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方法論記事

哺乳動物細胞への機能性細菌エフェクターのエレクトロポレーション

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DOI:

10.3791/52296

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2015年1月19日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory, 2Environmental Molecular Science Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory, 3Structural Proteomics Group, Ontario Center for Structural Proteomics, University of Toronto, 4Center for Bioproducts and Bioenergy, Washington State University

この記事について

サマリー

エレクトロポレーションを使用して、精製された細菌の病原性エフェクタータンパク質を直接生きた真核細胞に挿入しました。タンパク質の局在は、共焦点免疫蛍光顕微鏡法によってモニターされました。この方法により、活性な外因性タンパク質を用いた輸送、機能、タンパク質間相互作用の研究が可能になり、真核細胞における異種発現の必要性を回避できます。

要約

生きた細胞の文脈におけるタンパク質相互作用の研究は、ローカリゼーション、ダイナミクス、相互作用パートナーに関する重要な情報を生成することができます。この情報は、宿主 - 病原体相互作用の文脈において特に価値がある。多くの病原体タンパク質は、細胞内環境内で宿主免疫系および生存の回避を可能にするような方法で、種々の宿主細胞内で機能する。タグ化または変異タンパク質、またはトランスフェクションまたは形質導入を介して病原体遺伝子の導入を発現する株によるインビボ感染これら病原体タンパク質の宿主細胞間相互作用を研究するために、いくつかのアプローチは、一般的に含め、使用されている。これらのアプローチの各々は、長所と短所がある。私たちは、直接細胞に外因性タンパク質を導入する手段を求めた。エレクトロポレーションは、一般的に細胞に核酸を導入するために使用されるが、生物物理学的根拠は全く同じであるが、それ以上のことはほとんどのタンパク質に適用されていない。標準的なエレクトロポレーターは、哺乳動物細胞への親和性タグ化細菌のエフェクターを導入するために使用した。ヒト上皮及びマウスマクロファージ細胞は、従来の方法により培養剥がし、目的の外来細菌性病原体タンパク質（ 例えば、ネズミチフス菌GTGE）と0.4cmのギャップエレクトロポレーションキュベットに入れた。電気穿孔法（0.3 kVの）および短い（4時間）の回復期間の後、細胞内タンパク質は、蛍光の親和性タグを介してタンパク質を標識し、共焦点顕微鏡によって空間的および時間的分布を調べることにより確認した。エレクトロポレーションしたタンパク質はまた、細胞内の機能的かつ正確な細胞内輸送およびタンパク質 - タンパク質相互作用が可能であることが示された。外因性タンパク質は、細胞の表面上に蓄積する傾向があったが、エレクトロポレーションサンプルは、単独でインキュベーション反応する細胞内エフェクター濃度相対の大きな増加があった。プロトコルはシンプルで、APで行われるのに十分に高速である病原性タンパク質の細胞内標的化および機能を含む、宿主細胞中の病原体タンパク質の高スループット特性評価を可能にarallelファッション。

概要

多くのグラム陰性細菌に直接、宿主細胞中に1-5（エフェクターと呼ばれる）病原性関連タンパク質を注入するために特殊な分泌系を使用する。宿主免疫の抑制、細胞骨格の変化、細胞内輸送およびシグナル伝達、転写変化の修正、およびホストプロテアソーム改変6-9：これらのエフェクターを含む広範囲の生物学的機能を有している。いくつかのエフェクターの機能は、しかし、ホスト·ターゲットおよび多くの他の生化学的作用（複数の）決定されていない、知られている。野生型および組換え細菌感染を比較する細胞内エフェクター病原性メカニズムを研究するための有効なアプローチであるが、それは、宿主細胞に個別のエフェクターを導入することが有利であることが多い。したがって、宿主細胞の文脈における細菌エフェクタータンパク質を導入し、特徴づけるための単純な方法が非常に望ましい。

