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方法論記事

癌細胞に対する浸潤突起と牽引力のアッセイのために、ポリアクリルアミドゲル

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⸱

DOI:

10.3791/52343

⸱

2015年1月4日

 , 
1Department of Otolaryngology, Vanderbilt University Medical Center

この記事について

サマリー

腫瘍微小環境中の機械的剛性が浸潤突起の活性を増加し、収縮性アクトミオシンによって悪性の挙動を駆動する重要な役割を果たしている。アクリルアミドゲル（PAAS）を使用して、浸潤突起と牽引力アッセイは、マトリックスの剛性に応じて、癌細胞の浸潤性および収縮特性を研究するために利用することができる。

要約

剛性の腫瘍組織が強く癌細胞の遊走および浸潤の調節に関与している。架橋された組織を通って浸潤性移行がタンパク質分解的に細胞外マトリックス（ECM）を分解する浸潤突起と呼ばれるアクチンリッチ突起によって促進される。浸潤突起活性剛性信号がアクトミオシン収縮性を介してこれらの細胞内構造を調節することができることを示唆しているECMの剛性および癌細胞の収縮力に依存することが示されている。癌細胞の浸潤性および収縮特性が異なる剛性のポリアクリルアミドゲル（PAAS）に基づいて、浸潤突起と牽引力アッセイを用いてインビトロで相関させることができる。癌細胞の浸潤性および収縮特性が異なる剛性のポリアクリルアミドゲル（PAAS）に基づいて、浸潤突起と牽引力アッセイを用いてインビトロで相関させることができる。つのアッセイ間のいくつかのバリエーションが存在するが、ここで提示プロトコルは、PaaSの目を作成するための方法を提供では、両方のアッセイで使用され、ユーザの特定の生物学的および技術的なニーズに容易に適応可能であることができる。

概要

腫瘍関連ECMの剛性がアクトミオシン収縮1-3を増加させることによって、悪性の挙動を駆動する重要な因子として同定されている。この効果は、主に乳癌細胞を用いて実証されているが、マトリックスの剛性は、腫瘍の剛性が癌の他のタイプにおいて役割を果たし得ることを示唆している癌4-8種々の由来する細胞の浸潤特性を変化させることが見出されている。侵襲的な移行時に架橋された組織に浸透するには、癌細胞が限局的にECM 9を分解するためにプロテイナーゼをローカライズ浸潤突起として知られているアクチンが豊富な接着剤の突起を利用する。浸潤突起は、侵襲性細胞の特徴であると考えられ、腫瘍細胞の浸潤および転移10,11に関与している。以前の研究は、マトリックスの剛性がミオシンIIの活性および機械受容タンパク質12を通って浸潤突起数を調節し、関連したECM分解4,12ができることを示している。与えられた腫瘍の密度と癌の悪性13,14の間の相関は、これらの結果は、癌細胞がアクトミオシン収縮を通じて浸潤及び転移を駆動するために硬質の腫瘍組織に応答することができるメカニズムを示唆している。

インビトロ ECMの剛性及びインビボ組織密度で癌細胞1,15-17の侵襲的挙動を調節することが示されている。アクトミオシン収縮性は、このプロセスにおいて重要であると思われるが、転移能力を増加するために相関または収縮力6,18-20を減少させるかどうかの現在の研究の競合。さらに、これらの力が直接浸潤突起の活動21を仲介するかどうかは不明のまま。我々は最近、癌細胞の収縮力は、マトリックスの剛性に依存していたと浸潤突起5によるECM分解を予測することを見出した。これらの結果は、細胞の力が浸潤突起交流を媒介することによって癌の進行に重要な役割を果たし得ることを示唆している腫瘍微小環境の機械的特性に応じて、電率。

