簡単かつ迅速なプロトコル非酵素的に浸潤リンパ球の分析のための新鮮なヒト組織を解離

サマリー

このプロトコルは、さまざまな正常および悪性のヒト組織に存在するCD45⁺細胞（リンパ球/白血球）の定性的および定量的評価のための新鮮なヒト組織断片の迅速な非酵素的解離を説明しています。さらに、一次組織ホモジネートから得られた上清を回収し、さらなる分析や実験のために保存することができます。

要約

両方の自然免疫と適応免疫応答から腫瘍回避することを特徴とする免疫系を回避するために、悪性細胞の能力は、現在、癌の重要な特質として受け入れられている。乳癌に関する我々の研究は、腫瘍浸潤リンパ球は、腫瘍の進行および患者の転帰に果たす積極的な役割に焦点を当てています。この目標に向けて、我々は彼らの本来の状態にそれらが近接し、評価するための努力で正常と異常な組織から無傷のリンパ細胞の迅速な単離のための方法論を開発しました。酵素で消化された組織と比較して表面の受容体の発現を維持しながら、ホモジネートを、機械的解離のショーを使用して増加した生存率および細胞の回復の両方を用意しました。さらに、残りの不溶性物質の酵素消化は、プライマリホモジネートにおける定量的および定性的測定が可能性が高い純粋に組織fragmで浸潤亜集団を反映していることを示す追加のCD45 ⁺細胞を回復しませんでしたENT。これらのホモジネート中のリンパ球様細胞は容易に免疫学（表現型は、増殖など ）または分子（DNA、RNAおよび/ ​​またはタンパク質）に近づく使用して特徴付けることができる。 CD45 ⁺細胞は、亜集団の精製、in vitro増殖または凍結保存のために使用することができる。このアプローチのさらなる利点は、ホモジネートから一次組織の上清を、サイトカイン、ケモカイン、免疫グロブリンおよび正常および悪性組織中に存在する抗原を特徴付け、比較するために使用することができることである。このプロトコルは、ヒト乳房組織に極めてよく機能し、正常と異常組織の多種多様に適用可能であるべきである。

概要

腫瘍微小環境は様々な細胞タイプで構成されており、それぞれが腫瘍形成において異なる重要な役割を果たすことを示す数多くの研究があります^1,2。これらには、浸潤する免疫細胞、間質細胞、内皮細胞および腫瘍細胞³が含まれるが、これらに限定されない。腫瘍浸潤リンパ球(TIL;CD45⁺細胞または白血球(乳腺腫瘍では主にリンパ球)は、その頻度が低いこと、研究に利用できることが多いサンプルサイズが小さいこと、および抽出中に生存率が失われる可能性があるため、困難になっています。腫瘍に浸潤する免疫細胞は通常、永住者ではなく乗客として存在するため、一般に、組織マトリックスから放出されやすくなります。

細胞の完全性を維持しながら腫瘍組織を解離することは技術的に困難であり、伝統的には機械的ステップと酵素的ステップの組み合わせを使用して単一細胞懸濁液を調製するために行われてきました^4-8。このアプローチは、長いインキュベーション期間を伴い、細胞生存率の大幅な低下と、酵素的切断による細胞表面受容体の喪失と関連しています。腫瘍微小環境におけるTILを特徴付ける高品質のフローサイトメトリー研究、およびフローサイトメトリーまたは抗体コーティングビーズによるCD45⁺亜集団のクリーンな精製は、酵素消化された腫瘍組織から達成するのがより困難です。さらに、得られた腫瘍ホモジネートからの上清(SN)は、酵素消化物でタンパク質が分解される可能性があるため、分泌されたタンパク質(サイトカイン、ケモカイン、免疫グロブリン、腫瘍抗原)の定量化や正常細胞の実験的治療を含むさらなる分析には適していません。

酵素による消化を伴わずに乳房組織[腫瘍、非隣接非腫瘍(NANT)および正常(乳房縮小))の乳房組織]から単一細胞ホモジネートを調製する方法を模索する中で、さまざまな機械的均質化技術をテストしました。機械的解離剤を使用して調製したホモジネートは、表面受容体の発現を維持しながら、細胞生存率(2倍)と全細胞回収率(2倍)が向上しました。残りの不溶性物質の酵素消化では、追加のCD45⁺細胞は回収されず、これらはすべて初期ホモジネートで放出されたことが示唆されています。したがって、この迅速でシンプルなアプローチにより、さまざまな正常および悪性のヒト組織に存在するCD45⁺亜集団の定性的および定量的評価が可能になります。このアプローチのさらなる利点は、最初のホモジネート(一次組織SN)からのSNを収集して保存し、さらなる分析や実験に利用できることです。

