方法論記事

病気のモデリングのための筋生検からの患者由来の細胞株の単離と不死

DOI：

10.3791/52307

⸱

2015年1月18日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, UT Southwestern Medical Center, 2National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institute of Health, 3Division of Pediatric Pathology, Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical College of Wisconsin, 4Division of Genetics and Genomics, Boston Children's Hospital

この記事について

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サマリー

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このプロトコルは、筋肉または皮膚組織からの筋原性および線維芽細胞株の生細胞単離および初代培養の技術について説明しています。 これらの細胞株を不死化するための技術についても説明する。 全体として、これらのプロトコルは、ダウンストリームアプリケーション用の患者由来細胞を生成および保存するための信頼性の高いツールを提供します。

要約

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患者特異的な細胞株の生成は、診断研究やトランスレーショナル研究のための非常に貴重なツールであり、これらの細胞は患者の診断精密検査中に利用可能な皮膚または筋肉生検組織から収集することができます。 このプロトコールでは、初代細胞培養のための少量の筋肉または皮膚組織からの生細胞単離の技術について説明します。 さらに、初代細胞からの筋原性細胞株および線維芽細胞株を不死化する技術を提供します。 細胞株が不死化されると、患者由来の細胞の大幅な増殖を達成できます。 不死化細胞は、薬物スクリーニングや遺伝子変異のin vitro修正など、多くのダウンストリームアプリケーションに適しています。全体として、これらのプロトコルは、ダウンストリームアプリケーション用の患者由来細胞を生成および保存するための信頼性の高いツールを提供します。

概要

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分子診断は過去20年間で劇的に進化しました。 ゲノムDNAは、以前は採血が必要だったが、現在では喀痰や頬のぬぐい液から日常的に分離されている。 現在の迅速なターンアラウンドタイムと遺伝子シーケンシングの容易さにより、多くの疾患の突然変異は、追加の検査を必要とせずに日常的に特定されています。 筋疾患の診断の場合、過去10年間に筋ジストロフィーまたはミオパチーの原因となる数十の新しい遺伝子が同定されたことで、これらの疾患の診断方法が劇的に変化しました1,2。 現在、筋ジストロフィーや先天性ミオパチーの原因として特定されている遺伝子は数十種類ありますが、これらの遺伝子の多くが疾患を引き起こすメカニズムは不明のままです。 特に、希少疾患は、患者集団の規模が小さいため、課題となっています。 これらの症例や、より一般的な疾患については、病因のメカニズムや治療薬のスクリーニングに関する研究を容易にする安定したツールの生成が非常に望ましいです。

DNA診断の劇的な進歩にもかかわらず、一次診断を確立するために筋生検が依然として行われています。これは、原発性代謝疾患または筋疾患が疑われる多くの患者において行われます。 筋生検が必要な場合、患者にとって追加の罹患リスクを最小限に抑えながら、追加の診断および研究組織を収集する機会を提供します。 各組織標本には多くの用途があるため、手術用組織を使用した初代細胞培養の技術は、簡単で効率的で、必要な組織量が最小限に抑えられることが非常に望ましいです。 組織からの初代細胞の分離を最大化し、生物質を長期保存するには、筋肉生検または皮膚生検の適切なトリアージが必要です。 さらに、幹細胞研究と薬物スクリーニングは、細胞ベースのアッセイ3,4を使用して多くの疾患の治療法を開発するために大きな期待を寄せています。

ここでは、ヒトの筋肉または皮膚の生検から初代細胞を単離する方法を説明します。 さらに、筋原性細胞の不死化のためのプロトコルが含まれており、これは個体から多数の細胞を生成するのに役立ちます。 これらの細胞は、一次組織から得られる細胞の数が全体的に少ないため、他の方法では達成できないカスタムドラッグスクリーニングなどのダウンストリームアプリケーションに使用できます。

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プロトコル

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注：ヒト組織の収集のためのプロトコルを見直し、制度IRB委員会によって承認されなければならない。廃棄された、デ同定されたヒト組織の収集は、ボストン小児病院とブリガム·アンド·ウィメンズ病院IRB委員会によって承認されています。以下に記載される方法は、非識別破棄組織からの筋原細胞の単離のために適用されている。記載された方法は同意患者材料から採取した組織にも適用可能である。