癌細胞5の侵襲及び収縮特性を相関するために、我々は以前に剛性に依存浸潤突起活性4,12,22を調査するために使用された異なる剛性とのPaaSを作成するためのプロトコルを変更した。化学PAASを通してヒト血漿フィブロネクチンを架橋することにより、これらの修飾されたヒドロゲルは、細胞が両方の実験5と同じ剛性を経験したことを確認するために浸潤突起と牽引力アッセイの両方のための基礎として使用することができる。浸潤突起アッセイでは、フィブロネクチンは、マトリックス分解を検出するためのPaaSにオーバーレイされたECMをリンクするゼラチンのための天然の結合ドメインを提供しています。牽引力アッセイにおいて、フィブロネクチンは、細胞の牽引力を計算するために使用される微小球の変位を検出するための直接的な細胞接着のためのリガンドを提供する。我々はハード、ソフトと呼ばれるているもので、このメソッドの結果、ガラスボトムディッシュに結合し、正常および癌組織23について報告された機械的性質の範囲に及ぶ1023、7307、および22692 Paの5の弾性率、Eは、持っているし、剛性のPaaS。

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プロトコル

PaaSのためのガラスカバーガラスの作製

  1. 低リントワイプで清掃12ミリメートルのカバースリップ。
  2. 炎12ミリメートルのカバースリップとピンセットを使用してブンゼンバーナーの炎に通して各35ミリメートルのガラスボトムディッシュのマイクロウェルで14ミリメートルのカバースリップ。
  3. 室温で5分間、0.1 N NaOHを200μlのマイクロウェルを扱う。
  4. 吸引した空気は、30分間のマイクロウェルを乾燥させる。
  5. ヒュームフード中で室温で10分間、3-アミノプロピルトリメトキシシランの50μlのマイクロウェルを扱う。この化学物質は、プラスチックと反応する。皿のプラスチックとの接触を回避することが、ガラスピペットを使用して、完全にマイクロウェルに充填しない。
  6. 3-アミノプロピルトリメトキシが透明になるまで約10分間超純水でマイクロウェルを洗ってください。
  7. スクイーズボトルを使用して、二回、超純水でマイクロウェルをすすぐ。
  8. 超純水aの2ミリリットルでマイクロウェルを洗ってください10分間、中速（〜1Hz）で設定ロッカー上のt、室温。
  9. 吸引した空気は、30分間のマイクロウェルを乾燥させる。
  10. 30分間中速（〜1ヘルツ）に設定ロッカー上で室温で0.5％グルタルアルデヒド溶液2mlでマイクロウェルを扱う。
  11. 10分間程度の速度に設定したロッカー上で室温（〜1ヘルツ）での超純水2mlのマイクロウェルを洗ってください。 30分、合計2回以上繰り返します。
  12. 30分間急角度（60度以上）で乾燥マイクロウェル。
    注：料理はデシケーター中で2ヶ月間保存することができます。

浸潤突起アッセイのためのPaaSの調製

  1. ソフトPAA（8％アクリルアミドおよび0.05％BIS）、1mlの溶液は、40％アクリルアミド200μlの2％BIS25μlを、超純水（ 表1）の574μLを組み合わせる。
  2. ハードPAA（8％アクリルアミドおよび0.35％BIS）、1mlの溶液は、40％アクリルアミド、175＆＃200μlを組み合わせる181;リットルの2％のBIS、および超純水409μlを（ 表1）。
  3. 剛性PAA（12％アクリルアミドおよび0.60％BIS）を1mlの溶液は、40％アクリルアミド300μlの2％BIS300μlの超純水169μlを（ 表1）を結合する。
  4. 15分のためのソリューションを脱気。それぞれ、215、200を追加し、ソフト、ハード、そして剛性のPAA溶液への超純水で1 mg / mlのヒト血漿フィブロネクチンの230μL。全ての溶液は、10 mg / mlのアクリル酸N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）エステル1μlの、100 mg / mlの過硫酸アンモニウム5μlを、そしてN、N、N '、N'-テトラメチルエチレンジアミン（TEMEDの2μlを添加する; 表1）。穏やかにピペッティングして混合し、溶液中の泡を作成しない。

PAA
（1 ml）を		 40パーセント
単3
（μL） 		2％
BIS
（μL） 		超高純度の
水
（μL） 		1 mg / mlの
FN
（μL） 		10 mg / mlの
NHSエステル
（μL） 		100 mg / mlの
APS
（μL）
TEMED
（μL） 		エラスティック
率
（Pa）と
ソフト 200 25 574 200 1 5 2 1023
ハード 200 175 409 215 1 5 2 7307
リジッド 300 300 169 230 1 5 2 22692