プロトコル

注：すべての標本は、各患者から得た書面によるインフォームドコンセントを得て研究所ジュール·ボルデの医学倫理委員会によって承認されたプロトコルを使用して取得した。

組織ホモジネートの調製

1. 切除組織（手術室から切除悪性および正常組織）を解剖即時のピックアップのために訓練を受けた者が病理学研究室である。腫瘍は、NANT（できるだけ腫瘍から最も遠い距離を撮影したもの）と正常組織断片を日常的に1内で処理される - ヒト組織のための標準的なバイオセーフティ手順を使用してBSL2実験室で外科的切除の3時間。プロトコルのフローチャートを図1に示されている。
2. すべての組織片（通常NANTおよび腫瘍）を秤量し、長さ、幅、および高さ（長さ×幅×高さ）を測定する。これは、細胞集団のその後の正規化のための重要なステップは、抽出されたRNA 等である
   NOTE：可能な場合はサンプルサイズの範囲は、無脂肪と100〜10,000 mm ^3である。
3. 組織が実際に腫瘍の一部であることを確認するために、H＆E染色のためにスライドガラス上の腫瘍断片をインプリントする。
   1. 腫瘍断片上のガラス顕微鏡スライドを押すと数秒間指で穏やかな圧力を適用することによってこれを行います。
   2. 水中での洗浄工程に続いて2分間イソプロパノールでスライドを修正。マイヤーのヘマトキシリン​​で30秒のための組織を対比。
   3. 水の6浴にスライドを洗ってください。フロキシンBで15秒間、2％を染色する。
   4. 水1浴でイソプロパノールと仕上げの4風呂の水、続いて1浴で洗ってください。
   5. 1分およびドレイン用のイソプロパノール中でインキュベートします。キシレンの2浴場でクリア。
   6. キシレンベースマウント培地にマウントします。腫瘍細胞充実度（ 図2）のために調べます。
      注：主に、腫瘍細胞が刻印スライドに固執 - 間質、リンパ系または広告ipose細胞はほとんどの腫瘍細胞（ 図2）の間にスペースを残して、残っていない。
4. 滅菌を使用して-化学的に規定された、無血清造血細胞培地1mlを含む小さな培養皿で組織片を配置小片（2mmの^2〜1）にそれを室温で（以下、媒体と呼ぶ）とダイス外科用メス。
5. 機械的解離のCチューブにすべてのもの（組織片+媒体）を転送します。
6. パスツールピペットを用いて培地2mlでペトリ皿とメスをすすぎ、Cチューブ（解離のための媒体の体積= 3ミリリットル）にこれを追加します。
7. 単一細胞懸濁液に組織片を均質化するために、C管の機械的解離プログラムA.01（最も穏やかなプログラム）を使用します。装置内でCチューブを配置し、2回続けてプログラムを実行する（1サイクル= 25秒）。
   注：この均質化手順は、他のTUM、ヒト乳房組織のために設立され、検証されているまたはまたは組織タイプは、別のプログラムを使用する必要があるかもしれませんし、最初にテストする必要があります。
8. 装置からCチューブを外し、50ミリリットルチューブに座った40μmのセルストレーナーに直接ホモジネートをデカント。 工程1.6と同様のパスツールピペットを用いて、セルストレーナーにC管に残っている液体を移す。
9. 1ミリリットルマイクロピペットチップを用いて15ミリリットルチューブに濾過された液体を転送します。一時的にセルストレーナーとその50ミリリットルチューブを保つ。
10. メディアの追加の3ミリリットルでCチューブをすすぎ、再びまだ50ミリリットルチューブに座ったセルストレーナーに、 ステップ1.6と同様にパスツールピペットを用いて、これを転送します。優しくクリーンなパスツールピペットまたはその後溶出液を汚染を避けるために捨てられる1ミリリットルチップでストレーナーのまわりでそれを移動して50ミリリットルチューブにunhom​​ogenized組織に閉じ込められた残液の最大量を絞る。
11. 逆さT上のセルストレーナーを配置彼元のC管とunhom​​ogenized組織がバックC管に降下するように、培地の3ミリリットルで洗い流し。
12. A.01プログラムの2つのサイクルのためのステップ1.7のように再均質化する。
13. 再び最大圧搾50mlのチューブに着座細胞ストレーナーを通してこの第ホモジネートを入れ（ ステップ1.10のように）培地3mlで再びCチューブをすすぎ、50mlチューブに着座セルストレーナーにパスツールピペットで移すセルストレーナー中に閉じ込め残留結合組織から液体の量。
14. この時点で、〜2.5ミリリットルの容積は、15mlチューブ中で、約50 mlチューブ9 mlである。