1.細胞の単離

  1. 筋生検と筋原細胞の精製の解離
    1. 組織培養バイオセーフティーフード内で10cmの組織培養プレートを、予め計量し、解離される組織の量を計算するために筋生検を含む再度計量プレート。
    2. 細かく、ミンチの筋肉組織を無菌メスを使用し、乾燥から組織を防ぐために、滅菌1X HBSSを数滴を追加します。
    3. 3.5ミリリットルのジのそれぞれを追加します。のSPase IIおよび筋組織のグラムあたりのコラゲナーゼDを消化する。無菌の25mlピペットを通して数回に細分化した組織と酵素溶液をピペット。 15分間、5％CO 2、37℃で組織培養インキュベーター中でプレートをインキュベートし、スラリーを簡単に無菌の5mlのピペットも通過するまで組織を消化する。
      注：組織の解離は、通常、45〜90分以内に酵素消化することにより達成される。詳細は、「代表的な結果」セクションを参照してください。
    4. 329 XG（〜1100 rpm）で、室温で10分間50ミリリットルの円錐管とペレットの細胞の上に100μmのセルストレーナーを通して解離した組織、フィルタに滅菌成長培地の2ボリュームを追加します。培地組成のための材料の表を参照してください。
    5. 滅菌増殖培地の1容積にペレットを再懸濁し、赤血球溶解液を7ボリュームを追加。 40μmのセルストレーナーを通して溶液をフィルタリングし、その後Tペレット329×gで、室温で10分間、彼は細胞。
    6. 血球計数器で細胞を数え、1×10 6細胞/ 100μlの濃度で1X HBSS、0.5％BSAで細胞を懸濁します。ネガティブ（非染色）を対照として使用される単一の管に置い〜250,000細胞を設定します。脇FACS選別によりCD56陽性細胞の適切なゲーティングのために必要とされるヨウ化プロピジウムおよびCD56のための追加単色染色コントロール管を、設定してください。並べ替えマニュアルを細胞又は適切なコントロールを確実にするために中核施設の専門家をFACSソーティングが含まれていると相談を参照してください。
    7. 抗CD56抗体の5μlの/ 10 6細胞でソートする細胞を染色する。氷上で30分間（対照を含む）すべてのサンプルをインキュベートする。
    8. 冷却遠心機中で329×gで（〜1100 rpm）で10分間、10ミリリットル1×HBSS、ペレット細胞における洗浄サンプル、4℃の温度。
    9. SORである試料には1μg/ mlの最終濃度でヨウ化プロピジウムを追加死細胞を排除するためのテッド。蛍光活性化セルソーターを使用して非筋原細胞から筋原CD56陽性細胞を精製する。
  2. 皮膚生検の解離
    NOTE：筋肉生検を入手できない場合真皮線維芽細胞は、患者からの皮膚パンチから単離することができる。真皮線維芽細胞は、筋原細胞を生成するためのMyoDでの形質導入を含む多くの研究のための生体材料として使用することができます。さらに、真皮線維芽細胞は、さらなる研究のために種々の細胞型に分化させることができるiPS細胞を生成するために用いることができる。
    1. 輸送培地中の研究室に皮膚生検を輸送する。サンプルが受信されると、できるだけ早く初代培養を行う。初代培養は、同じ日に確立できない場合、一晩室温で試料を保管。
    2. 層流フード内で無菌の35mmのペトリ皿に皮膚生検を転送する。
    3. 無菌の1とペトリ皿に皮膚生検をすすぐX PBSを血液や破片を除去する。滅菌メスで脂肪組織を削除します。
    4. 2ミリリットルのコラゲナーゼ溶液を追加し、外科用メスで組織をミンチ、組織の大きさに応じて、1時間に45分間37℃でインキュベートする。
    5. 15mlのコニカルチューブに消化された組織を転送回線維芽細胞培養培地2mlでペトリ皿をすすぎ、そして同じチューブに培地を収集する。
    6. 室温で5分間、200×gで細胞をペレット。
    7. 上清を捨て、コラゲナーゼを除去するための線維芽細胞培地3mlでペレットを洗浄し、再び細胞をペレット。培地組成のための材料の表を参照してください。
    8. ステップ1.2.7 1より多くの時間を繰り返します。
    9. T25無菌組織培養フラスコ上に5ミリリットル線維芽細胞培地プレートの細胞ペレットを再懸濁する。 5％CO 2、37℃でフラスコをインキュベートする。
    10. 次の1〜3日間の線維芽細胞の付着と成長のための文化を評価します。
      注：一部の小規模な組織片を、プレートに取り付けることができ、線維芽細胞は、これらの組織片の外に移動する。
    11. 線維芽細胞が約80％コンフルエンスまで増殖させるまで、同様の条件下で培養を維持する。
    12. トリプシン処理により繊維芽細胞を収集し、追加の拡張のために新鮮な培養フラスコに移す。のCa ++およびMg ++を含まない培養液を1×PBSで3回洗浄することによりトリプシン処理を実行します。 37℃で2分間細胞（2ミリリットル/ T25フラスコ）にトリプシン-EDTAを（材料表を参照）を追加します。
    13. 追加のフラスコに剥離した細胞を分割。いくつかの組織片は、元のT25フラスコに取り付けたままにした場合、このフラスコに5ミリリットルの新鮮な培地を追加し、より多くの線維芽細胞は、継続的に行わ移行する。
      注：拡張され線維芽細胞培養は、P1として凍結し、および将来の実験のために液体窒素中で保存することができる。