実験的な分析のWiの簡素化単一エフェクターが重要な番目他のエフェクターは、対向または冗長機能を有していてもよいように。この単純化を達成するために、研究者は、以前にウイルス形質導入10、マイクロインジェクション11を含む多くの異なる方法によって細胞内に巨大分子を導入して、12,13のロードこすり、化学的に誘導されマイクロインジェクション14による細胞融合、独自のタンパク質「トランスフェクション」は、試薬15、リン酸カルシウム沈殿16、およびエレクトロポレーション17-20。導入された分子は、タンパク質、細胞不透過性色素、および細胞内ターゲット21,22のための抗体のDNA、RNA、およびRNAiの種を含む核酸の範囲である。いくつかの方法を導入することができる高分子の種類などの制限があり、特に、下流の分析は、高い細胞毒性、作用機序の損傷、低効力、または導入効率に制限されてもよい。トランスフェクション、ofte哺乳動物細胞中で細菌遺伝子を発現させるためのnに使用される方法は、また、マクロファージおよび初代細胞のようないくつかの関連する宿主細胞型は、トランスフェクションに向かって特に耐性であるという制約を受ける。これを超えて、それは、外来DNAの導入の際に生成細菌タンパク質のレベルを制御することは困難である。

多くの研究は、一般的な実験手法として、細菌および哺乳動物細胞の両方への核酸の電気穿孔法を確立した。しかし、生理的条件下で細胞内​​にタンパク質を送達するための最良の方法に進行中の研究がある。タンパク質のトランスフェクションに関する報告は有望であるが、高価な試薬及び最適化を必要とする。最小限のコストで細胞標的の多種多様な潜在的に有毒な細菌のエフェクターを導入する欲求は、生体内でこれらのタンパク質を研究するための方法として、エレクトロポレーションを検討するために私達を導いた。

タンパク質のエレクトロポレーション23-25 ​​が満たされるまた、電気トランスフェクションまたは電気注射26として知られているelectropermeabilizationを経由して生きている細胞内にタンパク質を導入するHOD、。この技術は、細胞膜に細孔を作成するために高強度の電気パルスを使用する。これらの可逆細孔は、通常、細胞内空間から除外されている巨大分子が細胞を入力することができます。外部電界が除去されると、膜は、細胞は細孔27,28を通過した分子を保持することができ、再シールすることができる。

標準的なエレクトロは一貫マウスマクロファージ様細胞およびヒト上皮細胞の両方に細菌のエフェクターを導入するために本研究で使用した。この方法は、細胞の生存率のかなりの減少と、迅速、効率的、かつ安価である。導入されたタンパク質は、免疫蛍光顕微鏡で可視化または機能的アッセイのために使用することができる。これは同様に、非毒性基準として緑色蛍光タンパク質（GFP）を使用して実証されている2 サルモネラエフェクタータンパク質、SspH1とGTGE。私たちは、真核宿主細胞における細菌の病原性タンパク質とその機能の研究のためのレパートリーに追加のツールと​​してタンパク質のエレクトロポレーションを提案する。

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プロトコル

1.事前に準備します

  1. 37℃の温かい滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）。
  2. 10％ウシ胎児血清（FBS）を補充したイーグル培地（DMEM）および最小必須培地（MEM）の温かいダルベッコ改変、100 IU / mlペニシリン、および100μg/ mlストレプトマイシン、37℃である。注：これらはそれぞれ、RAWおよびHeLa細胞のために正常な成長メディア（NGM）を表す。

細胞の調製

  1. NGMで百分の70から90までの集密度にRAW 264.7細胞を増殖させる。
    1. 加湿95％空気/ 5％CO 2雰囲気中、37℃で細胞を維持する。
  2. NGMで70から90パーセントの集密度にHeLa細胞を成長させる。
    1. 加湿95％空気/ 5％CO 2雰囲気中、37℃で細胞を維持する。
  3. コレクションの前に、滅菌PBSで一度細胞単層を洗う。
  4. 無菌コニカルチューブにあらかじめコンフルエント細胞を収集する。
    1. 静かにRAW細胞をこすりPBSでラバーポリスで、繰り返しピペッティングで細胞集合体を分散させる。
    2. 目視検査は、培養表面から解離を示すまで、0.25％トリプシン溶液を用いてHeLa細胞を切り離します。例えば、T-75フラスコのために2〜3ミリリットルを使用しています。トリプシン溶液は、全体の成長表面を覆っていることを確認するためにそれに応じて音量を調整します。
      1. NGMは、10％FBSを含有すると解離反応をクエンチした。
      2. セル集計を分散させるために繰り返しピペット操作で、トリプシンNGMの少なくとも2倍のボリュームを使用してください。
  5. 軽く4分間900×gでの遠心分離によって細胞をペレット。
  6. 滅菌PBSを用いてトリプシン/停止溶液と同じ体積で再懸濁する。
  7. 血球計数器またはパーティクルカウンターを用いて細胞数を計測する。
  8. 軽く4分間900×gでの遠心分離によって細胞をペレット。
  9. 5.5×10 6×10 6〜6.0個/ mlのためのPBSの十分な音量で再懸濁します。注：例えば、T-75フラスコapproximを生じる。ately 7.5×10 6細胞29。
  10. エレクトロポレーションまで氷上に細胞懸濁液を保管してください。

