して、4倍SSCTで5分間ずつスライドを3回洗浄し、0.1×SSC中で5分間3回ずつ。
      注：スライドをより長い期間にわたって洗浄することができる。
8. （組織に触れないように）スライドを削除し、余分な緩衝液を除去するために乾燥したキムワイプを用いて組織を中心にブロット。 10〜15分間、または水分が完全に消散するまで、暗所でスライド組織側を上に置きます。
9. のVectashieldマウンティング培地をピペットで11μlの（4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドールDAPI）組織へ。慎重に直接封入剤と組織の中心部のきれいなカバースリップ（シグマコートで処理されていない）を配置します。封入剤は、カバースリップの端に向かって外側へゆっくりと移行する必要があります。
   注：封入剤は、すべての側面にカバースリップの縁に到達するのに失敗した場合は、封入剤の追加の1-2μlの必要な体積を埋めるためにカバースリップの縁の一つの位置に適用することができる。この場合は、前のスライド表面から余分なメディアを離れて拭いてくださいシーリング。
10. マニキュアでカバースリップの端をシール。組織サンプルの上にマニキュアを塗ることは避けてください。
11. 暗い場所で直立スライドを置き、完全にハード（通常は30分以上）まで、ネイルポリッシュ乾燥させる。この時点で、画像後でイメージングのため最大1週間-20℃で組織またはストア。

バッファ/ソリューションのレシピ

10倍のPBS

• 80グラムのNaCl
• 2.0グラムのKCl
• 14.4グラムのNa ₂ HPO ₄
• 2.4グラムのKH ₂ PO ₄
• 7.4にpHを、H ₂ Oに1 L

1X PBT

• 5ミリリットル10倍のPBS
• 45ミリリットルのH ₂ O
• 0.1％のTween 20

20X SSC

• 175.3グラムのNaCl
• 88.2グラムクエン酸ナトリウム
• 800ミリリットルのH ₂ O中
• 7のpHを、H ₂ Oの1 L

4X SSCT

• 200ミリリットル20X SSC
• 799ミリリットルのH ₂ O
• 0.1％のTween 20

0.1×SSC

• 5ミリリットル20X SSC
• 995ミリリットルのH ₂ O

ハイブリダイゼーション混合物（20μL; ¹¹から変更）

• 10μlのホルムアミド
• 4μlの50％のデキストラン硫酸
• 2μlの20X SSC
• 4μlのH ₂ O

SBT ^8（10ml）中

• 2ミリリットル20X SSC
• 0.01グラムのウシ血清アルブミン（BSA）
• 10μlのトゥイーン20
• 7.9ミリリットルのH ₂ O

ブロッキング溶液^8（10ml）中

• 0.3グラムのBSA
• 10μlのトゥイーン20
• 2ミリリットル20X SSC
• 8ミリリットルのH ₂ O

パラホルムアルデヒド固定液（1ml）を

• 393.75μlのH ₂ O（最初の水を追加）
• 450μlの氷酢酸
• 156.25μlの16％のパラホルムアルデヒド

結果

いくつかの異なる組織からの染色体に、;この方法を実証するために、我々は、化学的に蛍光複合体（ 図2）と（ 図2B PCR産物のニックトランスレーションを通じて行わ）長いビオチン化プローブで修飾した小型の商業的に合成されたオリゴのセットをハイブリダイズタイプ（ 表1参照）。標的配列は、D.から有糸分裂染色体の動原体周囲（ヘテロクロマチン）領域に位置するサテライトリピートを含ま蛹Nから幼虫の神経芽細胞（ 図2A-C）、および減数分裂の染色体キイロvitripennis精巣（ 図2D）。これらの場合の各々でのハイブリダイゼーションは、サブ染色体領域に離散的なバンドパターンを明らかにした。言及する価値が一つのポイントは、Dにプローブということですキイロ 359 bpのサテライト反復は、X上で大規模なマルチメガベースのペアブロック、および第3染色体上の非常に小さい領域の両方を認識し、（

ディスカッション

DNA ISHは、しばしば、染色体に特異的な配列をマッピングするために使用される。我々は、高コピー数、ヘテロクロマチンの配列のために最適化DNA ISHのための簡単​​な方法を記載している。むしろ、他の既存のDNA ISHプロトコールにおいて必要条件で、ホルムアミド溶液中での洗浄を使用するのではなく、我々は、DNAを変性させるために予め加熱されたブロックに直接組織に取り付けられたスライドを置く。この方法は、ホルムアミド、大量の使用を回避する。鮮明なハイブリダイゼーションシグナルを産生するための1つの重要な工程は、たて固定液を使用することである。これを行うには失敗（または1ヶ月以上オープンされているホルムアルデヒドで新しいソリューションを作成する）は、信号の解像度を減少させることができる。この方法の制限は、他のDNA ISHプロトコルのように、ハイブリダイゼーション温度は、標的外の配列に偽ハイブリダイゼーションを排除するために最適化を必要とし得る、ということである。

このプロトコルは、シングルfluoropとコンジュゲートしたssDNAプローブ敏感-短い分子当たりホア（ 例...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ポリ-L-リジンコーティングスライド(通常のスライドも使用可能)	シグマアルドリッチ
超微細ピンセット(5ゲージ)	デュモン
22 x 22 mmカバースリップフィ	ッシャー		シグマコート処理15秒間浸漬、吸い取り乾燥、シグマコートのすべての痕跡を拭き取ってカバースリップが透明になるように
グマコート	グマ
フィルターペーパー			75 - 150 mm
のパラフィンのパラフィンのワックスペーパー
温度計
乾燥したインキュベーター
かみそりの刃湿気
の部屋			空のピペット先端箱またはタッパーウェア、湿らせたペーパータオルまたはKimwipes
のCoplinの瓶			スライド溝付き
アルミホイ
パスツールピペット
1.5mlマイクロチューブ
マニキュア			クリアまたはカラーP20
マイクロピペットとプラスチックチップ
ペーパークリップ			20 - 25 標準金属ペーパークリップchain
試薬
16% EMグレードのパラホルムアルデヒド	電子顕微鏡 試薬
酢酸	Sigma
液体窒素
100% エタノール、化学グレード
商業的に合成され、蛍光標識されたオリゴ
長いビオチン化プローブ	インビトロジェン;代替ステップ2.7.1-2.7.3		例えば、ニックをInvitrogen
Rhodamine-Avidin		長いビオチン化プローブを検出するための
ハイブリダイゼーションバッファー
	レシピ		生理食塩水-クエン酸ナトリウム+ Tween
0.1x SSC	以上の		生理食塩水-クエン酸ナトリウム
ブロッキング溶液	のレシピ SBT
	以上のレシピ 上記のレシピ		SSC、ウシ血清アルブミン、Tween
1x PBT	Recipe above		phosphate-buffered saline + Tween
1x PBS			phosphate-buffered saline
Hypotonic solution			0.5% citium in H2O
Formamide	Sigma Aldrich
Vectashield Mounting medium with DAPI	Vector研究 所