ラジアルモビリティおよびレトロウイルス複製ベクター形質導入、非付着Alloresponsive Tリンパ球の細胞傷害機能

Summary

細胞沈降マニホールド/スライド装置を使用して、非接着性免疫細胞の放射状移動度をin vitroで監視するプロトコルを記述します。細胞遊走は、腫瘍細胞の単層または細胞外マトリックスタンパク質で追跡されます。光学顕微鏡と蛍光顕微鏡による検査により、細胞の移動性や細胞毒性機能を観察することができます。

Abstract

まず、蛍光標識、非接着性ヒトまたはマウスエフェクター免疫細胞の運動性を測定するために、細胞外マトリックスタンパク質に付​​着した腫瘍細胞の半径方向移動を測定することが報告され、ラジアル単層細胞移動アッセイの新規適応を報告する。この技術は、ステンレス鋼製マニホールドと10ウェルテフロンスライドが局所的にコンフルエント腫瘍細胞単層または細胞外マトリックスタンパク質のいずれかを用いて調製したウェルに非接着T細胞を堆積するために使用する。光および/またはマルチチャネル蛍光顕微鏡は、経時的にエフェクター細胞の移動および動作を追跡するために使用される。蛍光色素および/または蛍光の導入遺伝子のためのコードは、示差的イメージングのための細胞型を標識するために使用されるウイルスベクター。この方法は、スライドチャンバー、寒天またはトランスウェルプレートを利用して、水平または垂直の遊走/浸潤を追跡するインビトロアッセイにおいて同様の型と区別される。アッセイは、詳細な撮像データをbを可能にする特定の蛍光マーカーで区別異なる細胞型で集めE;細胞（ すなわち 、形質導入し/形質導入された）であっても、特定の亜集団を監視することができる。表面強度の蛍光プロットが移行細胞型に対応する特定の蛍光チャネルを使用して生成される。これは、特定の時間に非接着性免疫細胞の移動性の良好な視覚化を可能にする。それは同様に、標的細胞へのエフェクターのようなウイルスベクターの細胞毒性または転送などの他のエフェクター細胞機能の証拠を収集することが可能である。したがって、この方法は、研究者が微視的に様々な種類の接着性細胞を示差的に標識され、非接着性の細胞間の相互作用を記録することができる。このような情報は、機能の視覚的な証拠は、癌治療のためのそれらの使用の前に腫瘍標的細胞に所望される生物学的に操作されまたは活性化免疫細胞型の評価に特に関連し得る。

Introduction

ラジアル単層細胞遊走アッセイは、本来細胞外マトリックス（ECM）タンパク質^5-7またはフィブロネクチンまたはラミニン^1,2のような個々のECM成分でコーティングされたスライド上に付着した腫瘍細胞^1-4の浸潤特性を測定するために開発された。技術は、ステンレス鋼、細胞沈殿マニホールド（CSM）を使用して、ウェルの中心における腫瘍細胞の単一細胞懸濁液を播種関わる。沈降した後、腫瘍細胞がウェルの底に付着すると、経時的な最初の細胞集団の直径の変化は、水平運動の速度を確立するために使用した。ラジアル単層細胞遊走アッセイは、細胞のインビトロ渡り鳥の能力をアッセイするトランスウェルプレートを採用し、他の既存の方法より視覚的な利点を提供した。これらのアッセイは、イメージング⁸非資する。同様に、それはまた、時点の選択の自由度を多量に提供移行が、評価される時点の数に制限して、研究者が沈降した後の画像に選択することができるときだ。

移行する能力は、特に免疫療法の領域、またはどこにウイルスベクターのための送達ビヒクルとして使用することができる、非接着細胞のために重要な機能であるため、我々は、非接着性細胞の遊走を評価するためにCSMを使用するように適合ECMタンパク質に加えて、腫瘍細胞の単層上型。顕微鏡的に、または個々のECMコンポーネントの腫瘍から単離された複雑なECMに、生存腫瘍細胞単層上の非付着性細胞の遊走を可視化するという追加の利点は、このアッセイは、汎用性になる。シングル細胞外タンパク質でコーティングしたウェルを採用するアッセイは正確に細胞が生体内で通って移動したいのECM組織基質または腫瘍を反映するものではありません。

