網膜タックと2部網膜上インプラント：ローカライズされた病理組織学的分析のための人工網膜を移植した処理の目のための技術

Summary

ここでは、金属製の網膜上鋲と人工網膜に直接隣接する眼組織を視覚化するための組織学的技術について説明します。

Abstract

特定の形態の失明の治療のための網膜プロテーゼは、現在市場に参入している商用デバイスとともに、世界中の臨床試験で注目を集めています。これらのデバイスの安全性を評価するためには、前臨床試験において、信頼性の高い技術が必要です。しかし、一部の網膜インプラントに使用されている硬質金属部品は、特に周囲の組織の繊細な性質を考慮すると、従来の組織学的プロセスに適合しません。ここでは、金属製の鋲で網膜上に固定された網膜インプラントに直接隣接する目の健康状態を評価するための技術について説明します。

網膜プロテーゼは、眼組織と接触する電極アレイを特徴としています。移植に最も一般的に使用される場所は、網膜上位置(眼の後房)であり、インプラントは眼のすべての層を貫通する金属鋲で網膜に固定されています。以前の方法では、従来の組織学的技術では金属物体を切断できないため、タックin situで近位眼組織を評価することができませんでした。その結果、タック挿入による局所的な損傷(存在する場合)を評価することは困難でした。

そこで、網膜鋲とインプラントの周りの組織を可視化する技術を開発しました。私たちは、人工内耳の周りの硬い骨組織の処理と視覚化に使用される確立された技術を、目の柔らかく繊細な組織のために変更しました。インプラントや網膜鋲などの固定眼組織をエポキシ樹脂に配向して埋め込み、サンプルの構造を安定させて保護しました。次に、埋め込まれたサンプルを粉砕、研磨、染色し、サンプル全体の深さを増やしてさまざまな倍率でイメージングしました。この技術により、金属鋲に隣接する眼組織の完全性と細胞構造の信頼性の高い評価が可能になりました。

Introduction

網膜色素変性症（RP）は、神経活動に、光子の形態では、光伝達を担う網膜の最外層中の細胞である光受容体の広範な喪失を引き起こす遺伝性疾患である。重要なことは、RP​​の患者は、一般的にはまだ機能している彼らの網膜の他の層の残留ニューロンを持っている。網膜補綴は、視経路^1,2を活性化するために電気刺激をこれらの生き残ったニューロンを標的とすることによって、これらの患者にいくつかの制限された視力を回復することが可能である。臨床試験の知覚の結果は初期の結果を約束して示されており、最近になって一部のデバイスは、商業的使用のために承認されている。 epiretinally ^3,4、網膜下に^5,6とsuprachoroidally ^7,8：現在、臨床網膜補綴物が配置されている中で、3つの主要な解剖学的位置があります。異なるデバイスは、異なる材料を利用し、そのフォームがカスタマイズされています彼らが移植されている場所へ。しかし、それらはすべて、電気パルスで網膜の残留ニューロンを活性化することによって、視覚的な知覚を作成します。

初期配置または後続の継続的な力の機械的効果に起因する周囲の組織損傷への医療用補綴物のための可能性がある。網膜補綴移植可能な刺激器の場合には、電気的パラメータが安全な範囲内であるべきである追加の考慮事項がある。デバイスは、厳密に臨床設定^9-15に進む前に、前臨床試験で試験されなければならないので、患者の安全性は、最も重要である。私たちのコンパニオンの記事では、脈絡膜上腔¹⁶内に配置インプラント周囲の目のローカライズされた組織病 ​​理を評価するための方法を説明した。本論文では、我々は、前臨床（feの中で、epiretinally網膜にタック電極アレイの周囲の眼組織を視覚化するための技術を説明ライン）モデル（ 図1）。

網膜上の位置は、視覚的な人工器官の位置を特定するための最も一般的に利用される位置である。ここに位置する電極アレイは、一般的に、目^17-20のすべての層を貫通する金属タックと網膜に固定されている。本論文に記載された技術の前に、正確にすぐにタックを取り囲む網膜および他の組織を評価することは困難であった。中性緩衝ホルマリンを使用して、標準的な眼の固定は、タックの固定点に対する網膜と強膜の差動移動による人為網膜損傷が生じた。したがってタックと網膜上の配列によって生じた実際の損害を正確に観察することができませんでした。金属物が容易に伝統的な組織学的装置で切断することができないように加えて、眼組織を区画すると、 その場での網膜のタックを用いて行うことができませんでした。組織学的処理の前にタックを除去することでもあったこれはまた、人為的な網膜損傷につながったとして望ましくない。