組織上清と細胞の2の分離

1. 室温で600×gで15分間15ml中ホモジネートを50 mlチューブを遠心する。
2. きれいなチューブに15ミリリットルチューブからSNをデカントし、一時的に4℃で保存する。この上清=原発腫瘍、NANTまたは通常のTIssue SN（最終容量2.5ml）を、続いて清澄化し、将来の分析（下記参照）のために-80℃で保存する前に分注する。
3. 50ミリリットルチューブから上清を捨てる。
4. 静かに1ミリリットル中の最終容量の両方で細胞ペレットを再懸濁します。簡単に言えば、最初の優しく（ハード面上にチューブをタップして）両方の管に細胞ペレットを破る。培地500μlで50ミリリットルで緩い細胞ペレットを再懸濁し、第二のペレットを再懸濁し15ミリリットルチューブにこの細胞懸濁液を転送します。セルの最大回復のための媒体の第2の500μlの一回、この手順を繰り返します。
5. 小さなチューブに移すの細胞懸濁液10μlを、トリパンブルー10μlのミックス（希釈1：1）と血球計数器を用いて生細胞の数を数える。
   注：この時点で、細胞懸濁液の一部は、細胞サイズを評価するためにフローサイトメトリーによって分析することができ、粒度よりprecのための亜集団のマーカーの数が限られて、所望の場合事前の広範な分析や実験にホモジネートにおける相対的な細胞分布の伊勢評価。流れによる全ての分析は、フローサイトメトリー亜集団の正規化のためにCD45のラベルを組み込む。
6. 室温で10分間、300×gでの遠心分離によって細胞をペレット。腫瘍由来の細胞、NANT、または正常組織は今、さらに精製または分析のために準備ができている。手術と同じ日に行われたときにこれらの追加のステップは最高です。
   注：フローサイトメトリー分析のために、すぐ1秒間ボルテックスし、細胞ペレットを赤血球溶解緩衝液0.4mlを添加し、室温で10分間の最小値をインキュベートすることにより抗体標識後に溶解されるべき残留赤血球を選別細胞ではない分析前の温度（光から保護）。

組織上清の3明確化

1. 遠心機で4℃で15分間15000×gで組織SN 1.5 mlチューブに。
2. 慎重にTを削除彼が触れたり、ペレットを乱すことなく、上清。希望する分量の数やボリュームに応じて、清潔なチューブ（またはチューブ）に移す。
3. 将来の使用のために-80℃で上清を保管してください。

4.患者の血液

1. 手術前に、ヘパリン化チューブに静脈穿刺による制御の日として各患者から血液サンプルを収集する。血漿と軟膜を得るために、ブレーキをオフにして20ºCで10分間400×gで血液を遠心。
2. 血漿を除去し、20ºCで15分間万×gで遠心分離することにより、それを明確にする。将来の使用のために-80℃でアリコートとストアプラズマ。培地中のバフィーコートを希釈
3. 前の即時分析を標準フィコール - ハイパック勾配遠心分離を用いて単核細胞を分離し、亜集団の単離、DNA / RNA /タンパク質抽出または凍結保存。

5.フローサイトメトリー

1. ラベル細胞の製造に応じて光から保護して4℃でのr命令。細胞ペレットを細胞溶解緩衝液0.4 mlで添加することによって抗体標識後の組織片由来の細胞懸濁液中に溶解赤血球。
2. 渦はすぐに1秒間、光から保護し、室温で10分間の最小値を、インキュベートする。洗浄することなく、データ取得のためのフローサイトメーターで標識細胞を渡します。

結果

市販の組織解離溶液またはコラゲナーゼの様々な実験用混合物は、DNaseおよび/またはヒアルロニダーゼ阻害剤のいずれかと組織断片の酵素消化は、細胞の表面上の受容体の多種多様を切断する。最初に乳房腫瘍浸潤CD4 ⁺ T細胞に焦点を当てた我々の研究は、急速による標準的な酵素消化プロトコル^4-8を用いた表面CD4受容体の切断に大きな技術的な問題を提示した。我々は、高いリンパ球の生存率（ 図3A）にもかかわらず、細胞表面からコラゲナーゼIおよびIIを完全に除去CD4を見つける、またはDNaseおよびヒアルロニダーゼを阻害することなく、コラゲナーゼ酵素の様々な試験を行った。同じ患者からの未消化の血液および骨髄（と比較して消化されたリンパ節および腫瘍組織で検出されたより低いCD4抗体標識と - （2時間1）CD4に対する適度な効果は、短いインキュベーション時間でコラゲナーゼIVで観察された図3B。我々は消化し、未消化リンパ節と腫瘍組織）を比較することができませんでした受信により組織上の制限のためにあることに注意。 CD4のこの損失は、健康な...

