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方法論記事

アン

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DOI:

10.3791/52436

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2015年1月8日

 ,  , 
1Swiss Institute for Experimental Cancer Research, School of Life Sciences, Ecole polytechnique fédérale de Lausanne

この記事について

訂正のお知らせ

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サマリー

私たちは、ヒト乳癌におけるホルモン作用を研究するための新規のex vivoモデルを開発した。これは、組織構造、細胞間相互作用、およびパラクリンシグナル伝達を維持する外科乳房組織標本から単離された組織の微細構造に基づいている。

要約

ヒト乳癌におけるホルモン作用の研究は、適切なモデル系の欠如によって妨げられてきた。 インビトロ培養の際に、一次乳房上皮細胞は、ホルモン受容体の発現を失う傾向がある。広く使用され、ホルモン受容体陽性乳癌細胞株は、in vivoの状況に限定関連のものである。ここでは、ヒト乳癌におけるホルモン作用を研究するためのex vivoモデルを記述。このような還元mammoplastiesまたはmammectomiesなどの外科廃棄材料からの新鮮なヒト乳房組織標本は、機械的および酵素的に管と小葉及び複数間質細胞タイプを含む組織断片を得るために消化される。これらの組織の微細構造は、それらの間の接触を維持する成長因子を含まない基礎培地中で組織構造を保持し、数日間のホルモン応答性のままである。それらは容易にRNAおよびタンパク質抽出、組織学的分析のために処理または凍結培地中に保存されている。蛍光活性化セルソーティング（FACS）は、特定の細胞集団を濃縮するために使用することができる。このプロトコルは、非常に複雑、多様なヒト検体との翻訳研究のための簡単​​な、標準的なアプローチを提供します。

概要

乳癌における突然変異景観に関する情報は、急速に増加している。以下の注意は、乳癌の発達に影響を与える全身性因子が注目されている。生殖ホルモンへの曝露は、疾患の進行1-3に大きな影響を与えます。しかし、生殖ホルモンはヒト乳房に衝突するメカニズムはよく理解されていない。遺伝子操作したマウスモデルとの仕事は、彼らがいくつかの下流エフェクター4を介して細胞内因性および傍分泌に関与することを明らかにした。

ヒト乳癌におけるホルモン作用についての限られた知識は、適切なモデルの欠如に主に起因している。エストロゲン受容体（ER）およびプロゲステロン受容体（PR）のシグナル伝達のメカニズムのほとんどの作業は、MCF-7およびT47Dなどのホルモン受容体陽性乳癌細胞株を用いて行われた。これらはalreaいた進行乳癌患者からの胸膜滲出液由来したDYは、複数の治療法5を受け取った。ヒト乳房のような単純なin vitroモデルにおける知見の生物学的関連性は、これらのin vitroモデルで識別さ疑わしいとターゲット遺伝子である動物モデル6で識別された標的遺伝子とは異なります。初代ヒト乳房上皮細胞は、インビトロで培養される場合、それらは、ホルモン受容体の発現、したがって、ホルモン応答7,8を失う傾向がある。この問題は、マトリゲルを使用して洗練された3Dアプローチによってcircumventdすることができます。このように、C·クラークらは、ホルモン受容体の発現を維持し、プロゲステロン刺激9に対する増殖応答を示した乳房上皮細胞を樹立することに成功した。しかし、 生体内プロゲステロン受容体標的遺伝子において重要な二つのWnt-4、RANKL、このシステム9プロゲステロン刺激により誘導されなかった。このアプローチは、最近、 インビトロでさらに上に撮影されたのホルモン治療前とRANKL誘導は10を達成した。注意点は、マトリゲルはバッチに依存している活動があることに変わりは高価であり、わずかな細胞数のためになりやすい実験計画を要求する。