表1：成分volumesのおよび浸潤突起アッセイに使用、ソフト、ハード、硬質PaaSのための弾性率を生じた。AA =アクリルアミド、FNは、フィブロネクチン、APSは=過硫酸アンモニウムを=。

  1. 各マイクロウェルの中心上のPAA溶液のピペット8.48μL。
    注：このボリュームは、理論的には厚さ75μmのPAAが得られます。
  2. 静かにピンセットを使用してマイクロウェル内の液滴上に12ミリメートルのカバースリップのフレームド側を下げる。
  3. 挟まれたPAA溶液は、15〜30分間重合することができるようにします。残りのソリューションをチェックすることによって重合を確認してください。
  4. 各ディッシュに1×PBSの2ミリリットルを追加し、ピンセットで12ミリメートルカバースリップを削除します。
    注：10×PBS、実験室で作られ、0.011 M KH 2 PO 4、1.54 M NaClおよび0.056 MのNa 2 HPO 4から構成されている。
  5. 5分間、室温で1×PBS 2mlのマイクロウェルを洗浄する。 15分、合計2回以上繰り返します。

3. Pトラクションフォースアッ​​セイのためのPaaSの賠償

  1. ソフトPAA（8％アクリルアミドおよび0.05％BIS）、1mlの溶液は、40％アクリルアミド200μlの2％BIS25μlを、超純水（ 表2）の566μLを組み合わせる。
  2. ハードPAA（8％アクリルアミドおよび0.35％BIS）、1mlの溶液は、40％アクリルアミド200μlの2％BIS175μlの超純水401μlの（ 表2）を組み合わせる。
  3. 剛性PAA（12％アクリルアミドおよび0.60％BIS）を1mlの溶液は、40％アクリルアミド300μlの2％BIS300μlの超純水161μlの（ 表2）を組み合わせる。
  4. 15分のためのソリューションを脱気。それぞれ、ソフト、ハード、硬質PAA溶液に1mg / mlのヒト血漿フィブロネクチンの200、215、および230を添加する。超音波処理30秒間200nmの赤色蛍光マイクロスフェア（605分の580の励起/発光）8μlの。各ソリューションでは、200nmの赤色蛍光マイクロスフェアの8μlを添加、10 mg / mlのアクリル酸NHSエステル、100 mg / mlの過硫酸アンモニウムの5μL、およびTEMED2μlの（ 表2）の1μL。穏やかにピペッティングして混合し、溶液中の泡を作成しない。

PAA
（1 ml）を		 40パーセント
単3
（μL） 		2％
BIS
（μL） 		超高純度の
水
（μL） 		1 mg / mlの
FN
（μL）
微小球
（μL） 		10 mg / mlの
NHSエステル
（μL） 		100 mg / mlの
APS
（μL）
TEMED
（μL） 		エラスティック
率
（Pa）と
ソフト 200 25 566 200 8 1 5 2 1023
ハード 200 175 401 215 8 1 5 2 7307
リジッド 300 300 161 230 8 1 5 2 22692

表2：成分量と牽引力アッセイで使用、ソフト、ハード、硬質PaaSのための弾性率を生じる AA =アクリルアミド、FNは、フィブロネクチン、APSは=過硫酸アンモニウムを=。

  1. 各マイクロウェルの中心上のPAA溶液のピペット8.48μL。
    注：このボリュームは、理論的には厚さ75μmのPAAが得られます。
  2. 静かに目のフレームド側を下げるピンセットを用いてマイクロウェル内の液滴の上の電子12ミリメートルのカバースリップ。
  3. 挟まれたPAA溶液は、15〜30分間重合することができるようにします。残りのソリューションをチェックすることによって重合を確認してください。
  4. 各ディッシュに1×PBSの2ミリリットルを追加し、ピンセットで12ミリメートルカバースリップを削除します。
  5. 5分間、室温で1×PBS 2mlのマイクロウェルを洗浄する。 15分、合計2回以上繰り返します。

