方法論記事

共培養系における神経結合の形成を評価するための光遺伝学的アプローチ

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DOI：

10.3791/52408

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2015年2月17日

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1Neuroscience & Behavioral Disorders, Duke-NUS Graduate Medical School, 2Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University

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この記事について

サマリー

人工多能性幹細胞(iPSC)に由来するニューロン、初代皮質ニューロン、およびアストロサイトからなる共培養システムを生成するためのプロトコルが説明されています。この共培養システムにより、新しいiPS細胞由来ニューロンとチャネルロドプシン-2を発現する既存の皮質ニューロンとの間のシナプス接触および回路の形成を検出することができます。

要約

ここでは、2つの異なるニューロン集団からなる共培養を生成するためのプロトコルについて説明します。人工多能性幹細胞(iPSC)は、エピソームベクターを用いてヒト線維芽細胞から再プログラムされます。iPS細胞のコロニーは、線維芽細胞のリプログラミング開始から30日後に観察することができます。多能性コロニーは、神経誘導培地で手作業で選択して増殖させ、神経前駆細胞(NPC)への分化を可能にします。iPS細胞は、1週間以内に急速に神経上皮細胞に変化し、高い培養密度で維持されると自己複製能力を保持します。初代マウスNPCは、血清含有培地に7日間曝露することによりアストロサイトに分化し、その上に胚18日目(E18)ラット皮質ニューロン(チャネルロドプシン-2(ChR2)をトランスフェクト)添加した単層を形成する。蛍光タンパク質であるタンデムダイマートマト(tdTomato)でタグ付けされたヒトNPCは、翌日、アストロサイト/皮質ニューロン培養に播種され、28〜35日間分化させます。このシステムは、iPS細胞由来ニューロンと皮質ニューロンとの間にシナプス結合を形成していることを示しており、これは皮質ニューロンの光刺激によるシナプス電流の頻度の増加から明らかです。この共培養システムは、iPS細胞由来ニューロンが他のニューロン集団とシナプス結合を形成する能力を評価するための新しいプラットフォームを提供します。

概要

近年では、ニューロン及び神経回路機能の我々の理解は、神経細胞の興奮性を制御するいくつかの光遺伝学的ツールで革命をもたらしてきた。そのようなツールが光活性陽イオンチャネルであり、チャネルロドプシン2（ChR2を）：光刺激1-3に対応してChR2を消防活動電位を発現するニューロン。神経細胞が光に通常は区別されませんので、この驚くべき能力は、ニューロン4の遺伝的に定義された集団の活動の正確な時間的および空間的制御のための新たな道を切り開くと大幅に脳機能の研究を加速しています。 ChR2をニューラルネットワーク6の活性を調節する神経発達5の監視が 、異なる目的のために幹細胞研究するために適用されている。

ここでは、神経細胞の共培養系の有用性を高めるためにChR2を用いる。共培養システムは、異なる細胞型の間の相互作用の評価を可能にする。ニューロンおよびグリアの共培養は、神経系の主要な細胞型は、一般的に、これらの異なる細胞型の間のシグナリングを調査するために、ならびに生理学的反応のためにこのシグナリングの重要性を評価するために、損傷の伝播及び検査するために使用されている潜在的にこのシグナル伝達7に関与する分子機構。以前の研究は、ヒトiPS細胞がラット皮質初代培養含有ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、およびミクログリア8の存在下でニューロンに非常に迅速に分化することを明らかにした。

このプロトコルでは、我々は、ヒト人工多能性幹細胞（iPS細胞）に由来するラット皮質ニューロン及びニューロン間のシナプス結合を調べるために、共培養系でのChR2を利用する方法を実証する。我々は、アストロサイトに解剖するステップと収穫脳組織9と同様に、マウス神経前駆細胞を維持し、分化する（NPCの）を記述し、人間のNPC値intOニューロンは、共培養系を作成する。この共培養系を確立するために、我々は、ヒトiPS細胞を生成するために、 文献 10沖田らによって記載統合のない再プログラミング法を用いた。 Li らによって記載されているように、これらのiPS細胞は、その後、効率的小分子阻害剤を用いた化学的に定義された条件でのNPCに分化した。11

共培養では、ニューロンの異なる集団は、トマト（tdTomato）二量体蛍光タンパク質、タンデム経由IPSC由来のニューロンの皮質ニューロンにおけるChR2を発現の検出とタグ付けを介して同定することができます。皮質ニューロンの光遺伝学的光刺激とIPSC由来のニューロンからの電気生理学的記録を組み合わせると、互いに回路を形成するニューロンのこれら2つのタイプの能力の評価を可能にする。具体的には、ChR2を発現皮質神経細胞の光刺激は、シナプス回路を形成しているIPSC由来のニューロンにおけるシナプス応答を呼び起こす輝皮質ニューロンネットワークと。我々は、増加したシナプス後電流が実際にそのような条件下でIPSC由来のニューロンで検出されたことを示している。このプロトコルは、疾患患者からの線維芽細胞から派生iPS細胞を使って、別の神経疾患モデルの要約を含む実験条件、種々の条件下でシナプス回路の評価を可能にする。

