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方法論記事

化学固定することによりX線蛍光イメージングのための接着細胞の準備

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DOI：

10.3791/52370

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2015年3月12日

 , 
1X-ray Science Division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory, 2Department of Physics and Astronomy, Northwestern University

この記事について

サマリー

ここでは、シンクロトロン蛍光X線を使用してサンプル中の金属の量と分布を決定する方法についてのプロトコルを提示します。接着細胞に着目し、この試料を調製するための化学固定法について述べる。次に、シンクロトロンX線を使用してサンプルをマウントし、イメージングする方法について説明します。

要約

蛍光X線イメージングは、大小のサンプル領域にわたって複数の元素の空間分布と濃度を同時に非破壊的に測定することを可能にします。これは、材料科学、地球科学、文化遺産の研究、化学生物学など、科学の多くの分野で適用されています。例えば、ケミカルバイオロジーの場合、細胞内の金属分布を可視化することで、細胞内に自然に存在する金属イオンだけでなく、薬物やナノ粒子などの外因的に導入された金属も研究することができます。ほぼすべての生体サンプルが完全に水和しているため、凍結固定とそれに続く極低温下でのイメージングは、現在利用可能な理想的なイメージングモダリティを表しています。しかし、そのような組み合わせが容易に入手できない、または実用的でない状況下では、アルデヒドベースの化学固定は依然として有用であり、時には避けられません。この記事では、X線蛍光イメージングのための化学固定による接着性哺乳動物細胞の調製について、可能な限り詳しく説明します。

概要

X線蛍光イメージングは​​、空間的に分解されるサンプル中に存在する元素の同一性および量の両方を可能にする。 、関心の重い元素の電子の結合エネルギーよりも大きいこと核1内殻電子の結合エネルギーを克服するために選択されたエネルギーの入射X線、。これは電子殻の「穴」を作成します。高エネルギー電子は、これらの孔に落下するように、蛍光X線は波長がそれらの軌道のエネルギー間隔に依存して放出される。軌道のエネルギー間隔は、与えられた要素の特性であるので、X線蛍光放射は、要素に依存する特徴的な波長を有する。これは、存在する元素の同定を可能にする特性波長におけるこの放出である。蛍光強度の較正要素の定量が存在することができます。

X線蛍光microscopY（XFM）は、フランスの日本におけるSPring-8のもの、欧州の放射線シンクロトロン施設（ESRF）のように、部分的に非常に鮮やかなX線シンクロトロン源の開発に、ますます利用になり、光量子ソース（い米国2でAPS）。これらのソースは、非常に高強度のX線ビームを提供する。同時に、このようなゾーンプレート技術としてX線光学系の改善は、かなり非効率的ではあるが3、サブミクロンのスポットにこれらのビームの集束を可能にした。非常に高強度のビームを、焦点を合わせることができる光の比較的少量が、現在利用可能な検出器技術を用いて測定することができる信号を生成する、細胞中の内因性金属を励起するのに十分である。このように、セル内の金属の化学生物学を研究することは、この技術の4-10における最近の進展の多くを利用し、特に1のアプリケーションです。

アプリながら検討すべき多くの重要な要因があります培養哺乳動物細胞または他の生物学的サンプルの元素分布と定量化を調査するXFMに横たわっ。まず、サンプルは有意義であると測定するために、構造的にも、その元素組成については、そのまま保持される必要がある。それは、集束X線ビームによって引き起こされる可能性が放射線損傷に丈夫であるように第二のサンプルはまた、いくつかの方法で保存されなければならない。サンプルを一度にこれらの基準の両方を満たすことができる一つの方法は、急速にガラス質、アモルファス氷11,12に凍結されるべきである。急速凍結は、多くの場合、プランジ凍結または13-16の凍結高圧のような種々の凍結保存技術を介して達成される。これは、一般的に凍結保存が可能な限り天然の状態に近い生体試料中の全体的な細胞構造や化学組成を保持することが認められている。 Wなどの細胞や組織への固定剤のゆっくりと選択的な浸透に起因する一方、化学的固定、膜透過性のその後の変化などのエル、従って17-19次善のこれらの要素の調査をレンダリングする、紛失したり、再配置、例えば、Cl、CaおよびKとして特に拡散イオンを浸出させるための種々の細胞のイオンを可能にすることができる。特に接着性の哺乳動物細胞のための一般的な化学固定、オーバークライオ固定の明らかな利点にもかかわらず、凍結保存は、様々な制限20-23を持っています。最も明らかな1ではなく、すべての研究室は、凍結保存機器に簡単にアクセスを持っていることである。現在のほとんどの高圧冷凍庫、あるいは冷凍庫を急落は、高価なだけ遠くに細胞が培養される場所からのものであってもよいクライオ施設のサブセットによって所有されている。凍結保存の利点は、細胞上に置か走行ストレスの欠点のために取引されている可能性があります。凍結保存は確実に蛍光X線分析用のサンプルを保存するための最も厳格な方法ですがこのように、それは確かに、すべての状況下で、すべての研究者に最もアクセスすることはできません。またそれは常に重要である - 興味のある金属がしっかりと固定可能な巨大分子に結合して、サンプルが画像化される解像度は、乾燥時に発生する可能性がある超微細構造へのダメージよりも大きいしている場合。警告24留意、化学固定、乾燥は、適切な選択である。