筋原細胞の2不死

  1. を一晩4の比率のDMEMと培地199 10cmの滅菌組織培養プレート中にプレート500万フェニックス同種指向性パッケージング細胞（PE）：10％ウシ血清を補充した1、。
  2. 10 mMのカフェインを補足した新鮮な培地の5ミリリットルを用いたトランスフェクションの30分前にフィード細胞。
  3. ミディプレップ（CDK4またはhTERTのプラスミド）およびpolyjetからのプラスミドDNAを2μgの混合物を均質化し、製造業者によって推奨されるように、15分間室温でインキュベートする。
  4. 一晩PE細胞にプラスミド/ polyjet混合物を追加します。
  5. 新鮮な培地を供給した細胞（DMEMと4の割合で199培地：10％ウシ血清を補充した1）。 12時間後、ウイル​​ス含有上清を収集し、0.45μmの孔径のフィルターを通して濾過する。
  6. G41（いずれかの0.5mg / mlのネオマイシンを選択した後、一晩両栄養性パッケージング細胞系統PA317 5に感染し 、安定なウイルス産生細胞株を得るために収集された上清1mlを使用8）CDK4または0.5ミリグラムのために/ hTERTのためのmlハイグロ。
  7. 3収穫のために毎朝、夕方と朝の上清を収穫その後、近くに密集するまで安定したパッケージング細胞を増殖させることによって作業ウイルス上清を準備します。
  8. ウイルス上清を濾過し、直接、後で使用するために-80℃で1ミリリットルのアリコートとストアに使用したり、それらを分ける。ウイルス上清は、それぞれの凍結融解で50％の感染効率を失うことに注意してください。ウイルス粒子に触れたすべてのものを廃棄する前に洗浄を漂白することを忘れないでください。
    注：安定PA317ウイルス産生細胞株は、（凍結培地は、10％のDMSOで90％血清）永久記憶のために-150℃で凍結させ、維持することができる。
  9. プレートFACS精製筋原細胞/ウェル、0.1％ゼラチンでコーティングした6ウェルプレート中で5×10 4細胞の密度で（1.1から1.9のステップで説明する）。細胞がウイルス感染を進める前に、プレートに接続されていることを確認。
  10. F、フィルタ400μLを追加reshly（コントロールとして2つのウェルを維持する）一晩各6ウェルプレートにウイルス上清または冷​​凍アリコートを生産した。
  11. 2.5ミリリットル/ウェルの新鮮筋肉メディア（4で細胞を供給することにより、培地を変更します; 0.02 M HEPES緩衝液、1.4 mg / LのビタミンB12; 15％ウシ胎児血清を補充した1ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）および培地199 0.03ミリグラム/ LのZnSO 4、0.055 mg / Lのデキサメタゾン、2.5μg/ Lで、肝細胞増殖因子および10μg/ L塩基性線維芽細胞成長因子）。漂白剤容器内にウイルス粒子を含む培地とピペットを捨てます。どちらを400μg/ mlのネオマイシン（CDK4感染症）または300 / mlのハイグロ（hTERTの感染）を使用して、選択のための治療、その後、感染から回復するために3日間同じ培地中の細胞のままにしておきます。
  12. 制御皿ダイ内の細胞（1〜2週間）まで、薬剤選択の下で細胞を維持する。
  13. さえのSelectI中に、（EDTA、トリプシン、0.05％を使用して60〜80％の集密度）、継代細胞コンフルエントになる前に期間に。選択薬剤を補った新鮮な筋芽細胞培地で複数の10センチメートル皿でReplate細胞（2.11に記載されている）。完全に均一に遺伝的背景（すべてのセルにおける導入遺伝子の同じ挿入）を取得するために不均一集団またはクローンなどの不死化、選択したセルを維持します。
  14. 次の手順を使用してクローン選択を実行します。
    1. （10cmの皿で例えば 300から500細胞）の低密度で細胞を播種し、小さなコロニーは（10〜20セル）が形成されるまで、約2週間のためにそれらを維持する。
    2. 乾燥から細胞を防ぐために、薄膜のみを残して、この時点で、培地のほとんどを除去する。
    3. 各所望のクローンの上（一端とシリコーン真空グリースに浸し）クローニングリングを配置し、トリプシン/ EDTAの数滴を追加します。
    4. 収穫細胞は、彼らは慎重に1ミリリットルチップまたはパスツールピペットを用いて細胞を吸引し、最小の利用可能なマルチウェルPLAにそれらを転送することによって丸くなるたらTE（96または48、24または12ウェルプレート）。
    5. 地元の集密度を防ぐために、必要に応じてクローンを展開します。