プロトコル

注：すべての実験はSingHealthでの動物実験委員会によって承認されたプロトコルに従って実施されている。

1.収穫出生後早期マウスの脳

  1. 解剖前に、海馬組織消化液の準備：1ミリリットルあたり10μlのパパインを1Xアール平衡塩溶液（EBSS）（+ 1％HEPES）デオキシリボヌクレアーゼI（DNアーゼI）（250 U / ml）及びディスパーゼII（1 U /とミリリットル）。組織消化溶液約2.5ミリリットルを加えて、0.20ミクロンフィルターユニットを使用してフィルタリングする。使用するまで37℃で温溶液にしてください。
  2. 5分間氷でそれらを置くことによって、生後5日（P5）マウスの仔を麻酔。つま先や尾のピンチを経由して、痛みの反射のために氷とテストから削除。 70％エタノールで子犬をスプレーします。子犬を斬首し、氷の上のペトリ皿に頭を置く。
  3. 小さなscissoのペアで、鼻への頭蓋底から、正中線に沿って皮膚に切開を作るRSまたは細かい解剖用鉗子。ピールは、肌を開き、頭蓋骨を通して類似の切開を作る。 、頭蓋骨の両側に2の追加の水平カットを作る（ブレグマで）1頭側と（ラムダで）1尾。
  4. ピールは、基礎となる脳を露出させるために切開線に沿って頭蓋骨を開きます。嗅球の上にある頭蓋骨、およびそれらの間のすべての正中骨を除去するための一対の鉗子を使用してください。非解剖手にピンセットで安定した頭部を保持した状態でこれを行います。
  5. 脳の腹側部分と尾終わりに頭蓋底の間にへらの平坦部が容易になります。脳の下の頭蓋骨のベースにへらを平行に保ち、脳と頭蓋骨のベースとの間に癒着を切断するために頭蓋骨の頭側端に向けて移動する。
    1. へらで脳をかき出すと、氷冷1X EBSS（+ 1％HEPES）を含むペトリ皿に入れてください。常時水没組織してください。
  6. すべてのために顕微解剖工程、解剖顕微鏡下で作業し、それぞれの手で微細な解剖用鉗子を使用して、組織を切断するための一つであり、安定した組織を保持するための他の。
  7. カットだけで後脳からそれを分離するために大脳皮質に後方を確認します。その2つの半球に大脳皮質を分離するために正中線に沿って切断。大脳半球から髄膜を削除します。
  8. 半球内側を上に配置し、海馬の下側脳室に鉗子を挿入します。中脳を切り取る。
    1. 海馬の上方および下方端部のカットを行い、歯状/嗅内皮質接合部付近皮質から海馬を隔離する。氷冷1X EBSS（+ 1％HEPES）を含む皿に海馬を収集します。

2.海馬組織解離

  1. 予め温めておいた海馬組織消化溶液を含む皿に海馬を転送します。ミンチトン彼はできるだけ細かいに組織を海馬、37℃で30分間インキュベートする。
  2. 穏やかを15ml遠心管に機械的にピペッティングし、転送細胞によって単一の細胞に組織を解離する。
  3. 5分間200×gで遠心分離し、上清を除去します。
  4. 20ミリリットルに再懸濁細胞ペレットを10分間200×gで、ショ糖（0.9 M）と遠心分離器を含むハンクス平衡塩溶液（HBSS）を0.5倍。
  5. NPCの維持培地（ 表1）を2mlの上清を再懸濁細胞ペレットを除去する、5分間200×gで1×EBSS溶液および遠心機で、4％ウシ血清アルブミン（BSA）を10mlの上に置いた。
  6. 上清を除去し、細胞ペレットに、マウスのNPCの維持培地（ 表1）を追加します。静かに細胞ペレットを、単一細胞に分割されていることを確認するためにダウンして5〜10倍にアップするピペット。
  7. プレコートされたマトリゲルプレートに細胞を含む培地に移し、上皮成長因子（EGF）およびfibroblaを追加ヘパリン番目の成長因子2（FGF2）（両方とも20ng / mlの）（5 mg / mlで）。 37℃、5％CO 2でプレートをインキュベートする。

