プロテオリポソー​​ムベースの流出アッセイのClの単一分子特性を決定する -チャネルとトランスポーター

サマリー

プロテオリポソームは、明確に定義された生化学的環境で再構成された精製チャネルとトランスポーターを研究するために使用されます。これらのタンパク質によって媒介される排出を測定するための実験的手順が示されています。プロテオリポソームを調製し、記録を行い、再構成されたタンパク質の機能特性を定量的に決定するためのデータを分析するための手順について説明します。

要約

過去15年間は、真核生物だけでなく原核生物からの膜タンパク質を過剰発現し精製する能力の爆発的な増加によって特徴づけられました。この増加は、主に膜タンパク質の構造情報を取得するための成功した推進によって推進されています。しかし、これらのタンパク質を機能的に調べる能力は、同じ速度で進歩しておらず、多くの場合、定量的価値が限られている定性的なアッセイに限定されているため、それらが提供できるメカニズムの洞察は限られています。再構成されたCl⁻チャネルまたはトランスポーターの輸送活性を定量的に調査するためのアッセイについて説明する。このアッセイは、K⁺イオノフォアバリノマイシンを添加して膜電位をシャントした後のプロテオリポソームからのCl^-の排出速度の測定に基づいています。イオン感受性電極を使用して、目的のタンパク質で再構成されたプロテオリポソームからのイオン流出の時間経過を追跡します。この方法は、再構成されたタンパク質の主要な特性(ユニタリー輸送速度、活性タンパク質の画分、機能ユニットの分子量など)を定量的に決定できるため、機構研究に非常に適しています。このアッセイは、再構成されたタンパク質を直接阻害/活性化する低分子化合物の効果を決定するため、および膜組成物または脂質修飾試薬の調節効果をテストするためにも利用できます。可能な場合、この方法を使用して得られた結果間の直接比較は、電気生理学的アプローチを使用して得られた結果と良好に一致することがわかりました。この手法は、CLC型H⁺/Cl^-交換体であるCLC-ec1をモデルシステムとして使用して説明されています。エフラックスアッセイは、任意のCl^伝導チャネル/トランスポーターの研究に利用でき、最小限の変更で、任意のイオン輸送タンパク質の研究に適合させることができます。

概要

最後の二つの過剰発現および膜輸送タンパク質を精製する能力が劇的に増加している数十年：イオンチャネル、プライマリとセカンダリのトランスポーターは、現在日常的に異種発現系、ならびに天然の供給源から精製される。これらのタンパク質の安定性を、発現をモニタリング改善し、抽出を容易にし、強化するための新しいアプローチが常に^1-5開発されている。これらの技術革新は、順番に、その機能の構造的な拠点の我々の理解を高め、膜タンパク質上の原子レベルの構造情報の爆発をトリガーに尽力している。対照的に、我々の能力は、いくつかの場合において、高分解能の構造情報をこのように定量的構造に基づいた予測をテストする我々の能力を制限する、定性機能的データが付随するように、同じ割合で増加しなかった精製されたタンパク質の機能的特性をプローブする。したがって、developmen定量的および一般化機能アッセイのtは膜タンパク質機能のメカニズムの基盤の解明に向けた重要なステップである。

チャネルおよびトランスポーター^-ここでは、定量的に精製され、再構成されたCl -の主要な機能的特性を決定するために用いることができる流出アッセイを記載する。アッセイの基礎となる原理は、輸送システムの様々な、ならびに非イオン輸送タンパク質に一般化することができる。チャネル/大型のClの存在下でのトランス^{- -}リポソームは、精製されたClで再構成する勾配（ 図1A、B）。のCl ^-の流出は、我々の場合K ⁺イオノフォアバリノマイシンに、対イオン流束を可能にするために、イオノフォアを添加することによって開始のClによって確立された電圧をシャントれている^-勾配及びKの平衡電位に初期の膜電位を設定する^{+ 6,7。}トンなしそれは膜電位の発生により阻止されるように流出が発生し、 ^-彼は有意な正味のClをイオノフォアん。 ^-流出、およびf _0、活性タンパク質を含有しないリポソームの割合τ、Cl -の時定数：データは、定量的に2測定可能なパラメータ（ 図1C）によって記載されている。 τおよびf ₀から一体のCl ^-輸送速度、活性タンパク質の画分と活性複合体の分子量は⁸導出することができる。既知の構造および機能の交換^-技術はCLC-EC1、よく特徴付けCLC型H ⁺ / Clで再構成されたプロテオリポソームを用いて、ここに示されている。このアッセイは、容易に又は活性電圧および/またはリガンドの存在に依存して異なるイオン選択性チャネルまたは輸送体に一般化される。さらに、このアッセイは、小分子は、直接再構成タンパク質に影響を与えるかどうかを決定するために用いることができるこれらの化合物の効果を定量する方法、および膜組成物又は脂質修飾試薬は、再構成されたチャネルおよび輸送体の機能に影響を与える。