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結果

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図1は、一次組織解離に関与する重要なステップのいくつかを示しています。組織の正確な量は、無菌組織培養シャーレ（ 図1A、B）に秤量する。組織スラリー（ 図1C、D）が得られるまで、次に組織を微細に、無菌の外科用メスを用いて細かく切り刻まれる。消化酵素を添加した後、一次筋組織の解離は、通常、45〜90分以内に酵素消化することにより達成される。組織消化の進行は、典型的には、過剰消化し、細胞死を防ぐために、すべての15〜20分を監視している。酵素消化を穏やかに15〜20分毎に数回ピペッティングし、混合することができる。消化工程の最後に、細胞は、100μm（ 図1E、F）、次いで40ミクロンのフィルターを通して濾過する。解離した一次セル、筋肉組織の出発量を、サンプルが軽度または重度の影響を受けた筋肉から得られるかどうかに応じてlsが不均質になる。 図1Gは、図1Hは組織培養皿中で消化し ​​、プレーティングの解離した一次細胞で3-6時間の例を示してすぐに、消化後に懸濁液中の単...

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ディスカッション

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便利な資源としての細胞

疾患のインビトロモデルにおけるまたは疾患の表現型を確立する際に筋原細胞集団の単離および文化は極めて有用である。ここで説明する筋原細胞単離手順は、次に、伝播分化、またはすぐに分析することができる骨格筋標本からの筋芽細胞および線維芽細胞の単離を可能にする。筋芽細胞の構造および機能は、細胞生存、細胞融合の評価の評価、ま​​たはRNAもしくはタンパク質発現の分子的研究を介して、顕微鏡検査を介して評価することができる。さらに、筋芽細胞は、組織損傷後の筋肉の発達及び回復の文脈における筋芽細胞機能の直接的な評価を可能にする、未成熟筋線維の多くの特徴を共有して筋管に分化させることができる。これらの表現型の全ては、筋原細胞の初期の継代ではかなり再現性がある傾向があるが、多くの主要メートルの挙動yogenic細胞株は、多くの継代にわたって変更することができる。その結果、より長期間にわたって培養の確立を容易にし、再現性のある結果の生成を容易にすることができる特定の筋原細胞株（ここで説明したように）、不死化することが望ましい場合がある。

