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方法論記事

タンパク質の共発現の多面的メリットで

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DOI:

10.3791/52431

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2015年2月5日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacy and Biotechnology, University of Bologna, 2CSGI, Department of Chemistry, University of Firenze

この記事について

サマリー

タンパク質共発現は、タンパク質複合体のin vitro再構成に対する強力な代替手段であり、in vivoでの生化学的および遺伝的検査を行うのに役立ちます。ここでは、大腸菌におけるタンパク質共発現を用いてタンパク質複合体を取得し、細胞の突然変異頻度を調整する方法について報告する。

要約

ここで報告します。これは、大腸菌における生体内のタンパク質複合体の発現が、従来のin vitroでの再構成実験よりも便利であることを報告します。特に、大腸菌DNAポリメラーゼIII εサブユニット(3'-5'エキソヌクレアーゼ活性を特徴とする)の低溶解性は、同じタンパク質をαサブユニットおよびθサブユニット(それぞれDNAポリメラーゼ活性および安定化εを特徴とする)と共発現すると、大幅に改善されることを示しています。また、大腸菌におけるタンパク質共発現を使用して、さまざまな細菌種からのサブユニットが機能的なタンパク質複合体で会合する能力を効率的にテストできることも示しています。私たちは実際に、Deinococcus radioduransDNAポリメラーゼIIIのαサブユニットが、大腸菌のεサブユニットとin vivoで共発現できることを示しています。さらに、大腸菌の突然変異頻度を調節するためのタンパク質共発現の使用について報告します。araBADプロモーターの制御下で野生型<[>サブユニットを発現させる(アラビノース誘導性)し、lacプロモーター(イソプロピル-チオ-β-D-ガラクトピラノシド、IPTGによる誘導性)の制御下で、野生型εサブユニットを共発現させることで、誘導剤アラビノースとIPTGの適切な濃度を使用して大腸菌の突然変異頻度を変更することができました。最後に、大腸菌におけるタンパク質共発現の最近の進歩と将来の課題について説明します。

概要

過剰発現技術の導入は、低コピー数の酵素の生化学的研究および薬理学的に活性なタンパク質（ 例えば、インスリン）の工業的製造のいずれかをブースト。これらの技術の出現以来、重要な進歩は、組み換えタンパク質の収量と品質を高めるために達成された。さらに、原核生物および真核1,2 3過剰発現システムは、タンパク質バイオテクノロジー、 すなわち、大腸菌の「作業馬」に有用な選択肢を提供し、長年にわたって開発された。 E.の代替プラットフォーム特に、可用性大腸菌は、翻訳後修飾を有する組換えペプチドまたはタンパク質の産生をもたらした。しかし、E.ことが言及されるべきである大腸菌は依然として組換えタンパク質生産のための選択の生物を表す。これは最も関連があることができ、その中のいくつかの要因によるものであると考えた：i）過剰発現システム（発現ベクターおよび菌株のかなりの数の可用性が）E.のために大腸菌 1,2。 ii）の短い世代時間を、高いバイオマス収量、E.の豊かで合成様々なメディアで大腸菌 。 ⅲ）生化学的で、その微生物の遺伝子レベルでのいずれかの容易な操作。 iv）の毒性タンパク質4の産生が可能な株の単離を、 v）が集団レベル5,6で均質誘導を搭載株の構築。また、最近E.生産に適した発現系が示された翻訳後修飾タンパク質の大腸菌が考案2を構成することができる。

現在では、タンパク質の過剰発現は、主にそのhypersynthesis適切なプラスミドにクローニングし、単一の遺伝子を用いて行うことができる単量体またはホモオリゴマータンパク質を得るために使用される。ただし、注意が最近だったEの建設に支払わヘテロオリゴマー複合体2の大腸菌タンパク質の共発現系、 インビボで 、生産に挑戦。興味深いことに、タンパク質の同時発現の初期の実験では、シアノバクテリアのリブロース-1,5-ビスリ ​​ン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ7,8、及びHIV-1の切断型および全長型の関連性の大小サブユニットの種間組立体を取り上げ転写酵素9の逆。これらの先駆的な研究は、タンパク質の共発現は、in vitro再構成における伝統的に強力な代替手段を表していることを実証した。加えて、タンパク質の共発現E.で大腸菌は、非天然アミノ酸2を含有するタンパク質を得るために、翻訳後修飾2を有する異なるタンパク質を生成するために、及び過剰発現した膜タンパク質2の収量を増大させるために使用した。また、ツールとしてのタンパク質共発現の電位はEに付与するコリが競うタンパク質分泌におけるNCEは、アクティブな捜査2の下にある。