プロトコル

1.脂質の準備

1. 透明なガラス管に所望量の脂質を分注し。 E.を使用してください大腸菌極性脂質抽出物が、ほとんどの脂質組成物を用いることができる。脂質は粉末形態である場合は、20 mg / mlの濃度のクロロホルムで再懸濁。すべての溶媒が蒸発するまでN ₂ガ ​​ス下、RTで脂質を乾燥させる。
2. ペンタン中の脂質を再懸濁し、クロロホルムの残り痕跡を除去するために再びガスN ₂の安定した流れを、それを乾燥させてください。乾燥した全ての溶媒が蒸発するまで。乾燥しながら脂質をチューブの底に三分の一をカバーする均一な膜に分布してではなく、一番下に密な塊を形成されるように、静かにチューブを回転させる。
3. 脂質を溶解する界面活性剤（300mMの塩化カリウム、50mMのクエン酸、25mMのK ₂ HPO _4、pH4.5で、35mMのCHAPS）を含有する再構成バッファを追加する。タンパク質がCHAPSにはあまり寛容である場合は、このステップのために他の中性洗剤を使用してください。
4. Resuspen水浴超音波処理を使用して明瞭に脂質をdは。短い（30秒-1分）一時停止（30秒-1分）短いパルスの最大電力で水超音波処理槽の中心にチューブを浸し。溶液は透明になるはず。
   注：達成明確化の最終的な程度は、使用される特定の脂質組成に依存します。この段階で、いくつかのバッチ間の変動があっても、名目上同一の脂質の中でも可能である。残留ヘイズは遠心分離により除去することができる懸濁液中の大きな粒子による光の散乱によるものである。
5. 20〜60分間、室温で再懸濁脂質をインキュベートする。

2.プロテオリポソー​​ムの形成

注：いくつかの戦略は、リポソーム内に界面活性剤で可溶化タンパク質を挿入するために使用することができる。 CLC-EC1のために透析がうまく機能し、そのために選択^6,9,10の方法です。

1. μgのOで表され、所望のタンパク質対脂質（P / L）比（に精製タンパク質を追加します。 Fタンパク質/ mg脂質）。 P / L比の選択は、実験の目的に依存する。
   1. 目標は、関心対象のタンパク質の活性を評価することである場合には、各リポソームは、タンパク質の複数のコピーが含まれるように、信号を最大化するために高いP / L'sで再構成する。各小胞は、平均1タンパク質に含まれるように、活性および/またはタンパク質の単一の輸送速度を定量化するために、低いP / L'sのポアソン希釈領域で再構成する。各政権をどのような場合に使用するのより深い分析のための手順7と議論を参照してください。
2. 様々なレジメンのための最適なP / L値を決定するには、タンパク質濃度^8,11-13の関数として活性の完全な滴定を行う。しかし、活性単位の分子量（MWは、kDaので表す）する任意のタンパク質について、以下のP / Lの値が初期guesstimatesとして使用することができる知られている。
   pgの "/>
   
3. 予め湿らせた透析チューブまたはカセットにタンパク質と脂質混合物をロードします。 500-1,000x脂質再構成バッファのボリュームを含むビーカーに透析装置を配置（ すなわち 、脂質の再懸濁の1ミリリットルのため1 Lバッファ）穏やかに撹拌しながら。
   1. > 3時間間隔で変更バッファ3〜4回。すべてのソリューションの変更では、蒸留水でカセット/チューブ、ビーカーを洗浄し、新鮮な再構成緩衝液でビーカーを埋める。溶液交換のための1-2のO / N間隔を含めます。ソリューションの変更の正確な数と期間は、使用される正確な脂質や洗剤に依存します。
4. 最後のステップが完了した後、-80℃で液体N ₂又は凍結で、透析容器からリポソームを除去するチューブでそれらをアリコートし、フラッシュ、それらを凍結する。