浸潤突起アッセイのためのECMの4。準備

  1. 37℃にゼラチン溶液（1％ゼラチンおよび1％スクロース）を加熱する。
  2. 45°の角度でガラスボトムディッシュを保持している際にマイクロウェルの底から慎重に吸引した後、1分間のゼラチン溶液150μlとのPaaSを扱う。
  3. 60分間の乾燥を最適化するために急角度（60度以上）でマイクロウェル内のPaaS上のゼラチンの残りの薄い層を乾燥させます。
  4. 私に冷やした0.5％グルタルアルデヒド溶液2mlでマイクロウェルトリート30分間室温で、続いて15分間のce。
  5. 5分間1×PBS 2mlでマイクロウェルを洗ってください。 15分、合計2回以上繰り返します。
  6. 1分間の水素化ホウ素ナトリウム溶液2mlでマイクロウェルを扱う。ゆっくりとゼラチンの表面に形成する気泡を除去するためにベンチに料理をタップします。
  7. 吸引物を5分間1×PBS 2mlのマイクロウェルを洗浄。 15分、合計2回以上繰り返します。
  8. 15分間4℃で175000×gで1×PBSおよび遠心機を50μg/ mlでのFITC標識ヒト血漿フィブロネクチン溶液を希釈。市販のラベルフィブロネクチンを購入するか、次のようにラベルのいずれか：
    1. 透析チューブ中のホウ酸緩衝液（170 mMのメタホウ酸ナトリウム四水和物および40mMのNaCl）に置き、10mlのフィブロネクチン5mgを溶解する。
    2. マグネチックスターラー上に室温で溶解したFITCの6 mg含有ホウ酸塩緩衝液200ml中にチューブを配置することによって、フィブロネクチンをラベル付け暗闇の中で1.5時間の最安設定のまま。
    3. 2つのボリュームで暗い低温室（4℃）で3日間最低の設定に設定された磁性攪拌器で1×PBS 500mlで透析すると、一日を変更します。
    4. 200回2 / 1.4倍に希釈係数（占める- [（0.36 xのOD 493）OD 280]として280 nmおよび493 nmで：希釈のアリコート（200 1）の光学密度に基づいて、FITC標識されたフィブロネクチンの濃度を計算するmg / mlの単位で生じる）、次のステップで、フィブロネクチンを濃縮グリセロール。
    5. 一晩4℃で暗所低温室で最も低い設定に設定された磁性攪拌器上で50％グリセロール溶液中で一晩透析する。）
  9. 暗闇の中で60分間室温でFITC標識フィブロネクチン溶液を150μlのマイクロウェルを扱う。
  10. でガラスボトムディッシュを保持している際に慎重にマイクロウェルの底部からのFITC標識フィブロネクチンソリューションを吸引45°の角度、次に、滅菌のために暗い細胞培養フード中で室温で10分間、70％エタノール溶液でガラスボトムディッシュを埋める。また、ガラスボトムディッシュの蓋を埋めるか、70％エタノールに浸し、低リントワイプできれいに拭いてください。
  11. 5分間1×PBSでそれらを充填することによりガラスボトム皿を洗う。 15分の合計1×2mlのPBSでさらに2回繰り返す。

5.浸潤突起アッセイの作製とイメージング

  1. （1：DMEM、5％低タンパク質血清、10％ウシ胎児血清、及び新たに追加された上皮成長因子の20 ng / mlを含むRPMI 1640 1）ガラスボトムディッシュへと浸潤突起培地2mlで25000癌細胞を追加一晩インキュベートする。
  2. 吸引し、細胞を固定するために20分間、暗所で室温で3.7％パラホルムアルデヒド溶液2mlのマイクロウェルを治療する。
  3. 1×PBS 2mlの二つ素早く洗浄した後、室温テン0.1％トリトンX-100溶液2mlをマイクロウェルを治療細胞を透過するために5分間暗闇でrature。
  4. 1×2mlのPBSで1迅速な洗浄後、細胞をブロックするための60分間、暗所で室温にてブロッキング溶液、3％ウシ血清アルブミンでマイクロウェルを扱う。
  5. 60分、暗所で室温でブロッキング溶液で：マウス抗コータクチン抗体（750 1）の150μlのマイクロウェルをインキュベートする。
  6. 5分間の1×PBS 2mlでマイクロウェルを洗ってください。 15分、合計2回以上繰り返します。
  7. （1：500）と546ファロイジン（1：750）で60分間、暗所で室温でブロッキング溶液中でヤギの150μlの抗マウス633抗体とマイクロウェルをインキュベートします。
  8. 5分間の1×PBS 2mlでマイクロウェルを洗ってください。 15分、合計2回以上繰り返します。
  9. 各マイクロウェルを記入し、22×22カバーガラスでカバーするためにメディアをマウントする6滴を追加します。
  10. 画像コルタクチンとアクチン647分の632の励起および発光フィルターを使用して、浸潤突起を同定するため、および570分の556ナノメートル、それぞれ、広視野倒立顕微鏡上に高NA、40倍油浸レンズを使用。同様に、画像フィブロネクチン518分の492 nmでの励起および発光フィルターを使用して、ECM分解を識別する。