ここでは、主要なhistocompに感作、アロ反応性細胞傷害性Tリンパ球（alloCTL）を使用一方向混合リンパ球腫瘍細胞反応（MLTR）または私達の代表的な非付着性の細胞型などの混合リンパ球反応^{（MLR）9を}使用して、複合体（MHC）タンパク質atibility。我々は両方のヒトおよびマウス由来の細胞をテストした。移行が腫瘍単層上で測定したところ、採用された腫瘍細胞は部分的に関連する標的は、MHC分子の完全なセットのエフェクター、または完全に関連する標的を、感作するために使用される細胞集団に見られるのと同じMHCタンパク質の一部を表示し、あったことエフェクターは、向かって感作されていた。いくつかの実験では、エフェクター細胞および標的細胞を区別するために、蛍光CellTrackerレッドCMPTXまたは細胞増殖色素eFluor 670を使用する。我々はまた、細胞を可視化するための追加の方法などの蛍光タンパク質のためのウイルスベクターのエンコーディングで形質導入を使用していました。特定のアッセイのために、私たちはエメラルドグリーン（EMD）蛍光タンパク質^10,11をコードするレトロウイルスの複製ベクター（RRV）でalloCTLを形質導入した。 OTH用ERSは、腫瘍細胞をmStrawberryをコードするレンチウイルスベクターで形質導入した。

alloCTLは、腫瘍細胞単層から回収した腫瘍細胞の単層またはECMのいずれかの中心にマニホールドのチャネルを介して播種した。接着性および非接着細胞の相互作用は、光によって、および/または経時的な蛍光顕微鏡によって可視化した。ハイパワーで断片化した核を有する低電力での腫瘍細胞の単層、または腫瘍細胞の混乱は、それぞれ、溶解およびアポトーシスによる細胞傷害の指標であった。我々は、デジタル的に、単層培養上の非付着性蛍光T細胞の遊走を示す表面強度の蛍光マップを作成した。我々はまた、細胞傷害性がオーバーレイ非接着alloCTLのクラスターを形成した後に接着性神経膠腫細胞の単層に生ん留意。同様に、神経膠腫の単分子層へalloCTLからRRV-EMDの水平伝達が観察された。

Protocol

1.スライドさせて準備

1. 滅菌パウチに細胞沈降マニホールドのスライドを挿入し、オートクレーブテープで密封する。井戸のプラスチック製の堆積物を回避するために、ポーチのスライド紙側のテフロンコーティングされた側に直面しています。
2. 121℃で15分間オートクレーブパウチ。
3. 無菌の150×15ミリメートルの滅菌ペトリ皿にバイオセーフティキャビネット及び場所内部の滅菌袋からスライドを削除します。 4スライドまで一品ごとに収めることができます。スライドの隣に35×10ミリメートルペトリ皿を置きます。加湿を提供するために、滅菌H ₂ O 2〜3mlのを追加します。
4. ポリ-D-リジンプレコートスライドを、100μg/ mlのウェル全体をカバーするために十分な容量を使用することによって。 RTで1時間後、この溶液を吸引し、ウェルの表面上に1×PBSをピペットでよく二回の表面をすすぐ。
5. 必要に応じて、より強力な腫瘍細胞の接着を確実にするために、フィブロネクチンまたは他のECM成分を追加する。十分なボリュームTHA中5μg/ mlのフィブロネクチンを追加ウェルを、室温で短時間に乾燥させないであろうトン。
   1. 1時間後、残りのソリューションを吸引し、ピペッティング1X PBSで二回洗浄します。
6. 腫瘍はめっきの準備ができるまでウェル上にPBSにしてください。使用して、同じ日にスライドします。
7. 所望の接着性の腫瘍細胞型のコンフルエントなフラスコを収穫する。 10％ウシ胎児血清（FBS）と適切に緩衝成長培地たとえば5×10 ⁶細胞/ mlで、ダルベッコ最小必須培地（DMEM）で光学顕微鏡を再懸濁することによってトリパンブルー色素排除を使用して生存細胞を計数、L-グルタミンおよびピルビン酸ナトリウム。
8. 付着性細胞集団の蛍光イメージングが所望される場合、重要な蛍光色素または製造業者によって提供されるプロトコルに従って、細胞増殖色素で接着細胞集団を標識する。
9. スムーズにWEL内の気泡を作成しないように注意しながらスライドの各ウェルに完全培地を10μlピペットlsは、このような均一な腫瘍細胞の付着を防ぐことができる。
10. 各ウェル（ 図1A）内の培地に2.5〜5.0×10 ⁴細胞（細胞懸濁液5~10μl）を加える。腫瘍細胞のタイプおよび所望の成長の日数に応じて最適な数を調整する。より大きな腫瘍細胞または急速に成長している細胞は、最初は少ない細胞を必要とするかもしれない。細胞の均一な分布を確実にするために、上下の媒質とピペットを追加することによって、40μlの、最大ウェル容量を持参。
11. 全てのウェルを播種された後、腫瘍細胞は、室温で付着させ、次いで、150×15mmのペトリ皿に蓋を配置し、慎重に37℃で少なくとも24時間/ 5％CO ₂の加湿インキュベーターに皿を動かす。
12. 毎日の培養液を変更します。慎重に単層から使用済み培地の一部をピペットで、新鮮な完全培地と交換してください。
    注：蒸発するので、より多くのボリュームを取り出したよりも追加する必要があります。ウェルズは、アッセイのために準備ができても、confl細胞のuent層が存在する。これは1〜3日最初の播種後に、通常である。
13. ステップ1.4で説明した単層が望まれる場合、手順2に進み、または単層からECMタンパク質を抽出するために、以下の1.13ステップのいずれかとして、PBSで軽く一回単層を洗浄します。
14. 完全培地中0.5％のTriton-X（v / v）の溶液を作製し、各ウェルに30μlを添加する。単分子層は、上述したように、ピペッティングにより完全培地で2回洗い、次いで、2分間フードダイジェストう。
    NOTE：ECM層は光学顕微鏡（ 図2）で見ることができる。すぐにスライドを使用するか、または1〜2日間の加湿CO ₂インキュベーター内で完全培地中で維持する。井戸を乾燥させないでください。