3.録音セットアップ

注： ^{- （}下記参照）電極、アナログとpH計記録のセットアップ（ 図2A）は、二つのチャンバー（平底シリンダー、〜3,4容）、Clから構成されていまたはデジタル電気出力、デジタイザ、および適切な取得ソフトウェアを備えたコンピュータ。

1. pH計の電極、コンピュータに接続されているデジタイザにpH計の出力^-はClを接続します。 1チャンバー内の参照電極と他の（ 図2B）で再コーディングワイヤーを配置します。
   注：ΔV _カルが正である（ステップ6.4および7.2参照）がワイヤの極性が正しい。
2. 記録チャンバー（ 図1B）で撹拌棒で撹拌プレート上室を置きます。撹拌棒が電極に接触していないことを確認してください。
3. 寒天橋（ 図2B）（100 mMのKClおよび2％アガロース）を使用してチャンバーを接続します。 100のKClに寒天ブリッジを保管してください。

のCl 4.準備^-電極

1. 古いものと-possibly-非機能pH電極を取る。完全に銀線を明らかにするためにガラスコーティングを破る。
2. 慎重に手術用メスの刃を使用して銀ワイヤからコーティングを除去。 H ₂ OおよびEtOH大量のを使用して、ワイヤを清掃してください。
3. ワイヤまでのFeCl _3（または漂白剤）の飽和溶液の代わりに塩化銀の均一な暗い被膜で覆われている。

単ラメラ小胞の5準備

1. 実験前の夜は、のために（攪拌しないでください）穏やかに振盪しながら外部バッファ（1のKCl、150mMのK ₂ SO _4、25mMのクエン酸、pH4.5）中の15ミリリットルでセファデックスG-50ビーズの1グラムを膨潤使用前に室温で少なくとも3時間。各実験は、膨潤したビーズの〜3ミリリットルが必要です。せいぜい数日、4℃で膨張したビーズにしてください。
2. リポソームは、室温で解凍している間、各列〜3メートルに注ぐ膨潤したG-50ビーズリットル。 RTで重力流によってそれらが乾燥してみましょう。これは通常、1〜2分かかります。
3. 0.4メートルテフロンカットオフを使用したミニ押出機を通してテオを11回押し出して単ラメラ小胞を準備します。
4. プラスチック製の丸底チューブ内の列を配置します。過剰な溶液を除去するためのカラムをスピン。臨床遠心機で1400×gで20〜30秒間遠心する。
5. フロースルーを捨て、13×100mmのガラス管内の場所の列と列に押し出された小胞の100μlを添加する。臨床遠心機で500×gで1分間コラムスピン。
6. ステップ6.5で記録チャンバーに追加され、フロースルーの〜200μlのを収集します。

6.流出測定

1. 記録チャンバーに置き参照2mlの100mMのKClを（接地）チャンバと外部バッファ1.8mlの（1のKCl、150mMのK ₂ SO _4、25mMのクエン酸、pH4.5中）。内部の間のわずかな浸透圧の不均衡と外部のソリューションは影響しません
2. 取得プログラムを起動します。これは数分かかることがあり、ベースラインが平衡化しましょう​​。
3. 信号が安定したベースラインを（リポソームは準備ができていると列を乾燥）に達すると、（ 図3A）の記録を開始。
4. システム（ 図2A）を校正するために10 mMのKCl溶液の15μlのを追加します。
5. リポソームを追加します。プロテオリポソーム（ 図3A）から^-小さなジャンプは、外部のClの除去が不完全に見えるかもしれません。ベースラインが安定するまで待ちます。
6. 流出（ 図3A）を開始するためにバリノマイシン（EtOH中で1mg / mlで1μl）を追加します。
7. 流出がそれプラトー（ 図3A）までの時間経過を実行してみましょう。
8. すべてのリポソーム（ 図3A）を溶解するために、外部緩衝液中で調製1.5 Mβオクチルグルコシド（β-OG）の40μlを添加する。録音を終了します。

7.データAnalysis

1. ASCIIまたはテキスト形式でのトレースファイルをエクスポートし、選択した解析プログラムにインポート。
2. 以下の点（ 図3A）の電圧を測定します。
   記録の開始時（V _0）。
   較正パルス（V _校正 ）を添加した後、
   リポソーム（V _リポ ）を添加した後、
   流出（V _フィン ）の終わりに、
   洗剤（V _totは ）を添加した後、
   ベースラインV ₀ = 0となるよう電圧。
3. の実験値を決定するために、ネルンスト - プランク方程式を使用して、 測定することにより、
   