接着マウス海馬のNPCのeメンテナンス

  1. コー​​ティングされたプレート/フラスコ、少なくとも1時間は、マウスの海馬のNPCを継代する前に準備します。各プレートまたはフラスコの表面領域をカバーし、1時間室温でインキュベートするのに十分なマトリゲルを追加する。
  2. 90％のコンフルエントマウスNPC培養物からメディアを取り出して、1Xリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で一回洗浄後、PBSをオフに吸引除去する。
  3. 全てのウェル/フラスコを覆い、37℃で5分間インキュベートするのに十分な細胞剥離液を加える。
  4. すべての細胞は10倍の倍率で倒立明視野顕微鏡下で見ることによって切り離されていることを確認します。付着した細胞が残っている場合は、さらに1〜2分間の培養容器をインキュベートし、再び細胞を確認してください。ダルベッコ改変イーグル培地/ HamのF-12栄養混合物（DMEM / F-12）の二倍の量を追加します。一旦すべての細胞が剥離しているウェル/フラスコの細胞剥離液と同様である。
  5. 5分間200×gで15ミリリットルの遠心管と遠心分離機にDMEM / F-12含有細胞を転送します。
  6. 上清を除去し、マウスのNPC維持培地（ 表1）の5ミリリットルに細胞ペレットを再懸濁します。静かに単一細胞に細胞ペレットを分割する上下にピペット。
  7. EGFとFGF2で補充新しい培養ウェル/フラスコおよびトップアップ十分な培養培地への全​​細胞の第三のプレート。 37℃、5％CO 2で培養容器をインキュベートする。 3 3〜4日ごとに：メディアごとに二日と分割セル1を補充する。凝集及び剥離を防止するために、マウスNPC培養の異常増殖を避けてください。

星状細胞へのマウスのNPCの4分化

  1. アストロサイトへのマウスのNPCの分化を開始する前に、事前にポリ-L-リジン（PLL）/ラミニンコーティングされた12ミリメートルのカバーガラスに少なくとも一日を準備します。 COVを追加24ウェルプレートにerslips十分なPLL（ホウ酸緩衝液中1mg / ml）でのウェルの表面全体を覆​​う。
    1. 4℃で一晩プレートをインキュベート。次の日には、PLLを除去し、1×PBSで一回洗浄する。
  2. その後、37℃で少なくとも4時間インキュベート、再び各ウェルの全表面領域を覆う、ラミニン（氷冷DMEM / F-12中1mg / ml）を加える。
  3. マウスNPC培養物からメディアを取り出した後、PBSをオフに吸引し、1X PBSで一回洗浄します。
  4. 全てのウェル/フラスコを覆い、37℃で5分間インキュベートするのに十分な細胞剥離液を加える。
  5. すべての細胞はその後切り離さDMEM / F-12ウェル/フラスコに細胞剥離液との二倍の量を追加したことを確認してください。
  6. 5分間200×gで15ミリリットルの遠心管と遠心分離機にDMEM / F-12含有細胞を転送します。
  7. 5ミリリットルアストロサイト分化培地（ 表1）で上清と再懸濁細胞を除去する。静かにピペット細胞suspensionの上下に単一細胞に細胞ペレットを分割する。血球計数器を持つ単一のセルの数を数える。
  8. 24ウェルプレートの各ウェルの培地を500μl中/ cm 2で5×10 4細胞で細胞をプレート。 37℃、5％CO 2でプレートをインキュベートする。一日おきに新しい培地と培地の半分を交換してください。マウスNPCは急速に2日以内に、星状細胞に分化し、さらなる実験を開始する前の週のために区別されます。

5.収穫胚ラットの脳皮質組織解離

  1. 星状細胞培養からアストロサイト分化培地（ 表1）を取り外し、主要ニューロン培地（ 表1）胚性ラット脳の収穫を開始する前に、少なくとも4時間で交換してください。
  2. 12.1 mg / mlのL-システインと1ミリリットル1X EBSS（+ 1％HEPES）あたり10μlのパパイン：解剖前に、皮質組織消化液を調製。約2を作る組織消化溶液0.5ミリリットルと0.20μmのフィルターユニットを使用してフィルタリングする。使用するまで37℃で温溶液にしてください。
  3. 圧縮ガスを使用して、二酸化炭素窒息によって妊娠ダムを安楽死させる。つま先や尾のピンチを経由して、痛みの反射のためのテスト。
  4. 吸収パッドに動物腹側を上に置き、70％エタノールとの腹部領域を浸す。腹部を露出させるために十分な幅、ピンセットで皮膚をつまみ、外科ハサミで横切開する。鉗子で腹膜をつかみ、腹腔を開きカット。
  5. 鉗子で子宮角を持ち上げ、子宮間膜に沿って自由にそれをカット。氷の上のペトリ皿に解剖子宮を置きます。それらの間の子宮組織を切断することにより、各胚を区切ります。
    1. 胚嚢切開を行います。静かに開口部を介して胎児を支払う。胎児を斬首し、氷の上のペトリ皿に頭を置く。
  6. embryonを収穫するICのラットの脳には、ステップ1.3から1.5までの説明に従ってください。
    1. 皮質の組織を分析するために、脳半球の横側を上に配置します。途中から横方向に二つに半球をカット。近い脳のベースに半分を捨てる。中脳を除去するための切除した組織をトリミング。
  7. 予め温め皮質組織消化溶液を含む皿に皮質組織を転送します。可能な限り微細な皮質組織をみじん切りし、37℃で30分間インキュベートする。
  8. 予め温めておいた一次ニューロン培地（ 表1）を10 mlを含む50ml遠心管に組織消化溶液からの皮質組織を移す。無組織片と、均一な溶液が得られるまで、繰り返し、それらをピペッティング血清学的ピペットインによって皮質組織を解離。
  9. 残りの組織塊を除去するために70μmのセルストレーナーを通して組織液を渡します。 15ミリリットル中に組織液を分注し各チューブに約3ミリリットルを追加する遠心管、。
  10. 底部の上面およびBSA上の組織液で二層を形成し、各チューブの底に1×PBSにおける800μlの7.5％BSAを加える。
  11. 5分間200×gで遠心分離する。二つの層の界面からの吸引、上清を除去します。チューブの底に細胞ペレットを乱さないようにしてください。
  12. 1mlの一次ニューロン培地（ 表1）を各細胞ペレットを再懸濁し、15mlの遠心管にそれらを組み合わせる。血球計数器を用いて細胞密度を決定します。