6.トラクションフォースアッ​​セイの作製とイメージング

  1. ガラスボトムディッシュに浸潤突起培地2mlで15000癌細胞を追加し、一晩インキュベートする。
  2. ガラスボトムディッシュで培地を吸引し、事前に同じサプリメント（5％低タンパク質血清、10％ウシ胎児血清、及び新たに追加された上皮成長因子の20 ng / ml）を用いて、L-15培地2mlと交換37℃に-warmed。
  3. 1時間高湿度で37℃に予め平衡化倒立顕微鏡に環境室にガラスボトムディッシュをインキュベートする。
  4. 細胞の位置をマークするために自動化された段階で、広視野倒立顕微鏡上に高NA、40倍レンズを使用して画像4セットを取る。
    1. に上の画像セル位相コントラスト（「位相」の画像）を用いてのPaaSにおけるp。
    2. のPaaSの上部にある微小球の第一の層は（画像」を強調した」）焦点になるまで細胞の下でわずかに着目し、645分の560の励起および発光フィルターを用いた画像の蛍光マイクロスフェア。
    3. また、（マーカーとして微小球を使用して）のPaaSの底に焦点を当て、画像（「底部」の画像）を取る。注：このイメージの目的は、代表的な結果で説明したように牽引力の計算に各位置での実際のPAAの厚さを得るためにz位置を記録することである。
    4. これらの画像は、複数の位置で取得された後、穏やかに細胞を除去し、10％のTriton-X溶液を220μlのミックス。前述した（「ヌル」の画像）などの各位置でのPaaSの一番上にある画像のマイクロスフェア。

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結果

浸潤突起アッセイにおいて、浸潤突起は、典型的には、セル本体内の点状構造におけるアクチンおよびコルタクチン（ 図1）のようなマーカーの共局在化によって同定される。両方積極的に低下させると、非分解性浸潤突起をカウントすることができ、これらの構造は、FITC標識フィブロネクチン（ 図1）における蛍光シグナルを欠く黒い領域と共局在しているかどうかによって区別される。浸潤突起を手動でカウントし、細胞当たりのECMの分解は、手動でのセルの輪郭内でこれらの黒い領域を閾値処理で決定される。

牽引力アッセイでは、4つの画像は、ステージ位置（ 図2）によって示された各細胞の位置で捕捉される。まず、「位相」と画像が目的の細胞のすべてを取られる」と強調し」。 PAAの「底部」画像は、ヒドロゲルの厚さを計算するために、それぞれの位置で取られる。トンを除去した後彼の細胞は、「ヌル」画像はマークされたステージ位置で取られている。 PAASの変形を「強調」および「ヌル」の画像間の微小球の位置の変化に基づいて計算さ...

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ディスカッション

我々は、浸潤性および収縮性細胞の挙動を相関浸潤突起と牽引力アッセイのための基礎として使用することができるPaaSの製造方法を提供する。 PaaSは、長い細胞に対する剛性の影響を見て、牽引力18,24,27を計算するために使用されてきたが、このプロトコルは、マトリックスに応じて、侵襲および収縮細胞の挙動を相関させるために同じ剛性を有するのPaaSに基づく並列アッセイを開発する最初のものである機械的性質。適切にガラスボトムディッシュのカバースリップをアクティブにするのPaaSがそれらに結合して、外れないことが保証されます。我々は、他の過去4,12,28でのPaaSの表面にゼラチンを結合するためにそのようなスルホSANPAH及びアクリル酸NHSエステルなどの試薬 ​​に依存してきたが、我々は、これらの方法はフィブロネクチンの確実に均一な表面層を生成しないことを見出した。行わしたがって、フィブロネクチン、アクリル酸NHSエステルを使用して埋め込まれ、PaaSの全体に架橋した他のグループ29,30による。しかし、フィブロネクチンの濃度の増加は、ソフト、ハード、硬質のPaaS