インビボでの ERおよびPRシグナル伝達に主としてパラクリン相互作用11によって媒介されるという知見に基づいて、我々は、細胞間相互作用が維持される必要があると主張した。組織は、インビトロ培養のために単一細胞に解離されると失われたもう一つの重要な要因は、細胞外マトリックスと上皮細胞との相互作用である。まだこれらは、上皮分化のために重要であり、その破壊は、腫瘍形成において重要である12。これを念頭において、私たちは新鮮な外科廃棄材13から乳房組織の微細構造を分離する方法を確立した。インナー腔側と外側myoepitheliで二層上皮からなる乳房実質、らの細胞は、脂肪組織から離れて切開し、機械的および酵素的解離に供される。洗浄および遠心分離後、乳管の断片は、多くの間質​​細胞との密接な相互作用を維持することが求​​められる。これらの組織の微細構造は、ホルモン応答残る。モデルは、臨床検体13に検証されました。このように、本手順では、生物学的および臨床的に関連する文脈において乳癌におけるホルモン作用を研究するために助けることができる。

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プロトコル

一般的な考慮事項：前もって、倫理プロトコルを設定するには、患者のためのアンケートを作成し、臨床的な人材の育成に参照してください。削減乳房形成手術から材料を使用する前に、権限を調達し、患者の同意を確保する。組織は、感染し、それに応じて処理する必要があります。実験的癌研究スイス研究所 - このプロトコルはISRECの倫理委員会によって承認された。

1.組織の回復、加工、バイオバンキング

バイオバンキングのための最適なサンプルの品質を確保するために、ステップの数は、実験室に輸送する前に病院で行われる。

病院で：

  1. 必要であれば、縮小乳房形成術および血液試料から無菌条件下で、ヒト乳房組織を得る。組織は、悪性病変の存在を除外するサンプリングする病理学者によって検査される必要がある。
  2. 胸tを置きます無菌のボード上のボンネットの下に発行し、はさみ、外科用メス、すでに蒸気滅菌器で滅菌されたピンセットを準備します。それを開くためにメスを用いて乳房組織の異なる部位で深いカットを行います。黄色の脂肪組織中に埋め込まれている管および小葉からなる白色ストランド、ヒトの乳房組織の外観である。
    注：黄色の脂肪組織に白の実質の比率は、女性の間で異なっている。一般的に若い女性がより多くの上皮組織を持っている。
  3. その後はさみで脂肪組織から優しくそれらを分離、白い材料片を選び、鉗子でそれらを保持する。血管を取ることは避けてください。
  4. 血液を除去するためにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）pHが7.2で組織片をリンスする。と1％のAN（5000単位/ mlのペニシリンおよび5000グラム/ mlのストレプトマイシンを含む）2％ペニシリン/ストレプトマイシンとフェノールレッドを含まないF12培地（ダルベッコ改変イーグル培地F12）を含む250ミリリットルのペットボトルに組織を転送tibiotic /アンホテリシンBは、（10,000単位/ mlのペニシリン、ストレプトマイシン10,000 / mlの、およびアムホテリシンB25μg/ mlを含む）。研究室への輸送のための媒体で保管して組織。
  5. 冷たい（ドライアイス）イソペンタンでクライオバイアルでそれらを凍結するRNAとタンパク質の抽出およびフラッシュ用の直径5mm - 3の部分を準備します。研究室への輸送のためにドライアイスボックスに転送する。
  6. 金型には5mmと最適切削温度（OCT）の層でそれをカバーして、冷たいイソペンタンで満たされた箱の平らな底に金型を配置 - 3のピースを置く。完全な凍結後にドライアイスボックスに金型を転送する。
  7. ホルムアルデヒド中でパラホルムアルデヒドで直径5mm（PFA）4％と、他の5個（FA）後でRT組織学的分析では、PBS中4％ - 3の5作品を修正する。いくつかの抗体は、より良い1つまたは2つの相互に働くように、2つの異なる固定剤を推奨します。

研究室では：

  1. やる、削減乳房形成に関するすべての情報をcument手術日とサンプルが右乳房対左から派生しているかどうか。
  2. -80℃で凍結サンプルを配置し、固定の2時間後に組織学カセットに固定した組織を移す。その後、4℃でO / N保存のために、PBS中70％エタノールのいずれかに置く。翌日、パラフィン包埋のため組織学施設に組織学カセットを転送する。