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開示事項

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著者らは開示するものは何もない。

謝辞

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この出版物は、Association Contre Les Myopathies(AFM)助成金(プロジェクト16297)であるCure CMDと、国立衛生研究所(助成金番号K08 AR059750、L40 AR057721、および2R01NS047727)によって資金提供されています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
機器
ティッシュ 文化用バイオセーフティフードBaker Company, Inc.モデルSterilGuardフード
ベンチトップ遠心分離機、ベックマンモデル ベックマン・コールターモデル アレグラ 6R細胞選別を行う場合は、冷蔵式の遠心分離機が望ましい
顕微鏡ニコンモデル エクリプス TS100
組織培養インキュベーター、CO2に接続 ソースForma Scientific シリーズII
蛍光活性化セルソーター(FACS)Becton DickinsonModel Aria
組織からの
Dispase IIRoche Applied Science#04942078001DMEM
コラゲナーゼD ロシュ・アプライド・サイエンス#08888200110 mg/ml
1x Sterile Hank' の原液を調製します。s バランス生理食塩水 (HBSS)、カルシウムおよびマグネシウムフリーGIBCO Life Technologies#14185-052
ウシ血清アルブミン、フラクション VSigma#05470FACSソーティング用の1X HBSS 0.5% BSAの無菌溶液を準備し
ます 筋芽細胞用の無菌増殖培地:ダルベッコのモディファイドイーグル」高グルコース(4.5g)を添加した培地(DMEM)に30%ウシ胎児血清を添加GIBCO Life Technologies11965-092L-グルタミン
RBC溶解液Qiagen158904
ヨウ化プロピジウムストック 10mg/mlシグマP4170滅菌蒸留水で粉末を希釈してストック溶液を調製
フローサイトメトリー用抗ヒトCD56抗体バイオレジェンド318310APC標識抗体、その他のラベルは
、初代筋芽細胞の不死化のための試薬です
エコトロピック包装細胞株 PE細胞バイオラボRV-101
両性包装細胞株 PA3174細胞バイオラボRV-102
豚皮ゼラチンシグマG1890-500g0.1%ゼラチンを水に溶かした原液を調製します。皿を37°Cの溶液でコーティングします。Cを1時間。溶液を取り出し、培地を追加します。
ポリジェット SignagenSL100688
G418 Fisher345812
HygromycinEMD Biosciences400051
pBabe plasmids containing mCDK4 and hTERTnot commercially availableStadler et al, 2013
Qiagen plasmid midiprep kitQiagen12143
Medium 199Life Technologies ミディアム 199 (31150022)
ダルベッコ's modified Eagle medium (DMEM)Life Technologies DMEM (11965-092)ミックス 4:1 DMEM:199
筋芽細胞増殖培地: 4:1 ダルベッコ's modified Eagle Medium (DMEM) および Medium 199 に 15% ウシ胎児血清を添加しました。0.02 M HEPESバッファー;1.4 mg / LビタミンB12;0.03 mg/L ZnSO4、0.055 mg/L デキサメタゾン、2.5 μg/L 肝細胞増殖因子と 10 μg / Lベータ線維芽細胞成長因子。ライフテクノロジー(DMEM、F199);アトランタバイオロジカル(FBS);インビトロジェン(Hepes);フィッシャー(硫酸亜鉛);シグマ(Vit.B12、デキサメタゾン);ケミコンインターナショナル(HGF);バイオパイオニア(betaFGF) #15630-080 (ヘペス); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12、Dex);GF116(HGF);HRP-0011 (bFGF). 培地と原液Vit.B12(20mg / ml)を調製します。硫酸亜鉛(60µg/ml);デックス(55µg/µl)使いやすくするために別途。HGFストック溶液(5μ;g/ml)およびFGF(20μ;g / ml)は、最終作業濃度で毎週新たに追加する必要があります。
TrypLE expressGIBCO Life Technologies12605-010
免疫染色用ミオシン重鎖抗体Developmental Hybridoma BankMF20Clone MF20
Desmin 免疫染色用抗体Thermo ScientificMS-376-S0Clone D33
Horse serumInvitrogen26050-088
一次皮膚線維芽細胞単離用試薬
輸送培地:RPMI 1640 10% ウシ胎児血清と 0.2% ペニシリン/ストレプトマイシンRPMI 培地 1640:GIBCO Life Technologies11875-093
ヒト初代線維芽細胞培地:RPMI 1640 10% ウシ胎児血清と 1% ペニシリン/ストレプトマイシンシ胎児血清:Thermo ScientificSH30071.03
コラゲナーゼ溶液:コラゲナーゼ2型(100mg)を12.5 mlの線維芽細胞培養培地およびフィルター滅菌に再懸濁Worthington4176
滅菌済み1Xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)カルシウムおよびマグネシウムフリーLonza17-516F
一次筋芽細胞
50 mlおよび15 mlの滅菌コニカルチューブGeneMate/BioexpressC-3394-4(50ミリリットル);C3394-1 (15 ml))
滅菌メスAspen Surgical372610
血球計算盤Hausser Scientific1492
滅菌済み 5、10、25 ml ピペットBellco glass1226-05010 (5 ml); 1200-10010 (10 ml) ;1228-25050 (25 ml)再利用可能なピペットは、使用前に洗浄、綿の差し込み、オートクレーブ滅菌
滅菌組織培養処理プラスチック皿 (10 cm)BD Falcon353003
滅菌ナイロン細胞ストレーナー (100 & マイクロ;mおよび40 µmサイズ)BDファルコン352340(40µm);352360 (100µm)
 筋芽細胞の不死化
Sterile 0.45 µm filtersMilliporeSLHV013SL
Cloning ringsCorning#3166-8使用前後の洗浄とオートクレーブ
線維芽細胞株用材料 
滅菌35 mm組織培養処理プラスチック皿Greiner bio-one628160
滅菌メスDeRoyalD4510A
滅菌T25組織培養フラスコテクノプラスチック製品、TPP90026MIDSCI
TrypLEエクスプレスGIBCO Life Technologies12605-010
一次筋芽細胞の単離用試薬を含む ウの単離用材料されます のための材料滅菌 によって米国で販売されています

参考文献

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$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling
Posted by JoVE Editors on 11/12/2016. Citeable Link.

A correction was made to the authors section in: Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

One of the authors names was corrected from:

Stacy C. Cossette

to:

Stacy A. Cossette

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FACS CDK4 hTERT

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