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開示事項

この作品は賞数K25CA143412（Parekhの）の下で国立衛生研究所の国立癌研究所によってサポートされていました。私たちは、追加のサポートが耳鼻咽喉科の部門によって提供されたことを感謝したい。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。

謝辞

著者らは、開示することは何もない。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
3-アミノプロピルトリメトキシシランSigma-Aldrich281778
アクリルアミド (40%)Bio-Rad161-0140
アクリル酸 NHS エステルSigma-AldrichA8060ムフード 10 mg/ml で DMSO
Alexa Fluor 546 phalloidinLife TechnologiesA22283ダミン
過硫酸アンモニウムBio-Rad161-07001x PBS
Aqua Poly/MountPolysciences186066 滴を使用してマイクロウェルを充填します
BIS (2%)Bio-Rad161-0142
ウシ血清アルブミンRPIA300751x PBS で溶液をブロックするために 3% を作り、4 °C で保存します。C
カバースリップ (12 mm)フィッシャーサイエンティフィ12-545-80
透析チューブSigma-AldrichD9777ホウ酸緩衝液中で 15 - 30
分間 DMEMCellgro10-013-CV使用して invadopodia 中
DMSOSigma-AldrichD8418アクリル酸 NHS エステル溶液
上皮成長因子寿命浸潤性
タノールPHARMCO-AAPERE200超純水で70%
FBSPHG0311 Thermo ScientificSH30070.03浸潤性培地
FITCシグマ-アルドリッチF7250光から保護する
ゼラチンポリサイエンス00639通常、PBSで10 mlの1%スクロース/ 1%ゼラチン溶液を作り、4°Cで保存します。C(ゼラチンを容易に溶解するためにPBSを予熱する)
ガラス底皿(35 mmカバースリップ)MatTekP35G-0-14-Cカバースリップはコーティングされていない
グルタルアルデヒド(25%)Polysciences019091x PBSで希釈して0.5%
ヤギ抗マウスアレクサフロー633抗体ライフテクノロジーA21050
ヒト血漿フィブロネクチンライフテクノロジー33016-0155 mlの超純水を加えて1 mg / mlにします。過度の凍結および解凍のサイクルを避けるための使用に基づくボリュームのアリコート
KH2PO4EMD MilliporePX-1565-110x PBSストックを作るために使用
マウス抗コルタクチン4F11抗体EMD Millipore05-180
Na2HPO4EMD MilliporeSX-0720-110x PBSストックを作るために使用
NaClRPIS23020、10x PBSストックとホウ酸緩衝NaOH
(1 N)Sigma-AldrichS2770超純水で希釈して0.1 N
Nu-Serum(低タンパク質血清)BD Biosciences355500浸潤足中
パラホルムアルデヒドAcros416785000通常、1x PBSで10%のストックを作成し、ヒュームフードで準備し、パラホルムアルデヒドを簡単に溶解するために数mlの強力なNaOHを追加し、その後、強力なHCl)
PBS(滅菌)Cellgro21-040-CV細胞培養
RPMI 1640Cellgro10-040-CVを使用して、invadopodia培地を作るために
化ホウ素ナトリウムSigma-Aldrich4528821x PBSでヒュームフード1mg / mlで新鮮なものを準備し
メタホウ酸ナトリウム四水和物Sigma-AldrichS0251を使用してホウ酸緩衝液
スクローRPIS24060、通常、PBSで10mlの1%スクロース/ 1%ゼラチン溶液を作り、4°Cで保存します。C (PBS を予熱してゼラチンを容易に溶解する)
TEMEDBio-Rad161-0800
Triton X-100Alfa AesarA16046、1x PBS に 10% のストックを作り、牽引力アッセイで細胞除去にそのまま使用するか、1x PBS で希釈して染色します
フュー で新たに調製 ロー で新鮮な 10% 溶液を調製し、ック 培地エをに希釈するための技術をために使用する をはをを作るために使用し、を作ります水素ますスを作るために は

参考文献

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