一次皮質ニューロンの6エレクトロポレーションおよびメッキ

注：遺伝子導入はエレクトロポレーション、リン酸カルシウムトランスフェクション、およびウイルス形質導入を含むいくつかの方法を用いて達成することができる。このプロトコルでは、一次皮質ニューロンへの構築にChR2を提供するエレクトロポレーションについて説明します。

  1. 遠心機6×10 6ラット皮質ニューロンA5分間200×gでのトン、上清を除去します。少なくとも6×10 6皮質ニューロン生存ニューロンによって神経回路網の形成を確実にするために、エレクトロポレーションのために必要とされる。
  2. 静かに細胞ペレットを再懸濁にエレクトロポレーション溶液100μlを追加します。 pLenti-シナプシンhChR2の6μgの（H134R）-EYFP-WPRE 4プラスミドで細胞懸濁液100μlを組み合わせると認定されたキュベットに移す。転送中に気泡を生成する避ける。
  3. 選択して、製造業者の説明書に従ってエレクトロポレーションのための適切なプログラムを適用する。
  4. エレクトロポレーション後、キュベットに細胞/ DNA懸濁液にMEMの500μlを添加する。 11.5ミリリットルに試料を移し、一次ニューロン培地（ 表1）、静かに懸濁します。メディアの合計量は、全24ウェルプレートのために十分である。アリコートを24ウェルプレートの各ウェルについての培地500μl。 37℃でプレートをインキュベートし、5％CO 2。

人工多能性幹細胞の7世代

注：このメソッドは、沖田らから適応されています10。

  1. DMEM中で培養ヒト線維芽細胞を6ウェルプレートで、10％ウシ胎児血清（FBS）を補充した。
  2. マトリゲルと線維芽細胞、コート6ウェルの再プログラミングを開始し、室温で少なくとも1時間インキュベートに先立ち。 80％のコンフルエンスで、線維芽細胞培養からメディアを削除し、1X PBSで一回洗浄します。
  3. プレート全体をカバーし、10分間37℃でインキュベートし、十分な0.25％トリプシン-EDTAを加える。
  4. 細胞は、ウェルから除去した後、トリプシン消化をクエンチするトリプシンと10％のFBSを含むDMEMの倍の量を追加します。上下にそっとピペット細胞懸濁液の細胞を破壊する。血球計数器を持つ単一のセルの数を数える。
  5. を15ml遠心管遠心5、200×gで細胞懸濁液に転送7×10 5細胞分。
  6. 上清を除去し、エレクトロポレーション溶液中で細胞ペレットを再懸濁します。製造元の指示に従って、線維芽細胞をエレクトロポ。エレクトロポレーション緩衝液100μlで細胞を再懸濁し、各ソームベクター1μgのを追加します。 1650 V、10ミリ秒と3時間パルスの設定でエレクトロポレーション細胞。
  7. DMEM中に細胞懸濁液を移し、10％FBSを補充した6ウェルプレートのウェルあたり5×10 4細胞をプレー。 37℃、5％CO 2でプレートをインキュベートする。
  8. 48時間後、トランスフェクトした線維芽細胞培養からメディアを削除し、mTeSR培地と交換してください。人工多能性幹細胞（IPSC）コロニーを単離することの準備ができるまで、毎日培養培地を交換してください。 IPSCコロニーを28-35日後に観察することができる。
  9. ときに分離のための準備ができて、機械的にIPSCコロニーをカットし、マトリゲル被覆した6ウェルプレート12上に10μMのRho関連タンパク質キナーゼ（ROCK）阻害剤（Y-27632）でmTeSR媒体に再シード。毎日の培養液を交換してください。