本研究の目的は二重であった：タック及び網膜上インプラントアレイによる損傷を確実に評価することができるように、1）網膜剥離アーチファクトを削減する。 2）それを除去せずにタックに隣接する網膜のアーキテクチャを可視化した。人為的な網膜剥離を減少させる、（関連記事¹⁶に記載されているように）目的1を達成するために、新たな固定技術を利用した。目的2を達成するために、我々は本来人工内耳電極^21〜23 のその場観察にために開発され、研削、および研磨技術、埋め込 ​​みを修正した。人工網膜の損傷を最小限にし、したがって、タックと網膜上の配列によって生じる潜在的な被害の正確な評価を可能にしながら、この原稿に記載された方法は、その場でタックへの周囲の網膜の視覚化と隣接することができます。

Protocol

注：すべての手順は、ロイヤルビクトリア朝の瞳と耳病院アニマルリサーチ＆倫理委員会によって承認された（RVEEH AEC;＃10-199AB）。被験者は、国民健康と（2013）と「動物虐待防止法」医学研究審議会の「ケアと科学的な目的のための動物の使用のための実践のオーストラリアの規範」に従って処理した（;および修正1986）。全ての外科的、臨床的評価および電気生理学的手順は、全身麻酔下で実施し、全ての努力が苦痛を最小限にするために行われた。

1.除核および固定

注：存在する場合、デバイスのケーブルまたは硝子体切除ポートの周りに余分な世話をして、コンパニオン原稿¹⁶で詳細に説明し摘出し、固定手順に従ってください。簡単に言えば、これは含む：

1. 経心冷たい中立ブフェ続い温かい生理食塩水で件名を灌流赤ホルマリン。
2. 目印として機能するように眼球に縫合糸を結ぶ。
3. デバイスのケーブルとすべての添付ファイルのパッチ/タブを維持し、目^16を脱核。
4. 36時間 - 18ダビッドソンのソリューションに目をポスト修正。
5. 8時間 - 6、50％エタノールに移します。
6. 解剖まで、70％エタノールと冷蔵（4℃）に移します。

2.電極の取り外しおよび解剖。

注：すべての網膜上のインプラントは、同一のフォームファクタを有することになるが、一般的に電極アレイと、柔軟で適合性担体材料のいくつかの形態が存在する。網膜に仮止めされたデバイスは、金属タックが一緒にこれらを維持し、配列と目のバックを貫通タック穴を備えています。

1. インプラントとは、網膜に固定されている点をの視覚化。
   1. 15度のブレードを使用すると、周トランス角膜切開を行い、EXPに角膜のキャップを外す根底にある虹彩とレンズOSE。
   2. 15度のブレードを用いて、網膜上インプラントと、その場で金属タックと房が露出、レンズの小帯線維をdisinsertとTOTOにレンズを取り外してください。
2. インプラントと研究が行われているに応じて、さらに解剖の前に余分な成分を取り除く。
   注：この例では、評価されて網膜上の配列はコンフォーマルシリコーンキャリア内に収容されたプロトタイプの気密性 ​​ダイヤモンド電極と電子回路パッケージから成る（社内で製造し^、20を参照）。
   1. ここでは、慎重にメスで細かい切開によってダイヤモンド電極パッケージを抽出します。網膜のタックと白金配線の残党（ 図2）と一緒に、インプラントのシリコーン体のままにしておきます。エンベデッドアレイ/ハウジングは、調査中のデバイス設計の一部ではない場合は、この手順（2.2）を省略する。
3. 慎重に所望の配向で粘着性および周囲組織を含むサンプルを分析。強膜、脈絡膜と網膜を含む眼の奥から、全層ストリップをカットする細かい解剖ハサミを使用してください。タックに隣接するすべての網膜層を示す、タックの長手方向の断面を与えるサンプルを取る（ 図2）
   注：サンプルのための所望の向きは、所望の特定の結果に応じて異なる場合があります。一つは光学ディスクにタック損傷の近接性を調べることを望む場合は、その後、光学ディスクは、サンプル内に含まれるべきである。