E.におけるタンパク質共発現の二つの主な戦略大腸菌を追求することができます：ⅰ）単一のプラスミドの使用が過剰発現されることが異なる遺伝子をホストする。 ii）は、単一セル内の複数のプラスミドの使用は、標的タンパク質を同時発現する。タンデムプロモーター/オペレーター要素を含む特定のプラスミドを共発現10のために構築されたが、最初のケースでは、プラスミドの選択の基準は、従来の単一のタンパク質の過剰発現実験のものと異ならない。この最初のアプローチは、したがって、非常に簡単です。しかし、異なるタンパク質を共発現する単一プラスミドの使用は、二つの主要な困難に直面していることが言及されるべきである：i）の共発現されたタンパク質の数を制限するホストされる遺伝子の数を有するベクトルが増加すると、分子量;複数の遺伝子は、単一プロモーターの制御下にクローニングされた場合ii）は、極性がdecreasできプロモーターから遠位の遺伝子の発現を電子。シングルE.でデュアルまたは複数のプラスミドの使用大腸菌細胞は、従って、プラスミドの適格な組み合わせに制約を課し、選択したベクターとの適合性を達成しなければならない。しかし、この第2の共発現戦略は、ベクターの分子量を含むという利点を備えており、極性が制限される。我々は最近、同時発現プラスミド11との間の遺伝子の往復を容易にするように設計されたタンパク質の共発現系を構築した。特に、我々はPGOODベクトルシリーズを構築し、関連する機能には、そのうちのは、i）p15A複製起点は、市販のベクター（ 例えば、のpBADシリーズ12）のColE1起点を含むとPGOODプラスミドの互換性を提供する。 ⅱ）テトラサイクリン耐性カセット。 ⅲ）LACの存在は調節エレメント、 すなわち、プロモーター-オペレーター（O 1）夫婦とのlacIの由来 q遺伝子 。適切なのpBAD-PGOODのカップルを使用して、我々はEの触媒コアを過剰発現することができました三つの異なるサブユニット、 すなわち α（5'-3 'ポリメラーゼ）、ε（3'-5'エキソヌクレアーゼ）とθ（εを安定化する）13から構成される大腸菌 DNAポリメラーゼIII、。特に、我々はαεθ複合体の共発現はE.のほかに厳密に依存することを実証したIPTGおよびアラビノースの両方の大腸菌培養培地、PGOODとのpBAD、それぞれ（ 図1A）からトリガ過剰発現。

今回の報告では、タンパク質の共発現を効率的にタンパク質複合体のサブユニットの乏しい溶解性にリンクされて困難を解決することができる方法を示しています。さらに、我々は、in vivoでのタンパク質相補性試験を行うことができ、我々は最終的にE.で調整変異頻度のタンパク質の共発現の使用について報告する方法を示しコル私は。この目的のために、私たちはそれぞれのケーススタディの関連する例を説明するために、適切なPGOOD-のpBADのカップルを使用していました。