成功したX線蛍光イメージング実験における他の要因は、適切な分析を含む。 X線蛍光画像化は、基本的に空間分解能を提供するために、ラスタースキャンと組み合わせたX線蛍光発光分光法である。収集されたX線蛍光発光スペクトルは、発光ピーク、背景、及び入射ビームの弾性および非弾性散乱ピークの重複の組み合わせを含む。これらの貢献のデコンボリューション、及び発光ピークのフィッティングを可能にするソフトウェアは、このフィールド25に重大な開発であった。また、開発および商業DIST物質量に対する蛍光強度を相対的に較正するために使用される既知の組成の薄膜規格ributionも非常に重要であった。

このプロトコルは、化学固定し、空気乾燥による接着細胞の準備について説明します。このプロセスにおける重要なステップは、多くの場合、成功への特定のファッションのキーに優しいリンスを作り、うまく接着しないシリコン窒化窓に細胞の成長である。

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プロトコル

楽器、基質、文化メディアと皿の調製

  1. 窒化ケイ素（のSi 3 N 4）は、Windowsの取扱い。
    1. もう一方の手でカプセルのもう一方の端を回転させながら、少しウィンドウ自体を圧迫しないような方法でウィンドウを含む一方の端を絞ることによってカプセルを開きます。
    2. 逆のペアを確認して、実体顕微鏡下での先の細いピンセットは先端の接着剤、隙間や曲がりがないことを確認します。そうでない場合は、Windowsは、ピンセットにより破損またはその後の工程中にそれらの飛散することもできる。
    3. ウィンドウの端が出てくる必要がある広いカプセルになるように優しく方向に開放端加圧付近でカプセルを圧迫しながら、慎重にピンセットでウィンドウの枠をつかんでカプセルからウィンドウを削除します。
  2. 窓プレウォッシュ（オプション）。
    1. 穏やかにそれらを浸漬することにより、予備洗浄ウィンドウを所望の場合70％エタノール中で2分間洗浄し、100％エタノール中で2分間洗浄し、続いて5秒間蒸留水に。
  3. 貼り付けと培養皿上のウィンドウを殺菌する。
    1. ウィンドウを固定するためには、培養皿の底の平らな面を上にしてウィンドウを設定、清浄なガラススライド上にテープ片を置く。テープの長辺下4インチのストリップをオフ約カット。きれいなかみそりの刃で（「3/4」⅛で）の短辺からテープのスライスを取る。
    2. グリッドまたはウィンドウの端にテープのスライスを適用するためにピンセットを使用してください。しっかりと窓の開口部自体を覆うことなく、それを接着するために十分なを使用してください。ピンセットで接着テープの操作、培養皿の底にダウンウィンドウを設定。しっかりと培養皿の底にテープを接着するためにピンセットの先端を使用してください。
    3. 他のエッジに別のテープストリップを適用し、ピンセットの先でしっかりと底にこれを付着する。
    4. 一旦全ての窓があるテープ、紫外線（UV）照射で培養皿でWindowsを殺菌する。約1時間、層流フード内でUVランプ下で皿を置くことによってこれを達成する。
    5. Windowsはポリ - リジンでプレコーティングする場合（オプション）、ウィンドウ·滅菌後そう。 37℃のインキュベーター中で1時間のための無菌0.01％ポリ-L-リジン溶液10μlとコートのウィンドウをした後、培養培地に残った溶液を洗い流してください。
  4. XFMの前に最後の洗浄のためにバッファを準備します。
    1. トリスグルコースまたはピペラジンNのいずれかを準備し、N ' -ビス（エタンスルホン酸）（PIPES）、カルシウムおよびマグネシウムを含まないダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（D-PBS）のオスモル濃度およびpH同等の任意の微量金属を含まない緩衝液-スクロース。細胞は化学的に固定された後、細胞をリンスし、これらのバッファのいずれかを使用します。
      1. トリスグルコース溶液（10 mMトリス、260 mMグルコース、9 mMの酢酸、）を作るためには、トリス塩基の36 mgのグルコースを1.4g追加超純水20mlに酢酸16μlの。その後、超純水で30ミリリットルに、最終的な音量を調整します。 pH調整は必要ありません。 1週間まで室温で保管してください。
      2. 作るPIPES、スクロース（20mMのPIPES、200mMのスクロース）を超純水20mlにPIPES 0.18gのスクロースと2.0gを追加し、濃酢酸少量のpHを7.4に調整する。その後、超純水で30ミリリットルに、最終的な音量を調整します。 1週間まで室温で保管してください。
        注：最終すすぎにPBSを使用しないようにする理由は、PBS中のリン酸塩、塩化物、カリウムの濃度は、それが完全に空気乾燥する前に除去されていない場合、それはXFMを妨害できるように高いことである。
  5. 細胞プレーティングのためのバッファを準備します。
    1. 準備または正常O接着細胞を継代するために行われるであろうように、特定の付着細胞株の必要に応じて、そのようなRPMI培地1640などのすべてのメディアを、1×トリプシン-EDTA溶液、D-PBS、および任意の他の試薬を取り出すFの関心、そして37℃にそれらを温める。