   巻_カルは、実験開始時の室容積はでμL、1800での校正パルスのボリューム表現されている場合1; L、[Clで] _{CAL /中} Clである^-校正パルスのとMMと_ΔVCALで外部バッファの濃度は、校正パルス後に測定mV単位のジャンプです。
   注：αのこの経験的な決定は、3の目的があります。それは、システムが適切に応答していることを保証し、実験間の機器の応答の一貫性の尺度を提供していますだけでなく、間違いが解製作に行われなかったことを確認する。
4. 次のように各ステップの後のCl濃度を計算します。
   
   
   
   要因400分の3は、2000μlの最終容量に15μlの校正パルスの希釈から来ている。
5. 計算学会各ステップで[CL 'の変化、ΔCL _{リポ/フィン/ TOTを}食べました_。
6. とはCl（t）がV（t）を変換する
   
   直接の重要なポイントで 'CL値を決定し、内部統制などの計算値と比較します。
7. トレースを正規のCl _相対 ^リポ = 0とCl _REL ^TOT = 1となるよう
   
8. 次式に流出時間経過をフィット：
   
   実験的にはClを測定することによって決定される漏れ^{- -} Lは、Clの割合である場合、同じ条件及びτで製造したタンパク質を含まないリポソームからの流出は、プロセスの時定数である。
9. V、初期速度を計算します。
   
   ここΔCL _フィンはミリモルで発現され、Vはμlのチャンバの容積である。
10. 輸送速度/コンダクタンスを計算します
    
    pがP / Lであり、MWは、活性複合体の分子量は、kDaの中で発現され

結果

交換器、リポソーム中に再構成^-精製されたCLC-EC1、原核生物CLC型H ⁺ / CLにより媒介輸送^-私たちは、詳細かつ堅牢なのClを測定するためのプロトコルについて説明します。実験の概略図を図3に示されている精製されたCLC-EC1及び高い内部のClを含有する再構成されたプロテオリポソームは、 ^-低のClを含有する浴溶液に浸漬されている^{- 。}これらの条件の下で正味のCl ^-流出リポソーム（ 図3A）における正電荷の蓄積を防止する。流出（ 図3B） ^-バリノマイシンを添加すると、K ^+は、このように電位を分路およびCLを開始する膜を横切って移動することができます。フラックスの経時変化のClを使用して監視されている^-選択性電極およびClの総量^-小胞に含まれているが、直接洗剤を使用して可溶化することによって測定される。これ...

ディスカッション

精製された陰イオン選択的チャネルまたはリポソーム中に再構成トランスポーターによって媒介輸送^-私たちは、詳細はClを測定するためのプロトコルを記載している。交換CLC-EC1 ^-使用例は、原核生物のH ⁺ / CLだった。検討中のイオンに適したものでAgCl電極ただし、方法論は、容易にリガンド^12,13,15、電圧^11,12、またはAgを交換することによって、異なるアニオン選択^15,16をスポーツによってゲートチャンネルを研究するために適合させることができる。のCl以外のイオンのための選択性電極^{- 、}などのH ⁺としては、I ^-及びF ^{- 、}市販されている。

重要なステップとの仮定のいくつかの議論が続く。

ポアソン希釈仮定の限界

ユニタリ率（式7-9）の導出は...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
リポソーミケーター、Avanti Polar Lipids Inc.	アバンティポーラーリピッド株式会社	610200
IEC Centra CL2ベンチトップ	Thermo Scientific
Orion研究モデル701AデジタルpH-mVメートル			これらはEbayで見つけることができます。
機能しないpHプローブ			銀色のワイヤーが付いたpHメータープローブであれば、どれでも機能します。ガラス/プラスチックコーティングを取り外し、ワイヤーを清掃する必要があります。
DI-710 データロガー	DATAQ 機器
WinDAQ 取得ソフトウェア	DATAQ 機器
Pierce 使い捨てプラスチックカラム、重力流、2ml	ピアス (Thermo Scientific)	29922
KIMAX 培養チューブ、使い捨て、ホウケイ酸ガラス	Kimble Chase	73500-13100
押出機セット ホルダー/加熱ブロック	付きアバンティポーラーリピッド株式会社	610000
コンピュータ