エレクトロポレーションのための3.準備

  1. 氷上で事前チルエレクトロポレーションキュベット（0.4cmのギャップ）。
  2. エレクトロポレーション装置の電源を入れ、0.3 kVの電圧を設定する。
    注：容量と抵抗が私たちのエレクトロ（メーカー10μFと600Ωでのセット）で調整可能な設定はありませんでした。
  3. NGMで回復プレートを記入し、37℃の加湿95％空気/ 5％CO 2雰囲気中で平衡化

4.エレクトロポレーション

  1. （50μgの/ ml）を予め冷却したキュベット中の細胞懸濁液の400μlのを置き、キュベットに選択されたタンパク質20μgのを追加します。
  2. フリックキュベットを穏やかに約10回の細胞を損傷させることなく混合する。注：キュベットも完全に混合するために数回反転させてもよいが、ピペッティングしないとダウンしているかボルテックス細胞の損傷を防ぐために。
    3. ドライ外に。
  3. 1.5から1.7ミリ秒0.3 kVのでエレクトロポサンプル。注：これは、この研究のために典型的だった。
  4. すぐにエレクトロポレーションフリックキュベット後に優​​しく〜10回を徹底的に混合する。

細胞の5。メッキ

  1. 回収プレートで配置する直前まで、氷上でエレクトロポレーションした細胞を持つストアキュベット。
  2. 最下流の分析のために、余分なエフェクタータンパク質を除去するために予め温めたNGMで細胞を1倍洗う。
    1. 分析のための細胞を除去し、NGM 3-5 mlの一時停止。
    2. 4分間900×gでの遠心分離によって細胞をペレット。
    3. 所望のプレートサイズのNGMの適切な容積に再懸濁（35mmディッシュ用など 2ml）中。
  3. 下流の分析のための細胞の適切な量を削除します。
    1. 例1：顕微鏡分析用ガラスボトムディッシュにプレート。
    2. 例2：プレートINTそのような親和性精製などのタンパク質分析oを細胞培養プラスチック。
  4. 細胞は、少なくとも4時間、37℃で加湿した95％空気/ 5％CO 2雰囲気中で平衡化プレートに回復させる。

6.顕微鏡分析

6.1）固定/免疫蛍光染色

  1. 洗浄細胞を4時間の回復期間の後、滅菌PBSで1倍。
  2. 室温で2分間、100％メタノールで細胞を固定する。完全に細胞（35mmディッシュ用など 2ミリリットル）をカバーするのに十分なメタノールを使用してください。
  3. 滅菌PBSで洗浄3X。
  4. 15分間、PBS中0.4％トリトンX-100で細胞を透過性。例えば、直径35mmの板に1ミリリットルを使用しています。
    1. エピトープおよび標的タンパク質の位置に応じてトリトンX-100の透過及び強度の長さを調整する。注意：最良の結果はしかし、上記の条件は、ほとんどのCで十分であるべきであり、経験的に各ターゲットのために決定する必要がありますytosolicターゲット。
  5. RTで1時間、PBS中の5％ウシ血清アルブミン（BSA）でブロックする。例えば、直径35mmの板に1ミリリットルを使用しています。
  6. PBSで洗浄3X。
  7. 4℃で一晩、抗体結合溶液中で一次抗体（PBS中0.1％トリトンX-100および1％BSA）をインキュベート 穏やかに揺らしながら°C。例えば、直径35mmの板に0.5ミリリットルを使用しています。
    1. 抗体希釈用の製造元の推奨に従ってください。注：200希釈PKN1抗体は1で使用しながら1,000希釈たとえば、ストレプトアビジン結合ペプチドタグ（SBPタグ）抗体は1で使用した。
  8. PBSで洗浄4X。
  9. 光から保護し、室温で1時間、抗体結合溶液中で適切な蛍光結合二次抗体と共にインキュベートする。
    1. 例えば、室温で1時間、アレクサ488またはアレクサ647を使用する。
      1. アリのためのメーカーの推奨事項に従ってくださいibody希釈。 （ 例えば 、約1：この研究のために1,000）。
    2. 例えば、必要に応じて他の汚れを追加し、5μM小麦胚芽agglutinnin（WGA）を室温で1時間、製造業者の推奨に従ってアレクサ647またはDAPIにコンジュゲート。
  10. 画像への準備が整うまで、光から保護し、PBSおよび4℃で店を洗浄5回、。