8.神経誘導と人間のNPCのメンテナンス

注：この方法は、Li らによって記載されている11

  1. IPSC培養が20％コンフルエンスのまわりにあるとき、mTeSR培地を除去し、神経誘導培地（ 表1）に置き換える。一日おきに培地を補充する。
  2. 7日後、神経誘導培地を除去し、人間のNPCの維持培地（ 表1）に置き換える。文化を継代7日前一日おき​​に培地をアップ補給。
  3. 以前は、少なくとも時間室温でマトリゲルと文化、コートプレート/フラスコを継代。
  4. コンフルエント人間NPC培養物からメディアを取り出した後、PBSをオフに吸引し、1X PBSで一回洗浄します。
  5. 37℃で5分間インキュベートし、その後すべてのウェルをカバーするために十分な細胞剥離溶液を添加する。
  6. すべての細胞が剥離したことを確認してください。 DMEMの倍の量を追加/F-12ウェル/フラスコの細胞剥離液と同様である。
  7. 5分間200×gで15ミリリットルの遠心管と遠心分離機にDMEM / F-12含有細胞を転送します。
  8. 5mlの上清の再懸濁細胞を除去し、ヒトNPC維持培地（ 表1）。上下にそっとピペット細胞懸濁液の細胞を破壊する。
  9. プレートマトリゲル被覆された培養ウェル/フラスコおよびトップアップ10μMのY-27632を補足した十分な媒体への全細胞の第三。 37℃、5％CO 2で培養容器をインキュベートする。
    1. スプリット培養1：3、3〜4日毎と一日おきに培地を補充する。分化を防止するために、高密度に人間のNPC培養を維持します。

共培養におけるニューロンへの人間のNPCの9分化

  1. 神経細胞への分化を開始する前に、人間のNPC培養物へのレンチウイルスベクターシナプシン-tdTomatoを追加します。アストロサイト/皮質ニューロン共培養を準備人間のNPCを区別する前に予め日。
  2. 1×PBSで一回ヒトNPC培養物を洗浄し、全てのウェルをカバーするために十分な細胞剥離液を追加/次いで、フラスコを37℃で5分間インキュベートする。
  3. すべての細胞が剥離したことを確認してください。ウェル/フラスコに細胞剥離液のそれとDMEM / F-12の倍の量を追加します。 15ミリリットル遠心管に移す。 5分間200×gで遠心分離する。
  4. 5mlの上清の再懸濁細胞を除去し、神経分化培地（ 表1）。穏やかにピペット細胞懸濁液上下単一細胞に細胞ペレットを破壊する。血球計数器を持つ単一のセルの数を数える。
  5. 慎重にアストロサイト/皮質ニューロン培養物からの培地を吸引除去する。各24ウェルのために10μMのY-27632を補足した神経細胞の分化培地（ 表1）の500μlの5×10 3細胞/ cm 2でプレート人間のNPC。静かに各ウェル中に人間のNPCを含む培地を追加星状細胞および皮質ニューロンを乱さないよう。
  6. 37℃、5％CO 2でプレートをインキュベートする。少なくとも28日間、2〜3日ごとに新鮮な培地に培地の半分を交換してください。

IPSC由来のニューロンの10。電気生理学的記録

  1. 人間性IPSCは、成熟ニューロンのように動作するかどうか確認してください。
    1. 60X（0.9 NA）水浸レンズを搭載した直立共焦点顕微鏡を用いてtdTomatoの可視化により、ヒトiPS細胞から分化した細胞を探す。
    2. 外液（ 表1）中、室温で4~6 M.潅流細胞の耐性への記録ピペットを引く、95％O 2/5％CO 2で常に泡立て。内部溶液（ 表1）で記録マイクロピペットを埋める。
    3. curの電流注入（1秒の期間、10 pAの増分）に応答して、ホールセルモードと記録活動電位発火パッチtdTomato +細胞クランプを借りる。
  2. ChR2をを表現する皮質細胞の活動電位を確実に光刺激によって誘発されている場合を確認してください。
    1. 皮質細胞は、共焦点顕微鏡下でGFPの可視化によってChR2をを表現して下さい。 、手順10.1.3に10.1.2に従うことによって皮質細胞上の全細胞パッチクランプ記録を行う。
    2. チェック活動電位を確実に水銀アークランプ（100W）で光照射によって誘発される。励起フィルターの波長は40分の480の程度である。
  3. 光遺伝学的刺激を実行します。
    1. ホールセルモード及び-70mVにおける設定電圧クランプパッチtdTomato +細胞。 2 kHzで電流信号をフィルタリングし、10kHzでデジタル化する。録音中に一貫性のために、10〜20 Mまでの直列抵抗を監視します。
    2. 30秒間、100Wの水銀ランプで40分の480 nmの励起フィルターによるフィールド全体を刺激する。
    3. ChR2を発現シナプス前CORの光刺激によって誘発されるパッチを適用したセルの録音シナプス後電流（のPSC）ticalニューロン。のPSCを検出し、測定する。それぞれ5 Paと20 PC、での振幅と電流エリアに設定されたしきい値。手動で任意の非PSCトレースを破棄するようにこれらのイベントを検査します。

