方法論記事

における化学遺伝の相互作用の迅速な同定

9.9K 閲覧数

⸱

DOI：

10.3791/52345

⸱

2015年4月5日

 , 
1Department of Biochemistry and Microbiology, University of Victoria

この記事について

サマリー

ここでは、出芽酵母における化学遺伝学的相互作用を定義するための費用対効果の高い方法を提示します。このアプローチは、酵母分子生物学の基本的な技術に基づいて構築されており、化学物質の小規模から中規模のコレクションやその他の培地環境の機構的調査に適しています。

要約

出芽酵母は、生物活性化学物質の作用機序を学術、製薬、幅広い、および産業科学者に興味がある。決定、または出芽酵母、〜6000の遺伝子の欠失変異体と低形質必須遺伝子のための完全なコレクションのモデル真核生物である変異体は、市販されている。変異体のこれらのコレクションは、系統的に化学物質を許容するために必要な化学-遺伝子の相互作用、 すなわち遺伝子を検出するために用いることができる。この情報は、順番に、化合物の作用の可能性が高いモードに報告します。ここでは、出芽酵母における化学遺伝的相互作用の迅速な同定のためのプロトコルについて説明します。我々は、アクションの明確に定義された機構を有する化学療法剤5-フルオロウラシル（5-FU）を用いた方法を実証する。我々の結果は、核TRAMPのRNAエキソソームおよびDNA修復酵素は、以前メートルと一致する5-FUの存在下で増殖のために必要とされることを示すベースのバーコード化学遺伝学的アプローチおよび5-FUに悪影響RNA及びDNA代謝に影響を与えることを知ってicroarray。これらのハイスループットスクリーニングの必要な検証プロトコルも記載されている。

概要

遺伝的ツールとモデル生物出芽酵母で利用可能なリソースを一括遺伝子がネットワークは、生物学的システムの要件を満たすためにとして機能する方法に新たな洞察を提供し、大規模なゲノム機能研究を可能にした。これらのツールの礎石は、酵母1,2内のすべてのオープンリーディングフレームの非必須遺伝子欠失の完全なセットの共同制作だった。顕著な観察は、標準的な実験室条件下​​で半数体として増殖させた場合の酵母遺伝子のわずか〜20％が生存に必要とされることであった。これは別の生物学的経路を利用して、ゲノムの摂動に対する緩衝する細胞の能力を強調しています。組み合わせて個別に実行可能な、しかし、致死的に接続または収束並列生物学的経路のシグナル及び生物学的機能を説明する遺伝的相互作用のネットワークを形成する遺伝的変異体。条件付きテの発展に伴い必須遺伝子のmperatureに敏感と低次形態対立遺伝子技術は、非必須遺伝子3,4の研究に限定されていません。この概念は、類似の細胞プロセスに関与する遺伝子が5が一緒にクラスタ化方法を説明するための公平な遺伝的相互作用マップを生成するゲノム規模で適用されている。

遺伝子ネットワークの化学摂動模倣遺伝子欠失（ 図1）6。過敏症の削除株の高密度アレイに対して増殖抑制化合物を問い合せると、化学的ストレスに耐えるために必要とされる遺伝子のリスト、つまり 、化学遺伝的相互作用プロファイルを識別します。遺伝的相互作用と同様に、化学ライブラリーの大規模スクリーニングは、一緒に行動クラスタの類似した様式を有する化合物7が示されている。したがって、化合物の化学遺伝的相互作用のプロファイルを確立することによって、作用機序は、LARと比較することによって推測することができるGE-規模合成遺伝的および化学的な遺伝的相互作用のデータセット8,9。

化合物のスコアは、尋問されている大規模な化学遺伝学的スクリーニングでは、バーコードの競合アッセイにより行われてきた。この手法では、欠損株のプールされたコレクションは、化学物質を含有する培地の少量の数世代にわたって一斉に成長させる。各欠失変異体は、固有の遺伝的バーコードを保有するので、欠失株のプール内の個々の突然変異体の生存/増殖は、マイクロアレイまたは高スループット配列10によって追跡される。

生物活性化合物を含む固体寒天上で増殖させた物理的に配列された変異体のコロニーの大きさを監視することにより、適合度を推定することは、化学遺伝的相互作用11,12を識別するための有効な方法である。このアプローチは、競合ベースのスクリーニングの費用対効果の高い代替物を提供し、化学物質の小さなライブラリーをアッセイするために適している。ここで概説S.における化学遺伝的相互作用のリストを生成するための簡単な方法論である分子生物学操作またはインフラストラクチャに依存しない。セレビシエ。のみ酵母削除コレクション、ロボットまたは手動のピン止め装置、及び自由に利用できる画像解析ソフトウェアを必要とする。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