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プロトコル

E.の単離大腸菌共同形質転換体

  1. 適切なE.のエレクトロコンピテント細胞を準備大腸菌株は形質転換される。選択した菌株の単一コロニーを1mlのLB培地（トリプトン、酵母エキス、10時のNaCl、5、および10gのそれぞれ/ L）に移し、180rpmでの条件を振盪しながら37℃でインキュベートする。新鮮なLB培地25ml中で500し、37℃で培養物をインキュベートする：前培養1希釈する。
  2. 対数期（OD 0.6）で20分間、5000×gで）で細胞懸濁液を遠心分離し、元の培養体積の半分に10％（v / v）の氷冷滅菌グリセロール、水にペレットを再懸濁する。たびに再懸濁体積を半分に、この手順を4回繰り返します。最後に、グリセロール/水にペレットを再懸濁し、50μlのアリコート中の細胞懸濁物を分割する。 6ヶ月までのCまで-80℃でアリコートに保管してください。
  3. 0.5 mMのEDTAを添加し、滅菌水で所望のプラスミドに溶解する。 IC上に解凍電子エレクトロコンピテント細胞のアリコートとベクトルの適切な量（2.5〜NG）と混合。エレクトロポレーションに適した0.1cmキュベットに混合物を分配し、1.8 kVのを適用します。
  4. 直ちに（w / vグルコース0.2％、10のMgCl 2、2.5mMのKClを補充したLB培地）を、振とうしながら1時間インキュベートSOC培地1ml中にエレクトロポレーションした細胞を転送し、最終的に含むペトリ皿に100μlのアリコートを転送する適切な抗生物質を含むLB寒天。 37℃でO / Nインキュベートします。
  5. ペトリ皿上で単一のコロニーをストリーキングによって形質転換体を精製する。
  6. 一次形質転換体のエレクトロコンピテント細胞を準備し、繰り返しをさらにプラスミドで形質転換するために1.1から1.5のステップ。
  7. 共同形質転換体のグリセロールストックを準備します。適切な抗生物質を添加したLBで単一コロニーを移し、振とうを37℃でインキュベートし、対数期（0.6 OD）遠心分離機20分間5000×gで細胞懸濁物で。 R培地を15％（v / v）のグリセロールを含むLB-抗生物質ペレットをesuspend。一定分量で分注し、で保存して - 80°C。

2. Eのαおよびεサブユニットの共発現大腸菌のDNAポリメラーゼIII

  1. 無菌ループで適切なストレイングリセロールストックを少量転送（ 例えば、TOP10 / PGOOD-ε243及びTOP10 / PGOOD-ε243-θ/pBADα1160、 図1を参照）LB培地と抗生物質を含むペトリ皿に。ペトリ皿に細胞懸濁液の乾燥をしましょう​​、とストリークは、細胞は、液滴。 37℃CO / Nでインキュベートする。
  2. 無菌の爪楊枝、LB-抗生物質培地1mlに単一コロニーを使用して転送、。 37℃で8時間インキュベートする。新鮮な培地に500と15時間30℃でインキュベート：前培養1希釈する。
  3. IPTG、アラビノース、またはアラビノースおよびIPTGを追加し、1 mMの各。 2.5時間30℃でインキュベートする。細胞を回収し、-20℃でのペレットを保存する。
  4. 溶解緩衝液（50mMトリス-HCl、50mMのNaCl、1mMのEDTA、2.5mMのジチオスレイトール、1mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）、pH8）中で再懸濁し、氷上に解凍ペレット。静かに冷たいガラスポッターと細胞懸濁物を均質化する。
  5. 15秒の冷却間隔（4サイクル）、続いて15秒間15 W、で超音波処理。
  6. 可溶性画分を回収し、4℃で、20分間、10,000×gでの総タンパク質抽出物を集める。
  7. SDS-PAGE（12.5％アクリルアミド）各可溶性タンパク質抽出物のアリコートにより分析する。この目的のために、H 2 O60μlのローディングバッファー（250mMのトリス-HClを20μlを含むエッペンドルフチューブにそれぞれの可溶性タンパク質抽出物20μLを移す6.8、10 mMのβメルカプトエタノール、10％（w / v）のSDS、50％（v / v）グリセロール、0.25％ブロモフェノールブルー（w / vの））と、5分間沸騰させる。ロード各サンプルの18μlの約1.5時間、140 Vで電気泳動を行う。