3.脱水、埋め込み、取り付け、研削、染色、およびイメージング

1. プログレッシブエタノール段階での3日間のサンプルを脱水：
   1. 回2時間、70％エタノール中でサンプルを脱水する。
   2. O / Nを2回2時間、80％エタノール中でサンプルを脱水し。
   3. 2時間、90％エタノールで試料を脱水TWICE。
   4. O / Nを2回2時間、100％エタノール中でサンプルを脱水し。
2. 回2時間で100％アセトンでサンプルを脱水。
   1. アセトンからサンプルを取り出し、室温でそれ空気が乾燥するように光学顕微鏡下でそれを観察する。エポキシにサンプルを移し、それが/崩壊をカールを開始する直前に（3.4ステップを参照してください）​​。
      注：崩壊した細胞収縮で軟組織の結果から液体を除去する。組織カーリング/崩壊が発生したときの感謝を経験して開発されている。
3. 製造者の指示に従って医療グレードのエポキシ樹脂を準備します。樹脂を硬化させ、室温で1時間または24時間のいずれか、55℃を用いる。気泡の除去のために約50ミリバール〜5分間の真空チャンバ内の場所。沸騰するエポキシ混合物が発生します過度の真空として手動で真空を調節し、脱ガスを効果的に発生しません
   注：ステップ3.2と同時にステップ3.3を実行します。
4. SAMPを埋め込むル明確なエポキシ樹脂中。適切な密閉可能な容器内に脱気したエポキシで眼組織を浸し、硬化させるために、室温でO / Nを残す。
5. サイズ変更や硬化エポキシブロックを再埋め込 ​​むことによって所望の向き（ 図2）でサンプルを埋め込 ​​むように注意してください。 （ - 図3A黄色カップ）タックの長軸は、金型の底部に平行に配向されるように、眼組織を含むリサイズブロック-埋め込 ​​む再。
6. シリコンカーバイド紙（; 図3C及び3E 800グリッドで始まる）を使用して- （手動研削、上の水と250回転230）研削試料ホルダーに樹脂をマウントし、サンプルを挽く。
7. 染色のために、3のためにトルイジンブルー染色で地面を浸し- 5分、または汚れが発達するまで（ 図3F）。
8. 水道水（ 図3G）で洗い流してください。
9. の細胞層を可視化するハイパワー解剖スコープを持つ画像標本の地面網膜（ 図3H）。エアエポキシ界面での回折を滑らかに試料上記エポキシの上面に蒸留水の液滴を適用する。サンプルを照らすために光ファイバ「グースネック」光源を使用してください。
10. （試料ホルダーの最小正確で再現研削増分は20μmである）ほど試料の予め設定された厚さを研削、毎回3.9 - 繰り返し3.6ステップ。

Results

固定プロトコールは、実質的に網膜¹⁶の人工剥離および層間剥離を減少させた。エポキシブロック内の試料の配向は、記載される二段階埋め込みプロセスを使用して一貫して達成した。増分研削手順は、最適な結果を達成するために、手先の器用さの適度なレベルを必要としますが、増分の分解能を細かく制御を提供し、調整可能試料ホルダーによって助けられた。全ての場合において、（n = 5）の粘着性が配置され、地面/望ましいと一貫性のある結果で研磨。鋲に隣接した網膜は解決可能であったし、適切に染色された。グレードP＃800の炭化ケイ素紙エポキシ樹脂ブロックの表面を研磨すると、埋め込まれた組織の細胞マクロ画像に十分であった。より高いグレードの紙、またはダイヤモンドスラリーは、必要に応じて、さらに、任意の所与の深さの表面を研磨するために使用することができる。解剖顕微鏡および光ファイバ「グースネック」ガーゼトンのソースは、接地ブロック及び包埋組織試料の表面を撮像するのに適していることが分かった。光源の位置は、顕微鏡で最高の照明およびコントラストを与えた位置と角度を見つけるために試行錯誤によって変化させた。ブロックの表面に蒸留水の液滴を加えてサンプルの上に、エポキシ空気界面での光路回折および/ ​​または滑らかな歪みを減少させるのに有用であった。 図4をチタン網膜に直接隣接して可視化網膜組織の画像例を示しているこの技術を用いてタック。非人工網膜剥離と折りたたみは、シリコーン（ 図4A）の両側に見ることができます。タックシャフトがシリコーンに埋め込まれて表示される。タックの頭は、網膜と強膜に浸透した。シリコン（ 図4C）の未染色網膜両側における非人為的な網膜剥離があります。技術はTHER、この例では、次のことを示しているeは、斜め挿入角度による片側網膜のタックおよび圧縮に隣接する網膜組織崩壊である。提示される画像は、単に技術の成功のイラストは、一般的には粘着性の損傷組織病理のではない代表的なものであることに注意してください。