2.組織消化とホルモン刺激

  1. P2の細胞培養室で層流キャビネットに組織サンプルを含むボトルに移す。無菌のまな板（29×19 cm）の上の組織片を置きます。鉗子で材料を保持し、メスで離れて乳房実質（白い部分）から残りの脂肪と血管をこすり。 10cmの培養皿にPBSに白色物質を配置します。
  2. すべての部分からの脂肪物質を除去し、安全性の規則に従って、それらを配置した後研究室のSは、バックチョッピングボード上の上皮組織を含む白色パーツを配置。対向するメスを使用して、組織を切断し、最大直径2mmの断片に切る。
  3. 適切なサイズのチューブにみじん切り素材を配置：1、2.5及び10ミリリットルまでを5、15または50ミリリットルチューブに、それぞれ。典型的には、5 mlチューブ利回り十分なパラフィン埋め込みやホルモンの刺激のための材料、および蛍光活性化細胞のための15ミリリットルチューブ利回り十分な材料選別（FACS）。より大きなチューブは分量を凍結するために使用されている。
  4. 1％ペニシリン/ストレプトマイシン/アンホテリシンBおよびコラゲナーゼA（ ヒストリチクス菌からClostridiopeptidase A）と培地からなる消化マスターミックス（フェノールレッドなしのDMEM / F12）を準備します。消化時間に応じてコラゲナーゼ線量。
    1. 12、24、インキュベーションの36時間、1.5 mg / mlで、1.0 mg / mlのおよび0.5mg / mlのそれぞれのコラゲナーゼの最終濃度を使用する。の4倍に消化マスターミックスを加える消化された材料の量は、十分な攪拌と通気を確保する。
      注：実験計画とホルモン刺激の継続期間に応じて、中または酵素消化工程および微細構造回復後のいずれかのホルモンを追加します。
  5. サンプルおよびコントロールの車両をテストするために所望の濃度でホルモン（複数可）を追加する。 17-βエストラジオール、及びプロメゲストン（R​​5020）による刺激のために20nmの最終濃度を使用しています。
    NOTE：R5020培地中の天然プロゲステロンよりも安定である合成プロゲステロン受容体アゴニストである。
    1. 37℃のインキュベーターと40 rpmでO / N内部のローラーミキサー上に置きチューブ。ミキサーでサンプルを配置する前に、すべての物質が遠心管に沿って分散していることを確実にするために非常によく再懸濁します。
  6. 消化は12未満の時間のホルモン刺激の回で少なくとも12時間（O / N）をとるように、（微細構造の回復の後にホルモンを追加するデステップ3の下につかれた）。あなたは微細構造を再懸濁し、超低付着プレートにサスペンションを置くようにホルモンを追加します。組織の微細構造は、約70％の生存率を維持する成長因子を含まない培地中で7日間までの超低付着プレートに保つことができる。
  7. RNAおよびタンパク質分析のために、遠心分離管中で5分間フラッシュ凍結、400×gで遠心分離することによって、組織の微細構造を集める。

組織微細構造の3回復

  1. 5分間400×gでチューブ（単数または複数）を遠心する。遠心管の上部から脂肪を吸引し、5分間1250×gで新しい遠心チューブと遠心分離機に、線維芽細胞が濃縮され、残った水性上清、上清を移す。
    注：以降のすべてのステップが軽くチューブを攪拌することによってペレットを再懸濁するために乳房組織の微細構造は、非常に粘着性であるので。ピペッティングは、材料を失うリスクにはお勧めしません。
  2. 微細構造およびPBS、2％ウシ胎児血清（FCS）、水性上清由来の線維芽細胞に富むペレットを再懸濁する。その後5分間1250×gで両方の管を回転した後、上清を捨てる。
  3. 3にペレットを再懸濁 - 5mlの赤血球血液溶解緩衝液チューブを洗浄するためにそれらを転送する。室温で5分間のためにそれらをインキュベートします。
  4. PBS、2％FCSの2倍のボリュームを追加し、5分間1250×gで、それらを遠心する。 5分間1250×gでPBS、2％FCSおよび遠心機でペレットを洗ってください。二回、この手順を繰り返します。