注：この手順の一般的なワークフローを図2に概説されている。

成長阻害用量の1の決定

  1. 酵母一晩培養の調製
    注：このプロトコルで使用される酵母エキス-ペプトン-デキストロース増殖培地（YEPD）は、標準的なレシピ13である。
    1. BY4741（ のMATa HIS3Δ1leu2Δ0met15Δ0ura3Δ0）YEPD寒天プレート上の細胞外ストリークし、30℃で、可視コロニーが形成されるまで、48時間インキュベートする。
    2. 単一コロニーを滅菌した培養容器にYEPD液体培地の5ミリリットルを接種することによって、一晩培養を準備します。連続回転または振とうしながら30℃で一晩インキュベートする。文化は一般的に（〜2×10 8細胞/ ml）朝までに飽和状態に達するだろう。
  2. 様々な化学物質の投与量を含有する固体寒天培地調製
    1. のいくつかの株式を準備化学物質は、適当な溶媒中で100×所望の最終濃度で試験する。
      注：効果的な濃度は、化学に依存し、経験的に決定されなければならない。当初は幅広い最終濃度範囲をテストすることをお勧めします。 すなわち 、低μMからハイmMまで。
    2. 化学物質の各濃度について、いくつかの滅菌培養チューブにアリコート溶融YEPD寒天を3mlを、試験される。 55℃の水浴中で場所が固化維持する。
    3. 試験対象の化学物質の各濃度について12ウェルプレート内の重複ウェルのそれぞれペアに溶融メディア、渦に混合する2-3秒、およびピペット1ミリリットルを100倍化合物の30μlを添加する。唯一の制御車両を含めるようにしてください。プレートを室温で一晩に設定できるようにします。余分なメディアを捨てる。
  3. スプレッドプレーティング細胞
    1. ステップ1のように一晩増殖させ飽和酵母培養の2μL、とYEPD液体培地の10ミリリットルを接種する。1.2。
    2. プレートウェルあたり希釈された酵母培養液25μl、滅菌ガラスビーズやロッドを使用して均一に広げ、そしてプレートが炎の下で乾燥させる。 48時間、30℃でプレートをインキュベート。
    3. プレート上での酵母の増殖（コロニーの両方の合計数と大きさ）を評価する。画面を実行するために10％以上の-15％の成長を阻害しない化合物の亜致死濃度を選択する。