3. Deinococのαサブユニットの同時発現デュランスDNAポリメラーゼIIIおよびεEのサブユニットCUS 大腸菌のDNAポリメラーゼIII

  1. Eの前培養を準備LB-アンピシリンテトラサイクリン培地の1ミリリットル中に大腸菌株TOP10 /のpBAD-αDR / PGOOD-ε243し、37℃で8時間インキュベートする。新鮮な培地中で千をし、37℃でO / Nインキュベート：1希釈する。
  2. アラビノース及びIPTG、1mMのそれぞれ3時間誘導した後、3時間37℃でインキュベート、新鮮な培地200mlに100：1に希釈する。細胞を採取し、-20℃でペレットを保存する。
  3. 50mMトリス - 塩酸pHが8、150mMのNaCl、1mMのEDTA、1mMのPMSFでペレットを再懸濁する。ホモジナイズし、2.4と2.5で説明したように、細胞を破壊。
  4. すぐに細胞が20分間万×gで溶解物遠心する。ペレットを捨てる。ペーパーフィルターの3層を装備したブフナー漏斗で上清をフィルタリングします。穏やかな真空を適用します。過剰な泡立ちを避けるために、濾過の間、氷上で真空三角フラスコに保つ。
  5. ブラッドフォード14に記載のタンパク質濃度を決定します。

4.ゲルろ過クロマトグラフィー

  1. 50mMトリス-HCl、150mMのNaCl、1mMのEDTA、pHをカラムに負荷8の可溶性タンパク質抽出物を有する水ジャケット付き16x70（200）ゲルろ過カラムを平衡化する。最適な解像度の場合は、1ミリリットルサンプルループを使用しています。 /分0.6ミリリットルでクロマトグラフィーを行います。全体で4℃でカラム温度を保つ。
  2. 0.9ミリリットル画分を回収し、SDS-PAGEによってそれらを分析する。ローディングバッファーのH 2 Oおよび20μlの（250mMのトリス-HCl pH6.8の、10mMのβメルカプトエタノール、（v）のSDS、50％（重量/ 10％の60μLを含むエッペンドルフチューブに移し、各関連する画分を20μl v / v）グリセロール、0.25％（w / v）のブロモフェノールブルー）で5分間沸騰。ロード各サンプルの18μlの約1.5時間、140 Vで電気泳動を行う。
  3. 3'-5 'エキソヌクレアーゼと96我々の各画分のDNAポリメラーゼ活性を決定するマイクロプレートLL。基板15としてチミジン5'-一リン酸p-ニトロフェニルエステル（p個の NP-TMP）を使用して、エキソヌクレアーゼ活性をアッセイする。 PPX（ピロホスファターゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、キサンチンオキシダーゼ）、酵素結合アッセイ16を使用して、DNAポリメラーゼ活性を推定し、2-（4-ヨードフェニル）-3-（4-ニトロフェニル）-5-フェニル-2H-テトラゾリウムクロリド（INT）電子受容体16として。

集団E.の共発現する野生型εサブユニットの5変異解析大腸菌 DNAポリメラーゼIIIおよび変異原εD12Aバリアント

  1. Eの単一コロニーを転送LB-抗生物質培地1mlにεをpBAD-とPGOOD1-εD12A11ベクターを含む大腸菌 TOP10。 37℃でO / Nインキュベートします。
  2. 、新鮮な培地を含む3フラスコ（10ミリリットル）で250適切な誘導物質（アラビノース、IPTG、またはアラビノース及びIPTG、1mMの各）を追加し、37℃でインキュベート：前培養1に希釈8時間。パラレル非誘導培養物中に準備します。
  3. 1ミリリットルのアリコートを収集し、その後1希薄：新鮮な培地（10ミリリットル）を含む新しいフラスコ中に500を適切な誘導物質を補給したりしない。 37℃でO / Nインキュベートします。
  4. 繰り返します5.2と5.3ステップと1ミリリットルのアリコートを収集します。
  5. 世代数は、各培養物で発生したかどうかを判別します。 LBプレート、接種材料と文化の適切な連続希釈液100μlに移す。 37℃でO / Nインキュベートします。 （Cを記録）の成長の終わりにLBプレート上のコロニーをカウントし、接種物中に存在する細胞の数の対数を計算する（ ログI）と文化。世代数 ​​を決定するには、式を使用します。（Cログ- 私のログを）/0.301。
  6. 20分間5000×gで遠心分離し、50mMのTris-HCl pH7.6で、50mMのNaCl 1 mlに細胞を再懸濁。細胞を透過するために、20秒間クロロホルムと渦の2〜3滴を追加します。
  7. β-を決定基板としてのpニトロフェニルβ-D-グルコピラノシド（PNPGluc）を用いて96ウェルマイクロプレートの各アリコートのグルコシダーゼ活性、。各ウェルに透過性細胞を100μlおよび100μlの基質（16ミリグラム/ H 2 O中のmlストック溶液）を加える。ウェル内の気泡を避けるように注意してください。マイクロプレートリーダーおよび適切なフィルターを使用して、420nmで吸光度を読み取る。