6.2）共焦点顕微鏡と画像解析

  1. 63×油浸対物レンズを用いた倒立共焦点顕微鏡での画像サンプル。
    1. 492から542 nmの間の帯域幅の放射を有するアルゴンレーザーの488nmのラインを使用して画像の緑色チャネル、。
    2. 640から718 nmの間の帯域幅の放射を、633nmのダイオードレーザーを使用して、画像の赤チャンネル。
    3. 407から453 nmの間の帯域幅の放射を、405nmのダイオードレーザーを用いて画像青チャンネル。
    4. Z-スタックは細胞容積の全体をカバーする複数のチャンネルを確認してください。
  2. 適切な画像処理ソフトウェアで処理·イメージ。

7.アフィニティ精製

  1. 4時間の回復期間の後、4℃PBSで2回エレクトロポレーションした細胞を洗浄。
  2. 氷上で溶解緩衝液（PBS中のプロテアーゼ阻害剤カクテルおよびホスファターゼ阻害剤1％トリトンX-100）の〜1.0ミリリットルと溶解する。製造業者の指示に従って、阻害剤を使用してください。注：たとえば、両方の本研究で用いたホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤は、100倍で供給したが、他の製剤は、同様に良好に動作するはずです。
  3. 速やかにラバーポリスで細胞をこすりし、円錐形のチューブに集める。
  4. 激しいボルテックスおよび超音波処理によって溶解する。注：他の溶解方法は、同様に同様に動作する可能性がありますが、効率は経験的に分析要件の適合性として決定する必要があります。
    1. 断続的にボルテックスしながら超音波処理3×30秒。
  5. 収集するために4℃で10分間万×gで遠心分離し細胞破片と不溶性の凝集体。上清を保存します。
  6. 転倒回転で4℃で一晩ストレプトアビジンアガロース樹脂懸濁液50μlでエレクトロ細胞溶解物の等容量（〜1.0ミリリットル）を組み合わせる。注：この樹脂は、そのストレプトアビジン結合ペプチドの親和性タグを経由して電気穿孔したタンパク質（および関連複合体）をキャプチャします。
  7. 2分間2500×gで遠心分離し、上清を捨てる。
  8. 40床体積（〜1ミリリットル）PBSで2回洗浄します。
  9. 30μlの4X LDSローディングバッファー（141 mMのトリス塩基、2％LDS、10％グリセロール、0.51 mMのEDTA、0.22 mMのSERVAブルーG、赤0.175 mMのフェノール、pH8.5）中、20μLのdiH 2 O、および1μlのを追加します。いくつかのボリュームを可能にする0.5 Mトリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン（TCEP）は、ビーズ中に残留する。
  10. 10分間95℃で加熱し、氷上で冷却する。
  11. 5分間、4℃で>万XGスピン。
  12. 上清を収集します。
  13. 適切な抗体を用いたウエスタンブロットを実行注：彼再度、抗PKN1一次抗体が使用される。

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結果

概念の最初の証明として、精製された緑色蛍光タンパク質が正常にエレクトロポレーションを用いて哺乳動物細胞に導入した。 GFP、おおよそ27 kDの分子量のタンパク質は、一般的に重要な細胞毒性なし分子生物学のツールと​​して（通常は、プラスミドDNAから発現）哺乳動物細胞に導入される。 HeLa細胞（ 図1A）インキュベートまたは蛍光GFPシグナルをチェックするために、免疫蛍光共焦点顕微鏡続いを25μg/ mlのGFPと（ 図1B）、エレクトロポレーションした。 GFPは、細胞の細胞質ゾルの中にあったことを実証するために、細胞は、核を示すために、サイトゾル境界（赤）、ならびに核酸染色剤、DAPI（青）を描写するコムギ胚芽凝集素（WGA）で染色した。ない細胞内タンパク質は、GFPとインキュベートした細胞では観察されなかった細胞内のGFPシグナルは、唯一のエレクトロポレーションの際に観察された。同様の結果は、RAW264.7マウスで観察されたマクロファージ様細胞（ 図1Cおよび1D）。 WGAは、優先的に、原形...