2.体系的化学遺伝画面

  1. ソースプレートの欠失変異体アレイのメンテナンス（DMA）と準備
    1. グリセロールストックから欠失変異体アレイを構築する上で詳細な説明についてはBaryshnikova ら 14を参照してください。欠失変異体は、プレートあたり384コロニーの密度で配列された後、DMAは4​​℃で数ヶ月間保存することができる。それぞれに成長するコロニーを防止するためにG418、必要に応じて200μgの/ mlを含むYEPD寒天上に複製するその他。
      注：複数のシリアル複製が遅い成長株の損失を防止し、サプレッサー変異株の出現を最小限にするために避けるべきである。半数体としてのコレクションを維持する場合、これは特に関連する。
    2. ロボットシステムを配列の微生物を使用して、すべてのレプリカプレーティングの手順を実行します。また、手動のピン止めツールを使用して配列されたコロニーを操作します。
      注：酵母の削除コレクションは、いくつかの商業的供給源から半数体と二倍体として利用可能で、通常は96ウェルプレートにグリセロールストックとして出荷されています。
  2. 欠失変異体の配列を凝縮
    1. G418200μgの/ mlを含むYEPD寒天培地の250ミリリットルを準備します。 G418の有効濃度は変化してもよく、各ロットは、実験的にテストする必要があります。
    2. プレートあたりのG418を200μg/ mlを含むYEPD寒天の50ミリリットルを注ぐことにより、5 YEPD寒天プレートを準備します。配列を凝縮する前にこの一日を行い、プレートを室温で冷却することができるようにerature一夜平らな平らな面に。
      注：4つのプレートが1536 - ひずみ密度で収集に必要となる、第五のプレートが余分として注入する。
    3. プレート当たり384コロニーの密度で突然変異体の削除コレクションを含む16ペトリ皿を取り出し、室温（〜1時間）に来ることができます。
    4. 繊細なタスクが拭く使用して各プレートの蓋の上に形成されたすべての結露を拭いてください。これを怠ると、配列された変異体の配列と交差汚染の上に堆積されて水滴になることがあります。
    5. 微生物の配列ピン止めロボットを用いて、プレート当たり1536個のコロニー（4ペトリ皿）に、プレート当たり384コロニー（16ペトリ皿）の密度からDMAを凝縮。プレート1ピンから1 番目のコロニーが凝縮された配列の1列1行するように、これを実行し、プレート2の1 番目のコロニーは、1列2、2列1を行にプレート3の1 番目のコロニー行、とする行2のプレート4の1 番目のコロニーコラム2。
    6. 30℃で一晩連結配列をインキュベートする。
    7. ソースプレートからコロニーの均一な移動を確保するための配列を調べます。 DMAが正しく（ 図4A）凝縮されたために、ガイドとして役立つわざわざ配列に組み込まれ、いくつかの空白の位置が、あるでしょう。
      注：これらは、試験化合物を含有する培地上にレプリカプレーティングのソースプレートになる。単一ソースプレートは、複数のpinningsのために使用することができる。また、多くのロボットは、酵母の同じような数字が毎回転送されていることを確認します相殺機能を持ちます。
  3. レプリカプレート欠失変異体配列
    1. コントロールの700ミリリットル（車両のみ）、および実験的なメディア（化学系）の700ミリリットルを準備します。これは（条件あたり12のプレートに加え、2エクストラ）三連でアッセイを行うために十分である。
    2. プレート当たりの試験化学物質またはコントロールを含むYEPD寒天の50ミリリットルを注ぐ。プレートtを許可Oフラットさえ表面に室温で一晩冷やす。
    3. レプリカプレートにロボットを用いて、実験的に決定された濃度の化学物質を含有するプレートを3組、ならびにビヒクル対照を含有するプレートを3組にDMAを接種する。 24〜48時間室温でプレートをインキュベートする。

3.イメージングプレートとデータ解析

  1. インキュベーターからプレートを取り出し、それらを画像化の前に、室温（〜1時間）に来ることができます。これは、プレートを画像化しながら、結露を防ぐことができます。
  2. 蓋を取り外し、フラットベッドスキャナ上に表を下にして置くことにより24及び48時間での画像プレート。少なくとも300dpiの解像度で画像をキャプチャします。代替的に、画像をキャプチャするデジタルカメラを使用。そうする場合は、場所のプレートは、暗い背景に表向きにして画像に蓋を取り外します。
    注意：プレートのファイルフォーマットおよび位置決めを使用定量化プログラムに依存するであろう。
  3. Balony 15、SGAtools 16、及びScreenMill 17を含むいくつかのオープンソースプログラムのいずれかを使用してアレイコロニーの大きさの定量化と比較を行う。

画面の4。バリデーション

注：この段階では、いくつかの酵母の欠失変異体は、対象の化学物質への過敏として獲得します。これらの化学遺伝的相互作用は、次の二つの方法で検証する必要があります。最初の感受性株の同一性は、PCRによって確認されるべきである。第二に、化学物質過敏症は、独立して採点されなければならない。以下に概説ひずみ過敏症、酵母生物学における一般的な技術を検証するために、スポッティングアッセイを行うための簡単​​なプロトコルである。

  1. ストリークアウトのG418を200μg/ mlを含むYEPD寒天上に酵母削除コレクションから（過敏）変異体を希望する。コロニーが形成されるまで30℃でインキュベートする。に応じてプライマーを用いた診断PCRによって株の遺伝子型を確認してください製造業者のプロトコル。
  2. 各菌株のためのYEPD液体の5ミリリットルを接種し、回転または振とうしながら30℃で一晩インキュベートする。
  3. OD 600を測定し、無菌のdH 2 O中にOD 600 = 1に各菌株を希釈これらは現在、正規化された酵母培養物である。
  4. 96ウェルプレートのウェルA1に正規化された野生型酵母（BY4741）培養物100μlを分注する。井戸B1-H1に最大7つの追加の株を100μl分注する。
  5. A6-H6を通じて井戸A2-H2に無菌のdH 2 O90μlのを分配するためにマルチチャンネルピ ​​ペッターを使用してください。最後に、正規化された酵母培養物の1:10希釈系列を用意。シリアルにマルチチャンネルピ ​​ペッターで列2に列1の10μlのピペッティングして起動し、6の希釈が行われるまで、96ウェルプレート全体で継続する（ すなわち 、10 0〜10 -5）。
  6. マルチチャンネルを使用してグリッドに希釈した酵母培養の2-5μlの転送化学的および車両コントロールを含むYEPD固体培地上にピペッター。 24〜48時間のための適切な温度でプレートをインキュベートする。
  7. （BY4741対照と比較して）プレートを点検し、化学物質に選択した変異体の感度を比較する。ステップ3.2と24と48時間での画像プレート。
    注：関連遺伝子オントロジーまたは機能を有するいくつかの過敏株の同定は、スクリーンの有効性に自信を向いているが、遺伝子の野生型コピーを含有するプラスミドと過敏欠失菌株の形質転換は、正式にその遺伝子を確立するために必要とされる興味の削除は（第二部位変異を隠されていない）薬剤感受性の原因となる。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