細胞の2.メッキ

  1. 窓を含む滅菌した培養皿に、層流フード中で、穏やかな角度で傾け、それに培養皿の側面に沿って、メディア（100mm培養ディッシュ10 ml）を加える。不要な表面張力を作成または窒化ケイ素の窓の表面に直接メディアを落とさない。メディアが追加されると、徐々に被覆する傾斜角を媒体とグリッドウィンドウを和らげる。
  2. 細胞株を継代するためにいつものように、プレートのオフの細胞をトリプシン処理または掻き、適切に関心の付着性細胞株を準備します。新鮮なプレートに細胞を適用する前に必要なすべての細胞計数、または他の準備を行います。
  3. 典型的には24〜72時間以内に50％〜70％のコンフルエンスに到達するために必要とされる細胞密度で窓付きの培養皿に細胞を追加し、5％二酸化炭素を含む加湿インキュベーター中、37℃でインキュベートする。
  4. 所望の細胞密度（通常50％〜70％の集密度）が達成されるまで、倒立光学顕微鏡を使用して、時折、細胞の成長を観察する。

細胞の3。固定

  1. （サンプルに過剰のナトリウムを加えることを避けるために）購入した株式（例えば25％のパラホルムアルデヒド）を希釈し、酢酸でpHを7.4に調整することにより、D-PBS中で新鮮な4％パラホルムアルデヒドを準備します。
  2. 細胞は、必要に応じて成長してきた、と（例えばヘキストなどの）重要な汚れが適用され、画像化されてきた、片手で45°の角度でディッシュを傾け、穏やかな吸引によってメディアを削除し、他のと手のピペットで吸引した場合。
    注：代わりにペッティング過ごしたメディアの、代替案は、ウィンドウを拾う二回D-PBSでマイクロ遠心チューブにウィンドウを浸した後、PBS洗浄の2回に続いて20分間固定液ソリューションを新しい培養容器にそれを置くことです残留固定剤を除去することができる。これを選択すると、ディレクトリを移動ectly 3.5に移行する。
  3. D-PBSで優しく料理をすすぎ、皿の側に、45°の角度でピペット操作を一品を押しながら静かに新鮮な4％PFA / PBSを追加し、ゆっくりとできるように、傾斜角度を緩和することにより、すぐに除去された液体を交換固定液は、Windowsをカバーする。室温で20分間固定液で覆われた細胞を保管してください。
  4. 少し料理を傾け、手で吸引、上記のように、再び、穏やかな吸引によって液体を除去します。
  5. 優しくステップ3.3で説明した傾斜とピペット操作方法を使用して、パイプ/スクロース溶液の一部を追加することにより除去された液体を交換してください。
  6. 繰り返します3.4と3.5を繰り返します。
  7. 乾燥のための材料を準備します。
    1. そのようなキムワイプなどの糸くずの出ないタオルを収集し、それは非常に迅速かつ簡単に便利ですので、箱から1を引く。
    2. 乾燥するためにウィンドウを設定するには、きれいな、非レベルの場所を準備します。そうリッジを持つ電子顕微鏡に使用する種類のゴム製のグリッドマットを設定しますそれが乾燥しながら、ウィンドウは、一方の端部に支えことができる。これは、乾燥などの乾燥表面に立ち往生からウィンドウを維持し、サンプルの縁に残っているバッファを排出します。