結果

ここで、共培養から星状細胞、皮質ニューロンおよびヒトの神経細胞の生成に関与する複数のステップを説明するプロトコルが示されている。ヒトiPS細胞は、エピソームベクター10と高密度（ 図1A）に維持されたNPCは11を作り、小分子阻害剤のカクテルで神経系統に指定を使用して線維芽細胞を再プログラムすることによって得た。 tdTomato（ 図1B）でタグ付けされた人間のNPCのアストロサイトへのマウスのNPCの分化、ChR2をを表現するラット皮質ニューロンのめっき、播種を：いくつかのステップが共培養を生成するのに必要とされる。分化の2日目に、グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）+アストロサイトは容易に私たちの培養物（ 図1C）で観察することができる。マウスのNPCは、アストロサイトの単分子層（ 図1D）にChR2をを表現する皮質神経細胞をプレーティングする前に少なくとも1週間分化させた。 3の後人間のNPC分化の4週間、tdTomato +ニューロンは、培養物（ 図1E）で検出された。

この共培養系は、光刺激（ 図2A）に応答して、個々のIPSC由来のニューロンからシナプス後電流の一貫した検出を可能にする。光によって刺激されると、活動電位は、ChR2を（ 図2B）を発現する皮質ニューロンで生成された。 IPSC由来のニューロンは、現在の脱分極パルスの振幅が増加したように（ 図2D）増加し、活動電位発火を示す、また（ 図2C）励起可能である。したがって、これらの細胞は、成熟したニューロンの特性を示す。光がない場合には、IPSC由来のニューロンは、自発的なシナプス入力（ 図2E）を受けた。 GABA受容体を介して電流が外向きになるので、これらの内向きシナプス後電流は、主に、AMPA受容体によって媒介され、NMDA受容体は電流αを有していない-70 mVの保持電位トン。光刺激が大幅にシナプス後電流（ 図2E）の周波数を増加させているため、これらの入力のうちの少なくともいくつかは、ChR2を発現しているが、シナプス前皮質ニューロンからのものであった。シナプス入力の増加の時間経過を図2Fに示されている：皮質ニューロンの光刺激は、30秒の長い光のフラッシュを通して持続した。 ChR2を発現皮質神経細胞は（ 図2G）輝されたときのPSCの周波数が上昇したが、その振幅は（ 図2H）影響を受けなかった。要約すると、これらの結果は、IPSC由来のニューロンが成熟した神経細胞の性質を示し、シナプス前皮質ニューロンとシナプス結合を形成することができることを示している。

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図1：共培養の生成のための模式図のNPCに性IPSCと神経誘導にヒト線維芽細胞を再プログラムするためのシステム。（A）のタイムライン。皮質ニューロンとアストロサイト培養物に対する成熟したニューロンへの人間のNPCの最終分化のために（B）タイムライン。（C）マウスNPCは急速に2の後GFAP +アストロサイトに分化するインビトロでの日数（D）1週間後にChR2を発現する皮質ニューロンのGFAP +星状細胞上にプレーティングした。（E）4〜5週目人間のNPCの分化後、電気生理学的記録は、tdTomato +ニューロンで行った。スケールバーは、100μmを表す。

figure-results-2
図2：機能的なシナプスの接続性の光遺伝学的解析。 tdTomatoでタグ付けされた（A）IPSC由来細胞（赤色）は、皮質ニューロンが光活性を発現する共培養したチャンネル、ChR2を（緑）。 IPSC由来のニューロンからの記録は、皮質ニューロンまたは他のIPSC由来の神経細胞のいずれかから来ることができシナプス後電流（PSC）の応答を、明らかにした。（B）イルミネーション（青いバー）ChR2をを表現する皮質ニューロンにおける活動電位のシリーズを誘発。（ C）IPSC由来の細胞は、ChR2を発現皮質神経細胞の（E）光刺激（青いバー）。IPSC由来細胞の現在の関係を示す曲線D）焼成（。電流注入により誘発されるIPSC由来の神経細胞内のPSCの頻度が増加している光刺激によって生成PSC周波数の増加の。（F）時間のコース。青いバーが光刺激の時間を示している。 PSC周波数は光刺激（G）増加したが（G、H）、PSC振幅が（H）影響を受けなかった。 *はp <0.05は、スチューデントのt検定を用いてコントロールと比較して示している。