このアプローチの妥当性確認として、我々は、上記で概説したプロトコル次の化学療法剤5-フルオロウラシル（5-FU）の代表的な化学遺伝的相互作用の画面を行った。 5-FUは、チミジル酸シンターゼ、ならびにDNAおよびRNA代謝18を破壊することが知られている。 5-FUの化学遺伝的相互作用は十分に研究されており、ヘテロ接合およびホモ接合性欠失コレクション8,19の両方を使用して、酵母バーコードマイクロアレイ技術によって研究されている。ここでは、同様の結果が突然変異コロニーの大きさの比較定量することにより得ることができることを示している。

それを行う画面が非必須半数体遺伝子欠失コレクションを利用していることに留意すべきである。このタイプのスクリーンはまた、必須遺伝子変異体を含むことを可能にする、二倍体株は、温度感受性突然変異体、および低次形態対立遺伝子を用いて行うことができる。半数体欠失コレクションを利用する一つの利点は、増加した薬物である小文字の区別もターゲット経路のityが、遺伝子産物の完全な不在を与え。しかし、二つの重要な欠点が必須遺伝子...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

ここで説明は、化学遺伝的相互作用のプロファイルを生成するためのアプローチである。この方法は単純で、化学物質の存在下および非存在下での総合的な遺伝子欠失コレクション内の各株のコロニーのサイズを比較することにより、化学的傷害を許容するために必要なすべての遺伝子が同定されている。感受性株の結果リストの注釈濃縮分析は、アクションの薬品モードへの洞察を提供するために使用することができる。このプロトコルは、出芽酵母用に最適化されているが、それはまた、例えば大腸菌のような他の配列された微生物の欠失コレクションで使用するために適合させることができる携帯摂動26,27の数百を調べるために成功裏に使用されてきた慶應義塾コレクションを、 大腸菌 。

酵母および他の生物における化学遺伝プロファイリングは、十分に確立されている。これらの研究の大部分は、マイクロアレイ分析またはハイスループットsequ介し欠失変異体をプールし、定量化する競合アッセイに依存してきたユニークな遺伝的バーコードのencing。このアプローチは、大規模な化学ライブラリーの堅牢な...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

CJNラボの研究はNSERC、カナダの癌協会研究所（CCSRI）、およびカナダの乳がん財団（BC-ユーコン支店）から操作する補助金によってサポートされています。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
酵母のエキスBioBasicG09611%の最終濃度(w / v)に加えます（w / v
）チルプトン粉末BDバイオサイエンス211820YEPD液体または固体媒体の場合、2）の最終濃度（w / v）
デキストロースAnachemia31096-380に追加しますYEPD液体/固体媒体の場合、最終濃度(w / v)を2%に加えてください—オートクレーブはしないでください。20%ストック溶液を調製し、ろ過滅菌し、オートクレーブ後に培地に加えます。
寒天 AバイオベーシックFB0010YEPD 固体培地用 最終濃度 2% (w/v)
G418A.G. Scientific Inc.G-1033200で1,000倍の在庫を用意 dH2O中のmg / mlおよびフィルター滅菌します。
12ウェルプレートGreiner Bio One655180
5 ml 培養チューブエバーグリーン サイエンティフィック222-2376-080
10 cm ペトリ皿VWR25384-302
ROTOR HDASinger Instruments ROT-001ハイスループット微生物アレイピン留めロボット
PLUSPLATE©ペトリ皿シンガーインストゥルメント PLU-001200皿入りボックス
384ショートピンRePadシンガーインストゥルメント RP-MP-3841,000パッドボックス
1536ショートピンRePadシンガーインストゥルメント RP-MP-1536Box of 1,000 pads
代替ピン留めツール:
全自動ロブティックシステムS&Pロボティクスhttp://www.sprobotics.comいくつかの自動化されたコロニー処理ロビティックおよび想像システムが利用可能です。
手動ピン留めツールV&P Scientifichttp://www.vp-scientific.comハンドヘルド・レプリケーション・ツールおよびアクセサリ。 
YEPDの液体/固体媒体のためのは