フローサイトメトリー用4.サンプル

  1. ペレットに0.25％トリプシン2ミリリットル、細胞を解離するために千μlのピペットマンで2分間非常に優しく上下にピペッティングすることによって、それをミックスして - 1を追加します。
  2. 9ミリリットルPBS、2％FCSを添加することにより、トリプシン活性を阻害する。 5分間450×gで遠心分離し、10mlのPBS、2％FCS中でペレットを再懸濁。
  3. トンに置か40μmのセルストレーナー上に細胞懸濁液を転送単一の細胞を調製するための50mlの遠心分離管のオペアンプ。細胞懸濁液を数マイクロリットルのフィルターの上部に残っている場合、それらは、ピペットでストレーナの反対側からそれらを吸引することにより、フィルタを通過し、濾過した微細構造に追加助ける。
  4. その後、別個の免疫細胞、抗CD45のカクテルを微細構造からの線維芽細胞および内皮細胞、抗FAPおよび抗CD31抗体とは、それぞれ、10管腔、基底細胞を分離するための汎上皮マーカーのEpCAMおよびCD10に基づいて、FACSで並べ替える。

組織学のために5.サンプル

  1. 上記のように機械的および酵素的に消化された物質を洗浄した後、室温で30分間PBS中の4％PFAを1mlの1.5ミリリットル初期材料からペレットを固定する。
  2. 5分間1250×gで遠心分離し、および1で洗浄する - 二回2mlのPBS。
  3. 10分間16000×gで遠心分離する。この間、トリス - 酢酸-EDTA（1％多目的アガロースを準備TAE）の緩衝液溶液が沸騰になるまで電子レンジで溶液を加熱する。
    1. 電子レンジから溶液を除去し、溶液を混合し、残りのアガロース粒子を再懸濁させ軽くフラスコを旋回。 50℃に冷却し、アガロース溶液及びパラフィンベースモールド1mlのを注ぐ31×23×13.5ミリメートルの大きさ。
  4. 上清を捨て、固化層の上にペレットを配置 - フラットエンドとのへらを用いてアガロースの（1〜3ミリ）。アガロースの追加層（40℃）でそれらすべてをカバーしています。
  5. アガロースが固化した後、通常は5分以内で、パラフィン埋め込みのための組織学カセットにアガロースブ​​ロックを配置。サンプルは、鉛筆の小さな文字で書かれた削減乳房形成数、実験条件、および日付に関するすべての情報をカセットに白い事務用紙を置き、アガロースとともに。この書き込みは、以降のすべての処理工程に耐える。
  6. にカセットを入れてPBS O / N、または4℃で週末の保存のために70％エタノール中。我々は2つ​​のストレージ·ソリューションとの間に何の違いも気づいていない。そして、パラフィン包埋のために組織学施設に組織学カセットを転送する。

6.凍結微細構造（今後の培養）

  1. 10％のジメチルスルホキシド（DMSO）にFCSからなるとクライオバイアル内の1mLのアリコートを凍結する凍結培地中に再懸濁し、組織の微細構造。得られたクライオバイアルの数が削減乳房形成から得られた一次材料の量に依存します。
  2. 以下のプログラムを用いて制御された速度の冷凍庫を使用して、組織の微細構造を含むクライオバイアルを凍結：5分でC -12℃に温度を下げ、6℃/分の速度で-7℃の温度を下げ、4℃で住居6℃/分、10分住居の速度、6℃/分の速度で-40℃まで温度を下げて-80℃に温度を下げる6℃/分の速度。その後、Cの冷凍庫-80℃に凍結バイアルを転送します。
  3. 翌日、長期保存のために液体窒素タンクに-80℃からクライオバイアルを移す。

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結果

エストロゲンとプロゲステロンの役割を研究するために、より良いヒト乳癌におけるそれらの分子の機能を理解するために、我々は彼らのインフォームドコンセントを得た後に、還元mammoplasties（ 図1）を受けた患者から新鮮なヒト乳房組織標本を収集します。また、手術時の血清プロゲステロンのレベルを決定するために、患者の医学的および出産歴、ならびに血液サンプルを得た。新鮮な削減mammoplastiesからの組織を機械的および酵素的に解離する。得られる組織の微細構造は、原点（ 図2A）の乳房組織の特性管および小葉を持つ。筋上皮マーカーΔNp63（ 図2B）について染色したアガロースおよびパラフィン包埋組織の微細構造の免疫組織化学的分析は、微細構造は、正常な乳房組織の形態学的特徴だけでなく、セルの分子プロフィールだけでなく、保持することを明らかにしたL集団。

ホルモン応答を評価するために、組織の微細構造は、合成プロゲステロン受容体アゴニストプロメゲストン（R​​5020）またはエタノール対...