ディスカッション

光遺伝学は、ニューロン13の定義された集団の活性化のための時間的·空間的な精度を提供します。我々の実験では、顕微鏡対物レンズの全視野は、光刺激のChR2を発現するだけ皮質ニューロンを30秒間照射した。これは、私たちは、シナプスの接続は、共培養内のニューロンの異なる集団の間に形成されたかどうかを判断することができました。我々の結果は、これらのニューロンがChR2をを表現するシナプス前皮質ニューロンからシナプス入力を受け取ることを示している、光刺激はIPSC由来の神経細胞でPSC周波数を増大させることを明らかにした。これは、順番に、IPSC由来の神経細胞が正常に皮質ニューロンを持つ回路に組み込まれていることを確立した。

この共培養系を生成するためのいくつかの重要なステップがある。これは、メッキを進める前に、最小限の細胞死に、マウスNPC由来の星状細胞培養が健康であることを確認することが重要です他の種類の細胞。皮質ニューロンと人間のNPCは健康的なアストロサイト上によく付着し、電気生理学的記録は、培養条件に大きく依存しています。このプロトコルの他の重要なステップは、星状細胞培養へのエレクトロポレーションおよび皮質ニューロンのメッキです。多数の細胞がエレクトロポレーション後に死滅したように、少なくとも600万皮質ニューロンを、24ウェルプレート中で星状細胞培養上にメッキする電気穿孔されることを保証することが重要である。私たちは、より少ない600万人以上の細胞をエレクトロポレーションした時、生き残るニューロンの数は、電気生理学的記録に影響を与えた密な神経回路網を形成していなかったことを観察した。エレクトロポレーション皮質ニューロンの数は、異なる研究間の比較を可能にするために、各共培養実験のための一貫している必要があります。酵素消化に関与するすべての手順については、それはあまりにもあれば細胞死につながる可能性があるために、消化液中で細胞を残さないことが不可欠である。

このアプローチは、他のニューロンとのシナプス接触を形成するために、患者固有の線維芽細胞から誘導された神経細胞の能力をスクリーニングすることができる。神経発達障害、レット症候群（RTT）に罹患している患者からの線維芽細胞から誘導されたニューロンは、シナプス伝達の欠陥を示す：RTTニューロンは、おそらく少ないシナプス接続14に、健康なニューロンに比べPSC周波数及び振幅の有意な減少を示す。我々の同時培養系は発達障害を表示するニューロンに対する薬物効果の検査を可能にする。これは、罹患した人間のNPCの播種の間、並びに神経分化の時間にわたって化合物への連続暴露中に目的の化合物の添加によって行うことができる。

この共培養系はまた、薬物試験のためのモデルとして使用することができるが、このアプローチの限界は、各候補化合物の効果を調査するプロセスは長くとして面倒であることであるそれは、ハイスループットスクリーニング法ではない。候補化合物で処理した後、IPSC由来のニューロンは、個別のPSCの各化合物の効果を決定するためにパッチを適用する必要があります。また、患者から多くの利用可能な線維芽細胞およびiPS細胞は、現在、存在しない。したがって、より多くの患者の細胞を有し、また、ハイスループットスクリーニングのためにこのプロトコルを適応させるために、近い将来において重要であろう。例えば、このようなイオンまたは膜電位の遺伝的にコードセンサーとして動作インジケータとIPSC由来のニューロンを標識することにより、サイドステッピング時間のかかる電気生理学的手順をすることにより、実質的にスループットレートを増大させることが可能であろう。電気生理学的記録を実行する線維芽細胞を再プログラミングから、この共培養系を生成するプロセス全体としては、90日以上、それはそれぞれのリプログラミングや神経誘導ステップの後、人間性IPSCまたはNPCはどちらが展開することをお勧めします必要があり、凍結保存将来の実験のために必要な時間を短縮する。

我々の実験では、我々はシナプシンプロモーター下皮質ニューロンにChR2を発現した。このプロモーターはパン神経であるため、我々は、おそらく抑制性と興奮性皮質ニューロンの両方を光刺激された。将来の実験の目的は、特に、阻害または刺激性のいずれかの回路を調べるためである場合、より特異的プロモーターを使用することができる。代替的に、皮質ニューロンは、トランスジェニック（またはウイルスを注射したマウス）にChR2の発現が特異的にニューロンの遺伝的に定義された亜集団を標的とするから得ることができる。例えば、Creリコンビナーゼは、フロックスChR2を持つマウスと交配されているパルブアルブミン含有介在ニューロン（PVの介在ニューロン）に発現しているマウスから収穫皮質組織は、ChR2をを表現する唯一の皮質ニューロンは、PVの介在ニューロン15になります状況が得られます。私たちの共同Cu中などChR2を発現介在ニューロンの使用ltureシステムは、パッチを適用したIPSC由来のニューロンがPVの介在ニューロンとの回路に組み込むことができるかどうかの決定を可能にします。