参考文献

  1. Giaever, G., et al. Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 418, 387-391 (2002).
  2. Winzeler, E. A., et al. Functional characterization of the S. cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis. Science. 285, 901-906 (1999).
  3. Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat Methods. 5, 711-718 (2008).
  4. Li, Z., et al. Systematic exploration of essential yeast gene function with temperature-sensitive mutants. Nat Biotechnol. 29, 361-367 (2011).
  5. Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327, 425-431 (2010).
  6. Parsons, A. B., et al. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
  7. Parsons, A. B., et al. Exploring the mode-of-action of bioactive compounds by chemical-genetic profiling in yeast. Cell. 126, 611-625 (2006).
  8. Hillenmeyer, M. E., et al. The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes. Science. 320, 362-365 (2008).
  9. Hillenmeyer, M. E., et al. Systematic analysis of genome-wide fitness data in yeast reveals novel gene function and drug action. Genome Biol. 11, R30(2010).
  10. Smith, A. M., et al. Competitive genomic screens of barcoded yeast libraries. J Vis Exp. (54), (2011).
  11. Bowie, D., Parvizi, P., Duncan, D., Nelson, C. J., Fyles, T. M. Chemical-genetic identification of the biochemical targets of polyalkyl guanidinium biocides. Organic & Biomolecular Chemistry. 11, 4359-4366 (2013).
  12. Alamgir, M., Erukova, V., Jessulat, M., Azizi, A., Golshani, A. Chemical-genetic profile analysis of five inhibitory compounds in yeast. BMC Chem Biol. 10 (6), (2010).
  13. Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. Cold Spring Harbor Laboratory. Methods In Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2005).
  14. Baryshnikova, A., et al. Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Methods Enzymol. 470, 145-179 (2010).
  15. Young, B. P., Loewen, C. J. Balony: a software package for analysis of data generated by synthetic genetic array experiments. BMC Bioinformatics. 14, 354(2013).
  16. Wagih, O., et al. SGAtools: one-stop analysis and visualization of array-based genetic interaction screens. Nucleic Acids Res. 41, W591-W596 (2013).
  17. Dittmar, J. C., Reid, R. J., Rothstein, R. ScreenMill: a freely available software suite for growth measurement, analysis and visualization of high-throughput screen data. BMC Bioinformatics. 11, 353(2010).
  18. Longley, D. B., Harkin, D. P., Johnston, P. G. 5-fluorouracil: mechanisms of action and clinical strategies. Nat Rev Cancer. 3, 330-338 (2003).
  19. Lum, P. Y., et al. Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes. Cell. 116, 121-137 (2004).
  20. Toussaint, M., Conconi, A. High-throughput and sensitive assay to measure yeast cell growth: a bench protocol for testing genotoxic agents. Nat Protoc. 1, 1922-1928 (2006).
  21. Robinson, M. D., Grigull, J., Mohammad, N., Hughes, T. R. FunSpec: a web-based cluster interpreter for yeast. BMC Bioinformatics. 3, 35(2002).
  22. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4, 44-57 (2009).
  23. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37, 1-13 (2009).
  24. Hong, E. L., et al. Gene Ontology annotations at SGD: new data sources and annotation methods. Nucleic Acids Res. 36, D577-D581 (2008).
  25. Fang, F., Hoskins, J., Butler, J. S. 5-fluorouracil enhances exosome-dependent accumulation of polyadenylated rRNAs. Mol Cell Biol. 24, 10766-10776 (2004).
  26. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol Syst Biol. 2, 0008(2006).
  27. Nichols, R. J., et al. Phenotypic landscape of a bacterial cell. Cell. 144, 143-156 (2011).
  28. Dai, J., et al. Probing nucleosome function: a highly versatile library of synthetic histone H3 and H4 mutants. Cell. 134, 1066-1078 (2008).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

関連記事