網膜上電極アレイの図1の配置。後部強膜、脈絡膜と網膜の縮退拡大断面を示す、眼の（A）の模式図（光受容体を欠いている）。電極アレイは、網膜上電極アレイの青、epiretinally貼付。（B）コンピュータ支援、図面に描かれている。 、集積回路（「チップ」）および電極パッケージ。 B、​​チタン網膜タック。 cを医療グレードのシリコーンハウジングとD、リード出口点。パネルAは、オリジナルのillustratiから変更バイオニックビジョンオーストラリアの提供礼儀上、著作権ベスクローチェ。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2.電極の除去と、目の解剖。 その場での網膜上のタックと除核ネコの目の高ダイナミックレンジマクロ写真。（A）デビッドソンの固定液とポストの固定は、網膜アーキテクチャ¹⁶維持するために、除核の目を解剖した。電極アレイパッケージが、シリコーンキャリアから除去された残りのインプラントのタック（矢印）およびシリコーン本体と（破線の正方形の輪郭は、電極アレイの元の場所を示す）。（B）眼に隣接した長手方向断面を解剖しタック（破線）。タックは、強膜によって主に安定化されたアイカップ（矢印）の後壁に埋め込まれたままである。除去された電極アレイの下の網膜を含むセクションは、標準的な組織学的処理^16（左セグメント）のために調製したがタックを含む組織切片は、樹脂包埋研削（右セグメント）のために調製した。 0.5ミリメートル刻みで定規は各パネルの下端に表示されます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3.エポキシ埋め込 ​​みタック及び網膜組織の研削 、 エポキシ埋め込 ​​みと整列した組織サンプルの写真を、研削、染色および粘着性および網膜組織のイメージング（A）のtac k個のサンプルは、エポキシ樹脂ブロックに包埋した。金型を用いて、試料を長手方向の平面は、型の底部と平行になるように配向させた。研削（B）はタックサンプルを含む硬化エポキシブロック（C）エポキシブロック粉砕試料ホルダーに装着し、準備（D）試料を基本組織のように撮像されたセクションは、網膜細胞層とタックの長手方向軸を含む配向した。（E）試料をロータリーグラインダー上にシリコンカーバイド紙を用いて粉砕した。（F）の地面ブロックは、網膜層を識別するためにトルイジンブルーで染色した。（G）ブロックを、過剰染色を除去し、水道水でリンスした。（H）トルイジンブルーは網膜層を染色し、粘着性が高出力解剖スコープを使用して画像化した。

広告/ 52348 / 52348fig4highres.jpg "/>
図4.ハイとタックと網膜の低消費電力の画像。さまざまな点で研削加工画像中には、タックの縦断面を示す、解剖スコープで撮影した（アスタリスク）の目を貫通し、強膜を終了（ 'S' ）、シリコーン（ハッシュ）、トルイジンブルー染色し、染色されていない網膜（R ''）を隣接する。これらは単に本可視化技術を実証する例の画像であり、すべての網膜上インプラントまたはタック挿入組織学の結果の代表ではないことに注意してください。プラチナ配線のグランド残党（ 'W'）パネルADに表示されている。（A）低消費電力、網膜と強膜を貫通タックの非染色画像。網膜剥離の（B）ハイパワー画像と隣接する未染色網膜に折りたたみタックシャフトの中央の画像A.（C）低電力画像シリコーンキャリア。 C.（E）中のタックの中央の高パワー画像、無シリコーンキャリアと、タック柄の下のトルイジンブルー染色した網膜の高倍率画像は直前に示されている。タックシャフト（F）ノーマルトルイジンブルー染色した網膜のアーキテクチャを研削（GCL：網膜神経節細胞層、INL：内顆粒層、ONL：外顆粒層と、PR：光受容体; T：ネコタペート芝）は、同じ研削技術を用いて視覚化。各パネルのスケールバーは、以下のとおりです。AとC = 2ミリメートル。 BとD =500μmの。 E = 200程度。 F =100μmである。

Discussion

標準的な組織学的技術は、金属、ガラス、さらにはダイヤモンドブレードでこれらのオブジェクトを切削制限によるその場で硬い金属インプラントを処理することができません。我々の仲間紙¹⁶には、修正された全眼固定技術の使用は、人為的な網膜剥離を減少させることができることを示した。現在の原稿では、 その場で人工内耳の^21-23を可視化するための確立された研削·研磨技術は、網膜人工器官用に変更した。網膜に電極アレイを固定するために使用されるチタンタックは、epiretinally、周囲の眼組織と共にエポキシに包埋した。この樹脂ブロックは、次に、適切に配向され、次第に地面/金属タックにすぐ隣接する組織形態を明らかにするために研磨した。様々な深さでのブロックの研磨面の画像は、強力な解剖顕微鏡で撮影した。可視化とつの評価：このテクニックはするのに便利です網膜上インプラントに隣接する組織応答をる。移植片の移植に関連した外科的外傷を評価する。硬質の金属成分に対する生物学的反応を決定する。インプラントと網膜表面との間の距離を測定する。