スライド上に非接着T細胞の2沈降

1. 非付着性細胞集団の蛍光イメージングが望まれる場合、そのようなCFSE、セルトラッカーレッドCMPTX、またはeFluorとして、重要な蛍光色素との非接着細胞集団を標識アッセイの前に、製造業者は、少なくとも1時間により提供されるプロトコルに従って、670。あるいは、ウイルスベクターによってコードされる蛍光タンパク質を発現するように細胞を操作する。
2. 上記1.2に記載されるようにオートクレーブポーチに細胞沈殿マニホールドオートクレーブ。
3. 生物学的安全キャビネット内のインキュベーターと場所からテフロンコーティングしたスライドを含む加湿チャンバーを削除します。
4. 上下にピペッティングすることによって1×PBSでウェルを洗浄し、その後、少なくとも10％血清を含む完全培地45μlを添加する。
5. 滅菌エンベロープからマニホールドを取り外し、慎重にスライドします（ 図1B）の底部に接触しマニホールドの最後に「フック」まで、井戸の上でスライドさせます。
6. 培養培地は、チャネルのそれぞれに表示されていることを確認してください。何も見られない場合は、マニホールドを脱いでも対応する、より多くの媒体を追加し、その後交換して、再度確認してください。
7. 各ちゃんを繰り返しステップ2.5チャンネルマニホールドの、または多数のウェルに所望される。
8. 1.0-2.0×10 ⁵ /μLを下回らない非接着細胞を再懸濁を数える。細胞の1μLを策定し、ゆっくりチャネル（ 図1C）にそれらをピペット。よく目的のそれぞれについて、これを行います。
9. チャンネル内の細胞が落ち着くことができるように20〜30分間のバイオフードの内側、 すなわち 、マニホールドやスライド、セル全体ロードされた装置のままにしておきます。
10. 細胞を乱さないように、局所的に井戸の中央に播種し、両端に触れ、ゆっくりとまっすぐスライドから、それを持ち上げてマニホールドを取り外します（ 図1D）。
11. 非接着細胞が正常にうまくマニホールドチャンネルの円周内に留まるの中心で播種されたことを確認するために、各ウェルを点検。非接着細胞は、理想的にはわずか従って穏やかに細胞ペレを引き起こさないの周りにスライド移動する、単層またはECMに、互いに付着する分散させるトン。スライドをモーターボーないでください。

3.蛍光顕微鏡

1. 沈降が確認された後に適切な実験装置では、撮像を行う。理想的には、CO _2、湿度室が装備されている顕微鏡を使用しています。低電力、 すなわち 、4X、または10Xの画像、ウェルの全体を見ることができるように、複数の画像より広い領域を撮影することを可能にする。
2. 画像キャプチャソフトウェアを使用してデジタル画像を取得する。明視野および/またはマルチチャネル蛍光画像化を行う。
3. 必要に応じて、一定の面積以上の異なるチャンネルに画像を記録する、または、加湿、37℃/ 5％CO ₂インキュベーター内でスライドを維持し、手動で（ 図所望の時点で、イメージに取り出すことタイムラプスを設定長い時間点に推奨1E＆F、）。