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ディスカッション

病原性細菌から分泌されたエフェクターは、宿主細胞環境内で機能するように進化してきたので、それは、宿主内で、その場でそれらを研究するために有用である。宿主細胞への関心の特定のエフェクターの導入は、関連する病原体 - 宿主相互作用は、他の細菌タンパク質からの干渉なしに孤立して研究することができるようになります。目標は、それによってトランスフェクションまたは形質導入に関連する課題のいくつかを回避し、真核生物宿主細胞への細菌のエフェクタータンパク質を導入するための手段として、エレクトロポレーションを探索することであった。緑色蛍光タンパク質を対照として使用したサルモネラエフェクタータンパク質を試験した。なぜなら、上皮細胞ならびに免疫細胞、ヒト上皮様細胞株（HeLa細胞）およびマウスマクロファージ様細胞（RAW 264.7）をホスト標的病原菌の関心を使用した。エレクトロポレーションは、細胞viabiliんのかなりの減少に伴って宿主細胞に外因性タンパク質を提供することができますティ、および配信のタンパク質は、最大4日間細胞において検出可能であった。

エレクトロ...

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開示事項

著者らは、開示することは何もない。

謝辞

この作業はNIGMS、国立衛生研究所(GM094623)の支援を受けました。この研究の大部分は、太平洋岸北西部国立研究所(PNNL)にあるDOE/BERの国立科学ユーザー施設である環境分子科学研究所で行われました。PNNLは、契約DE-AC05-76RLO1830の下でBattelleによってDOEのために運営されています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.25% トリプシン-EDTA 溶液Cellgro25-050-Cl
0.4 cm ギャップディスポーザブルエレクトロポレーションキュベットバイオ・ラッド165-2088
100% メタノール任意のN/A可燃性、有毒
ウシ血清アルブミン (BSA)Sigma-AldrichA4919
細胞計数装置 - 血球計算盤またはコールターカウンターベックマン・コールターモデルZ1
細胞培養インキュベーター任意のN / A加湿95%空気/ 5%CO2 ><37 >C 
細胞培養プラスチック任意のN/A細胞培養フラスコ/プレート、ピペット、チューブ、ゴム警察官
ダルベッコのイーグルの改造s ミディアム (DMEM)Cellgro10-013温めて 37 °C;C 
エレクトロポレーターBio-RadE. coli Pulser
Fetal Bovine Serum (FBS)Cellgro35-016-CV
蛍光共焦点顕微鏡 Ziessモデル LSM 710 
顕微鏡用ガラス底皿Wilco WellsHBSt-3522
HALT プロテアーゼ阻害剤 カクテルピアス78430腐食性、毒性
HeLa 細胞株ATCCATCC CCL-2
LDS 4X ローディングバッファーInvitrogenNP0007
Minimal Essential Medium (MEM) Cellgro10-010温めて 37 °C;C 
その他の蛍光染色(WGA、DAPI)と抗退色剤との併用任意のN/A
ペニシリン/ストレプトマイシンCellgro30-002-Cl
RAW 264.7 細胞株ATCCTIB-71
目的のターゲットに対する一次抗体任意のN/A
蛍光色素に結合した二次抗体任意のN/A
リン酸緩衝生理食塩水任意のN / Aチル4°C;C 
滅菌リン酸塩緩衝生理食塩水任意のN / Aは37°Cまで温かく;C 
[header]
ストレプトアビジンアガロース樹脂懸濁液 Pierce20353
テーブルトップ遠心分離機(スイングバケットが望ましい)任意のN / A
TCEPシグマ-アルドリッチ646547腐食性、有毒
トリトンX-100シグマ-アルドリッチT8585性、有毒
な円錐管を受け入れることができる刺激

参考文献

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