この技術は、眼における網膜タックまたは他の硬質（ 例えば、金属製）のオブジェクトに隣接する領域のインサイチュ可視化のための将来の安全性試験に有用であろう。これはepiretinally網膜にタックプロテーゼの前臨床安全性を評価する直接的な適用を有する。また、網膜下の場所に位置してインプラントと接触している網膜の領域における組織の損傷を評価するために有用であり得る。

技術が正しく行われたことを確認するためにいくつかの方法がある。各段階で、網膜は、眼の外側の層に付着したまま必要があります。総人工網膜剥離がある場合、これはインド語あり固定に問題があることを食べた。サンプルが埋め込まれ、最終的な樹脂中に再配向される場合には網膜がブロックの研削面と直交に近くなるはずブロックする。これは、斜めのカットを最小限に抑えることができます。これは、（例えば網膜タックなど）オブジェクトを横断するのに必要な（既知のステップサイズの）増分研削ステップの数は、オブジェクトの寸法に応じて相関していることを確認することが有用である。

技術は、いくつかの方法で最適化することができる。研削プロセスに関連付けられたエポキシブロックの表面に傷が次第に細かいグレードの研磨を低減することができる。本研究のために、我々は、800 1000、1200、2400、4000グレードのシリコンカーバイド紙を使用した。ダイヤモンドペーストは、表面仕上げを改善するために使用することができる。微細な表面仕上げを高品質な画像が得られるが、追加の研磨時間を犠牲に。この技術の成果を改善するための別の重要な検討事項は、OPTIの選択と品質ですcsの、照明、画像キャプチャのために使用した。他の基本的な組織学的染色 - 特にニッスル染色は、トルイジンブルーの代わりに使用することができるが、さらなる最適化を必要とする場合がある。シミは、樹脂だけでなく、組織（ 例えば 、エオシン）、したがって、浅いポリッシュが背景変色を除去するための染色後に必要になることがありますを染色する。専門汚れ、蛍光色素および免疫組織化学的染色は行われませんでしたが、非常に特定の結果が望まれない限り、各研削レベルでこれらの汚れを実行するためにかなりの時間が必要である可能性が高い。しかし、埋め込 ​​みステップ（ステップ^3.4）24の前に、全体として組織を染色することが可能である。

この技術の主な制限は、したがって、それは、研削、研磨の各段階での倍率の多様で多くの（おそらく冗長）の画像をキャプチャすることが賢明である、関心領域が離れて粉砕された後、それを取得することができないことである。それはあるまた、それぞれの研削深さ調整のために小さな増分を使用することが重要。この技術の他の制限は、組織をスライドガラス上にマウントし、標準（透過）光学顕微鏡で観察と比較して光学倍率および解像度のものである。プロトタイピングおよび新規なインプラント装置の安全性を評価する目的のために、肉眼的病理評価が主要な関心である。この技術は、網膜のタックに関連付けられ、臨床的に関連する損傷を観察するための効率的な方法を提供する。練習では、グラインドを収集するために必要な時間は、与えられた試料（一度埋め込まれた）ポリッシュと写真、それはセクションにパラフィンブロックまたは凍結切片を取ると時間に匹敵する。

網膜インプラントの範囲外の用途に拡張することが、本技術の可能性もあります。この技術は、インプラント抽出feasibないハード·インプラントに隣接する組織を評価するのに適しているルまたはインタフェースを損傷する。例えば、この技術は、いくつかの深部脳または末梢神経電極、薬物送達のためのカニューレ、血管ステントのような従来の組織学的技術を用いて切断することができない金属（ 例えば 、白金、ニチノールなど ）から作られたインプラントを評価するために拡張することができるまたは整形外科人工器官。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
アセトン	化学供給	AA008	プロパノン BHD 医療グレード
Epo-Tek 301 エポキシ	エポキシ技術	パート A 1675-54-3 パート B 9046-10-0
エタノール 70-75% V/V	メルク PTY Ltd	4.10261	アルコール
エタノール	メルク PTY Ltd	90143	アルコール
トルイジン ブルー O	シグマ - アルドリッチ	T3260
エチレンジアミン四酢酸	Sigma-Aldrich
TegraPol 研削・研磨機	ストルアス	TegraPol-25
アキュストップ 試料ホルダー	ストルアス	アキュストップ
光学顕微鏡	ライカ	MZ16
対物レンズ	ライカ	2.0x プラナポ 対物
レンズ デジタル顕微鏡カメラ	ライカ	DFC-420C
顕微鏡ソフトウェア	ライカ	アプリケーションスイートv4.1.0