  8. 慎重に液体の外にウィンドウを保持するためのウィンドウに接続されているテープをピンセットで抜く。彼らが浮遊し、その後、逆ピンセットでそれらを拾ってもらうことPIPES /スクロースの少量を適用することにより、テープの外れのウィンドウを取得します。
  9. 慎重に（ウィンドウ自体に触れることなく）、徹底的にキムワイプでウィンドウの端から余分なパイプ/ショ糖を塗りつける。また、キムワイプの丸い倍を使用して戻ってインデント領域を​​塗りつける。
    注：目標は、できるだけ窓の表面上の塩または緩衝剤のような小さな結晶を有することである。
  10. グリッドマットの上にウィンドウを配置します。ウィンドウがグリッドマットの上に平らに横たわったが、端に立てかけ（グリッドマットのリッジを使用して）、グリッドのわずかに触れていないことを確認してくださいできるだけマット。ウィンドウを乾燥してみましょう。

4.サンプル取付け·イメージング

  1. サンプルが乾燥した後、光学顕微鏡を使用したWindowsでの細胞の存在を確認します。シンクロトロンへの輸送のためのサンプルを準備する前に、この検証を行います。
  2. あなたの実験をホストしているシンクロトロンビームラインへの輸送のための窓をパッケージ化します。優しくその後、スライドガラスに両面テープを使用してWindowsを貼付プラスチックシャーレの底にテープでスライドガラスを貼付。ペトリ皿を閉じてテープで固定します。
    注：以前は、この時点まで、これらのステップは、任意の標準的な実験室で行うことができる。次の手順は、最高の放射光ビームラインで行われます。
  3. ピンセットでそっと窓からテープを外します。シンクロトロンでのビームラインの協力者が提供するアルミホルダーにWindowsを保護するために、ウィンドウの端に沿って薄い均一なコーティングで、マニキュアを使用してください。
  4. にアルミニウムホルダーを挿入しますキネマティックマウントした後、X線顕微鏡の位置にそれを配置します。ビームラインでの試料室の内部で、電動ステージに接続するブラケットのサンプルをマウントします。
  5. サンプルのX線顕微鏡計器エリア（鉛満たされた壁で作られておりません）を出た後、セットアップスキャン。ビデオ十字線とを備えたカメラを用いて試料上のX線ビームの位置を確認しながら、スキャンするサンプルの適切な領域を選択し、ビームライン固有のソフトウェアを使用して、プリアライメント下流シンチレータカメラで。
  6. 興味のある最小の特徴の大きさの推定値に基づいて、試料のための適切な解決を、選択してください。シングル、哺乳動物細胞（サイズは〜20〜40μm）を画像化するための、0.25〜0.5ミクロンの解像度を使用。組織の領域を画像化し、相互に細胞層を区別するために、2~20ミクロンの解像度を使用する。
  7. 満たさの量の推定値に基づいて、試料の適切な滞留時間を選択する存在する目的のアル。簡単な概要スキャンのために、または金属の高い量が存在する場合、ピクセルあたり30〜300ミリ秒の滞留時間でフライスキャンを使用。少ない材料が存在する場合、または、低い相対的存在の金属を測定するピクセルあたり1〜2秒の滞留時間でステップスキャンを使用します。
  8. ビームライン固有のソフトウェアにスキャンをするプログラム。ラスタスキャン画像を取得する。各要素の特性エネルギーのピークを同定するソフトウェアを使用してデータを分析するためにビームラインの協力者と一緒に作業します。