4.分析と表示

1. 画像編集ソフトウェアを使用して、光をマージとfl1層への蛍光増像ので、複数の細胞型およびマーカーは、同じ画像で見ることができます。ドラッグアンドプログラムに個々の色の画像ファイルをドロップして、プロンプトが表示されたときに、複数のレイヤーを持つ画像ファイルを作成するには、「レイヤーの追加」オプションを選択します。
   1. より高い倍率では、取る合わせ、デジタルでよく一緒に渡って画像をステッチ。二つの画像の保存領域を見て、完全な画像が生成されるまで、他の上に一つの画像を重ね合わせることによって、ファイルの位置を合わせます。
2. 個々の細胞が移動した距離を決定するためにキャプチャソフトウェアを使用して取得時に画像へのミクロンバーを追加します。
3. 、様々な時点で細胞遊走を決定する蛍光T細胞凝集または経時的に広がるを定量化するために、 すなわち、イメージソフトウェア、ImageJを用いて表面強度の蛍光マップを作る。
   1. 表面プロットを生成するには、ステップ4.1でとレイヤーウィンドウの下に生成された層状の画像を取ること、所望のチャンネルに対応したものを除くすべてのレイヤーをオフにします。サーフェスプロットは、EMDの発現を可視化することが望まれる場合、インスタンスの場合は、このマーカーに使用するフィルタに対応する唯一の「グリーン」の層が見えるはずです。
   2. 画像を平らにし、識別されたファイル形式で保存（ 例えば 、.pngの）とプログラムにイメージをロードします。表面プロットを生成するには、8ビットに画像の種類を変更するバックグラウンドを低減するために、必要に応じて明るさ/コントラストを変更し、「/表面プロットを分析する」オプションを選択します。 図5の画像は、「日陰」、「軸を描く」、「Oneポリゴン毎のライン」、および「滑らか」のチェックボックスをチェックすることによって作製した。
   3. また、時間ゼロで焦点セル預金からの半径または直径を使用して測定を行うと、異なる時間に、最も外側の点で細胞に比較します。テフロンウェルの直径は6.0 mmである。

Results

蛍光タンパク質をコードするウイルスベクターに加えて使用することができ、または代わりに、蛍光染料。ウイルス形質導入は、運動性アッセイの前に行われるべきである。接着性および非接着性細胞型の両方の差動標識することができる。形質導入のためのプロトコルが使用されるベクターのタイプに依存する。ここでは^、12に記載のプロトコルを用いたアッセイに先立って、図 RRV-EMDと3,5と6、少なくとも2日間でalloCTLを形質導入した。また、mStrawberry赤色蛍光タンパク質（ 図4）を発現する腫瘍細胞を形質導入するために、レンチウイルスベクター、CMV-ストロベリー-IRES-FLUC2を使用する。この伝達は、新鮮な培地を添加した時点で48時間、細胞をフラスコにベクターを加えることによって達成された。細胞を2日間回復させた後、限界希釈100％形質導入された細胞の集団を生成するために実施した。

（図3、図5）。蛍光顕微鏡...

Discussion

単一細胞懸濁液中の腫瘍細胞を、テフロン（登録商標）マスクされたスライドのウェルにピペットで入れた。細胞が付着させ、次いで加湿した5％CO _2、37℃インキュベーター（ 図1A）で単層を形成した。単層から派生設立単層またはECMタンパク質は、これらのアッセイ（ 図1B）のために収穫することができた。 EMDをコードするベクターを用いて重要な蛍光色素で標識されたまたは形質導入されたエフェクターTリンパ球は、十分にCSMを使用しての中央に播種した。経時的な単層又はECMタンパク質に移行するための非接着性エフェクターTリンパ球の能力を評価し、光及び蛍光顕微鏡を用いて定量した。ここでは、部分的に関連する標的U-87MG神経膠腫細胞の単層上に非接着性エフェクターalloCTLの遊走及び細胞毒性を評価した（ 図3および図5）。これらの標的細胞のみヒト白血球抗原の一部を表示するオリジナルの刺激物質に見出さ（HLA）分子（HLA-A2、B44）は、関連する13から06-MG標的細胞（HLA-A1,2...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
テフロンマスク顕微鏡スライド	創造的な科学的方法	CSM002
細胞沈降マニホールド	創造的な科学的方法	CSM001
ペトリ皿、150mm	コーニング	430597
ペトリ皿、35mm	コーニング	430588
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)	Mediatech	21-040
20 μl ピペットマン	ギルソン	F123600
200 μl ピペットマン	ギルソン	F123601
200 μl ピペットチップ	VWR	89003-060
蒸留脱イオン水 (滅菌)	Mediatech	25-055
Celltracker Red CMPTX	Invitrogen	C34552
TrypLE Express (オプション)	Gibco	12604
腫瘍細胞培養培地 (例DMEM)	Mediatech	10-013
AIM-V 無血清培地	Invitrogen	12055-083
ウシ胎児血清	Omega Scientific	FB-02
倒立顕微鏡
SPOT 先端	診断機器
Poly-D-Lysine	Millipore	A-003-E
フィブロネクチン	BD	354008
31/2 x 51/4 オートクレーブポーチ	Crosstex	SCXS2
Trypan Blue	Mediatech	25-900-CI
Cell Proliferation eFluor 670	eBioscience	65-0840-85
ImageJ	NIH