ディスカッション

この研究は、その後の細胞選別、抽出、凍結保存および/ ​​またはCD45 ⁺集団の表現型分析のために酵素消化せず、正常および悪性の乳房組織ホモジネートの迅速な調製のために最適化された方法を記載している。この実験アプローチの目的は、密接にそれらのインビボ状態を反映し、手術室からの新鮮な組織の最小限の操作で、正常組織と比較しますTILの画像を生成することである。現在までに、私たちの研究室では> 250新鮮BC組織（腫瘍およびNANT）、>乳房の削減から35正常乳房組織を分析するために、このプロトコルを使用しています。原則として、このプロトコルは、他の腫瘍または組織型に直接適用可能であるべきである。しかしながら、いくつかの最適化が必要であり得る（ すなわち、機械的解離プログラム、サイクル数、培地容量など ）。 necessすることができる、より大きな組織片を用いた低リンパ球浸潤を有する組織に対する我々はリンパ球数が低い正常組織のために何をすべきかです進、。あるいは、密度勾配遠心分離工程は、白血球懸濁液を濃縮するために添加することができる。乳房の腫瘍浸潤ヒト...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
GentleMacs Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235	BD Medimachineは、遠心
分離機5810 R	エッペンドルフ		または他の標準的な卓上遠心分離機
遠心分離機5417 R	エッペンドルフ		または他の標準的なマイクロ遠心分離機
エスコクラスII A2バイオセーフティキャビネット	ESCOグローバル		または他の標準的なBSL2フード
です倒立顕微鏡	ニコン eclipse TS100		または血球計算盤
Bü と互換性のある他の顕微鏡。rker Chamber	Marienfield	640210	または他の標準的な血球計算盤
、Naviosフローサイトメーター	、ベックマンコールター		または他のフローサイトメーター(8-10色推奨)
GentleMacs C-Tube	、Miltenyi Biotec	130-096-344	BD Medimachineは、Filcon
細胞培養ディッシュ	Sarstedt	72,710	または他の非発熱性プラスチック製品
使い捨てメス	Swann-Morton	0510を使用しています	または標準的な使い捨て滅菌メス
BDセルストレーナー40µm	ベクトン・ディキンソン	734-0002	またはその他の非発熱性プラスチック製品
BD ファルコン チューブ 50 ml	ベクトン ディキンソン	352070	またはその他の非発熱性プラスチック製品
BD ファルコン チューブ 15 ml	ベクトン ディキンソン	352097	またはその他の非発熱性プラスチック製品
BD FACS チューブ 5 ml	ベクトン ディキンソン	352008	またはその他の非発熱性プラスチック製品
滅菌パスツールピペット 5 ml	VWR	612-1685	またはその他の非発熱性プラスチック製品
マイクロフュージチューブ 1.5 ml	Eppendorf	7805-00	またはその他の非発熱性プラスチック製品
X-Vivo 20	Lonza	BE04-448Q	無血清培地推奨
リン酸緩衝生理食塩水	Lonza	BE17-516F	標準生理学的 PBS
トリパンブルー	VWR	17942E	またはその他の重要な汚れ
VersaLyse	Beckman Coulter	A09777	フローサイトメトリー実験用
固定生存率 Dye eFluor 780	eBioscience	65-0865-14	フローサイトメトリー実験用
抗CD3 FITC	BD Biosciences	345763	フローサイトメトリー実験用
抗CD3 Vio Blue	Miltenyi Biotec	130-094-363	サイトメトリー実験用
抗CD4 PE	BD Biosciences	345769	フローサイトメトリー実験用
抗CD4 APC	Miltenyi Biotec	130-091-232	フローサイトメトリー実験用
抗CD8 ECD	ベックマン・コールター	737659	サイトメトリー実験
抗CD8 PerCP	BD Biosciences	345774	サイトメトリー実験
用 抗CD19 APC-Vio770	Miltenyi Biotec	130-096-643	フローサイトメトリー実験用
抗CD45 VioGreen	Miltenyi Biotec	130-096-906	フローサイトメトリー実験用

、 フロー フロー用 フロー