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結果

生物学的サンプルについての情報を提供するために、X線蛍光イメージングの能力は、これらのサンプルは、それらが実験の時間スケールでの放射線障害に対してロバストであるように準備され次第であり、しかもそれらの化学的および構造的特徴は周知である保存。固定は、細胞のこれらの側面に（ 図1）に保存されていることを示す-上述のように調製し、撮像されたサンプルの結果を表示するには、存在する元素にばらつきがあることを確認することが可能である。

逆に、このプロセスがうまくいかなかった、バッファが乾燥中に存在したままのサンプルでは代わりに見て、存在する分子からの大規模な結晶形成は、細胞に構造的な損傷を生成し、また（蛍光X線スペクトルの集合を妨害する図2）。

これらの画像は、ピクセル単位のフィッティングによって生成されます画像中の各点におけるX線蛍光スペクトル。これは、各画素において収集された各スペクトルは、個々に分析されていることを意味する。フィットデータから生成されたこ...

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ディスカッション

X線蛍光イメージングは、地球科学、材料科学、化学、生物学26-34を含む多くの分野において有用である。シンクロトロンX線の進歩、およびそれらの焦点は、非常に高強度のビームを生成した。フォーカスX線は、現在利用可能なシリコンドリフト検出器技術を用いて測定可能な信号を生成する、現在存在する細胞における内因性金属を励起するのに十分なビーム。そして細胞中の金属の化学的生物学を研究することは、この分野における最近の開発の多くを利用し、特に、一つのアプリケーションである。

それらは水和されているため、まだ、X線蛍光顕微鏡を用いて生物学的材料の研究はまた、他の材料に比べて特別な課題を提示する。放射線損傷を防止するために、理想的には、試料は、測定中にガラス質氷中で凍結される。しかし、化学的固定および空気乾燥が多く、初心者にアクセス可能で、かつ金属場合に適切であるかもしれない興味の不活性に固定可能な巨大分子に結合して、サンプルが画像化される解像度は、乾燥中に発生する可能性の超微細構造の損傷よりも大きいしている。

接着細胞...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

著者は、この論文で示されている代表的なデータの適合における彼の支援と有益な議論に対して、Stefan Vogtに感謝します。著者はまた、クリス・ジェイコブセンがQ.J.を支援してくれたことに感謝しています。

>jove_content<アルゴンヌ国立研究所における先進的光子源、ビームライン2-ID-Eおよび8-BM-Bの使用は、米国エネルギー省、科学局、基礎エネルギー科学局の支援を受け、契約番号の下で行われました。DE-AC02-06CH11357。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
窒化ケイ素窓シルソン株式会社/ JBJビジネスパーク/ノーサンプトン路、ノーサンプトンNN7 3DW、イギリスSiRN-5.0-200-2.0-200。サイズ順に並べます。メンブレンサイズ:1.5 mm x 1.5 mm、厚さ:200海里。フレームサイズ:5 mm×5mm。フレームの厚さ:200μm。代替ソース:SPI Supplies / Structure Probe、Inc.ペンシルバニア州ウェストチェスター
逆ピンセット電子顕微鏡科学、私書箱550、1560インダストリーロード、ハットフィールド、ペンシルバニア州19440、電話:215-412-8400、フリーダイヤル:800-523-5874、ファックス:215-412-845078520-5XEMS 5X、ノースカロライナ州–超微細ピンセット
ゴムグリッドマット電子顕微鏡科学、私書箱550、1560インダストリーロード、ハットフィールド、ペンシルバニア州19440、電話:215-412-8400、フリーダイヤル:800-523-5874、ファックス:215-412-845071170ラウンドグリッドマット
酢酸シグマアルドリッチ、3050スプルースストリート、セントルイス、ミズーリ州63103、電話:800-325-3010、ファックス:800-325-5052338826微量金属グレード濃縮酢酸
パイプバッファーSigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052P6757solid PIPES buffer
Formaldehyde stock solutionElectron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, フリーダイヤル: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450RT 1711310 x 10 ml アンプル of 20% aqueous paraformaldehyde

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