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結果

Eのεサブユニット大腸菌のDNAポリメラーゼIIIは、243個のアミノ酸からなり、残基187から243が17を削除しない限り、乏しい溶解17,18を備えています。しかし、我々は以前に、完全長のα、εおよびθサブユニットの共発現は、可溶性DNAポリメラーゼIII触媒コア（ 図1）が得られることを示している11。 （ 図1A）は、それぞれ、i）のαおよびεサブユニットの過剰発現は、独立して、アラビノース及びIPTGによって制御することができ、特に、次のpBAD-PGOOD共発現系を使用して、我々は以下のことを証明したii）の完全長のεサブユニットはE.から単離された可溶性タンパク質抽出物中で検出することができる大腸菌細胞はε、α、θ及びゲルろ過（ 図1B）にかけ過剰発現する。この場合、エキソヌクレアーゼ活性は、3つの主要なピーク（ 図1B、黒丸）に分配し、そしてピークは...

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ディスカッション

タンパク質は、その三次構造の立体配座25の限られた数に制限されていない領域が特徴、本質的に無秩序であることができる。これらの無秩序のタンパク質は、通常、25を凝集する傾向があり、それらの単離および特徴付けは困難なタスクを表すこと。 Eのεサブユニット大腸菌 DNAポリメラーゼIIIの機能つの異なるドメイン、すなわち26,27、は、i）N-スタドメインを、3'-5 'エキソヌクレアーゼ活性を有する、およびθサブユニットの結合の管轄。 ⅱ）C-TERドメイン、α（ポリメラーゼ）サブユニットへの結合に関与。 εのC-スタドメインの凝集を促進し、このタンパク質に乏しい溶解性を付与することが知られている。これは、実際にε-186、C-スタドメインを欠くタンパク質の切断型は、可溶性であり、かつ高い収率17で精製することができることが実証された。しかし、αとεとの相互作用を定量的に検討する必要があるとき（ 例えば、αε複合体のK Dを決定するために）、完全長εの精製が困難な...

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開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

数字を再印刷するスプリンガーとエルゼビアの許可が大幅に認められている。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
寒天Sigma-AldrichA1296
アンピシリンSigma-AldrichA9518
クロロホルムSigma-Aldrich288306
EDTASigma-AldrichEDS
グリセロールSigma-AldrichG5516
INTSigma-AldrichI8377
IPTGSigma-AldrichI5502
KClSigma-AldrichP9541
L-アラビノースSigma-AldrichA3256
MgCl2Sigma-AldrichM2670
NaClSigma-Aldrich31434
PMSFSigma-AldrichP7626
PNP-glucSigma-AldrichN7006
pNP-TMPSigma-AldrichT0251
テトラサイクリンSigma-Aldrich87128
Trizmaベース Sigma-AldrichT1503
TryptoneSigma-Aldrich95039
酵母抽出物Fluka70161
アクリルアミド溶液 30%BioRad161-0158ゲル電気泳動用
ソルフェートアンモニウムBioRad161-0700ゲル電気泳動用
GlycineBioRad161-0718ゲル用電気泳動
SDSBioRad161-0302ゲル電気泳動用
TEMEDBioRad161-0800ゲル電気泳動用
TrisBioRad161-0719ゲル電気泳動用
キュベット 0.1 cmBioRad1652089電気穿孔用
遠心分離機 5415Rエッペンドルフ
遠心分離機 Allegra 21RBeckman
クロマトグラフィー装置 GradiFracPharmacia Biotech
Gene Pulser II エレクトロポレーションBioRad
マイクロプレートリーダー 550Biorad
MiniProtean 3 セルBioRad
電源BioRad
ソニケーター3000ミゾニックス
過

参考文献

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