以前の研究9に基づき、皮質ニューロンは、in vitroで 14日後に樹状突起が重複する成熟している。光刺激は、パッチを適用したIPSC由来の神経細胞からの応答を誘発しない場合にはこのように、それはニューロンは、皮質ニューロンとシナプス結合を行う能力を持っていないことを示す必要があります。 IPSC由来のニューロンのいずれか他のIPSC由来の神経細胞または皮質ニューロンからシナプス入力を受信することができる。従来のパッチクランプ記録を用いた場合には、シナプス入力がどこから来ているのかを区別することは不可能である。私たちのシステムの利点は、皮質のシナプス前入力からシナプス後応答が選択的に誘発し、識別することができるということです。ここで概説した手順を統合するIPSC由来の神経細胞の能力を評価するために、簡単なアプローチを提供定義された神経回路網に。

開示事項

利益相反は宣言されていません。

謝辞

私たちは、IPSCの生成に関する専門知識とプロトコルを共有するため、それぞれにChR2とシナプシン-tdTomatoレンチウイルス構築物についてC.チャイをK. DeisserothとS.帝に感謝し、ワイオミング州レオン技術サポートのために、共有試薬および専門知識のためのゴーラボのメンバー。この作品は、ELGにその競争的研究プログラム（002から082 2008 NRF-CRP NRF）の下で国立研究財団シンガポールにより、アボット栄養とELGに優秀の学術センター（ACE）グラクソ·スミスクライン（GSK）から研究賞によってサポートされていましたし、 GJAへ：GJA、及び文部科学省によって資金を供給韓国国立研究財団（NRF）のワールドクラス研究所（WCI）プログラムで、韓国の科学技術（MEST）（WCI 2009-003 NRF認可番号）

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Neurocult Proliferation Kit (Mouse)STEMCELL Technologies5702には、NSC基礎培地とNSC増殖サプリメント
Epi5 Episomal iPSC Reprogramming KitInvitrogenA15960
DMEM/F12Lonza12719F
MatrigelBD Biosciences354277
Neurobasal mediumInvitrogen
21103049 MEM グルタミン不使用Invitrogen11090081
N2Invitrogen17502048
B2717504044
L-グルタミン25030081
GlutaMAX サプリメントInvitrogen35050061
PenStrep15140122
BSASigmaA7906
Human LIFInvitrogenPHC9484
CHIR99021Miltenyi Biotech130103926
SB431542SigmaS4317
Compound EMerck Millipore565790
EGFMerck Millipore324856
FGF2R&D Systems233FB025
研究用グレード FBSThermo ScientificSV30160.03アストロサイト分化培地用
定義 FBSThermo ScientificSH30070.03一次ニューロン培地用
PBSThermo ScientificSH30028.02
グルコースSigmaG8270一次ニューロン培地
用 スクロースシグマS0389
ヘパリンEMD ミリポア375095
パパインワージントン3126
HBSSInvitrogen14175095
DNase Iロシュ10104159001
ディスパーゼ IISTEMCELL Technologies7923
HEPESGibco15630080収穫脳
EBSSInvitrogen14155063
L-CysteineSigmaC7352
Trypsin-EDTAInvitrogen25200056
70 & micro;m細胞ストレーナーBD Biosciences  352350
20 µm フィルターユニットザルトリウス ステディム16534K
NaClSigmaS7653
KClSigmaP5405
NaHCO3SigmaS5761
NaH2PO4Fluka71505
MgCl2SigmaM8266
CaCl2SigmaC1016
D(+)-グルコースSigmaG7520電気生理学的研究用
K-グルコン酸SigmaP1847
KOHKANTO Chemical3234400
HEPESSigmaH3375電気生理学的研究用
EGTASigmaE3889
Na2ATPSigmaA7699
Na3GTPSigmaG8877
ホウケイ酸ガラス毛細血管World Precision instruments, Inc1604323
15 ml 遠心分離管BD Biosciences 
50 ml 遠心分離管BD Biosciences352070
24 ウェルプレートCorning9761146
6 ウェルプレートCorning720083
T25 フラスコCorning430641
12 mm カバーグラスMarienfeld-Superior111520
AMAXA ラットニューロン Nucleofector キット ロンザVPG1003初代皮質ニューロンのエレクトロポレーション
ネオントランスフェクションシステム InvitrogenMPK5000ヒト線維芽細胞のエレクトロポレーション
Mini Analysis SynaptosoftMini Analysis v.6PSCs
Normal Dermal Human FibroblastsPromoCellC12300
pLenti-Synapsin-hChR2(H134R)-EYFP-WPREAddgene20945
Mercury short-arc lampOSRAMHBO 103 W/2
が含まれています 352096の測定用

参考文献

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