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ディスカッション

ここで説明するのex vivo培養は、通常、ヒト女性の胸肉で見つかった他の細胞型と一緒に、完全な管および小葉を含む乳房 ​​組織の微細構造を提供しています。ヒト乳房組織の処理では、通常の還元mammoplasties、脂肪組織の除去、間質マトリックスの機械的および酵素的消化から得られ、そして赤血球の溶解は、乳管フラグメントおよび端子乳管小葉単位富化。右の存続期間のための右の濃度で穏やかに酵素消化は、組織微細構造はそのまま残ることを保証する複数の細胞型を保持し、大部分はそれらの細胞外マトリックスを維持することが不可欠である。注意はまたすぐに一度、患者から除去された組織を処理するに支払われるべきである。患者サンプルは、実質的に変化し、機械的および酵素的消化を長くする必要があるかもしれない、および/または組織は、コラーゲン含有量が特に高いときに余分な酵素を添加する必要がある。

微細構造は、最大6日間の90％生存したままであるが、このモデルは、長期的なホルモン刺激のために限界がある。異なる細胞タイプは、異なる半減期を有するように、細胞組成物は、時間とともに変化する可能性が...

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開示事項

著者らは、開示することは何もない。

謝辞

著者は、乳房形成の写真を提供するためのローザンヌ大学病院のM.マイクロフィッシュ、M.ワース·実験癌研究のためのスイスの研究所のA. Ayyanan、研究分子腫瘍、生命科学の学校、エコール連邦工科·デ·コンピテンスのナショナルセンターに感謝批判的なコメントのためにマンチェスター大学の技術支援のためのローザンヌとR·クラーク。これらの結果につながる研究なしグラント契約の下でSNF3100A0-112090、Oncosuisse 531817、および革新的な医薬品イニシアティブ共同事業の支援を受けている。 115188、現物出資における製薬産業と協会の企業の欧州連合の第7次フレームワークプログラム（FP7 / 2007年から2013年）と欧州連合からの財政貢献」で構成されているの資源。革新的な医薬品イニシアティブのWebアドレスですhttp://www.imi.europa.eu/ 。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
マイクロリットル遠心分離機ヘレウス バイオフュージ フレスコ75005521
遠心分離機 5810Rエッペンドルフ5810 000.327
クライオボックスナルゲン  5100-0001
制御レートフリーザー EF600 グラント漸近 EF600
CO2インキュベーターHera Cell Heraeus51022391
Roller Mixer SRT9DSturtSRT9D
Histology CassettesMedizintechnik81-0021-00
Cell StrainerFalcon352340
Strile Surgical Blade エースクラップBB536 
メスAesculapBB084R
ForcepsAesculapBD047R
はさみAesculapBC374R
パラフィンベースモールドSAKURA4166
最適な切断温度 (OCT) クライオマトリックスサーモサイエンティフィック6769006
ペニシリン/ストレプトマイシン Life Technologies15070-063
抗生物質/抗真菌薬Life Technologies15240-062
DMEM F/12Life Technologies11039-021プレウォーム (37 °;C)
コラゲナーゼロシュ11 088 793 001予温 (37 °C;C)
ウシ胎児血清ライフテクノロジー10270、胎児ウシ血清
細胞血液溶解バッファーシグマR7757
メチルスルホキシド(DMSO)シグマD2650
プシンEDTAライフテクノロジー15400-054
ガロースInvitrogen16500-500
に置き換えることができます。ホルムアルデヒドシグマF1635
パラホルムアルデヒドロス335
イソペンタンシグマM32631
エタノールメルク1009831000
極低温バイアル (5.0 ml)VWR, International479-0820
超低付着培養皿Corning, NY 148313471
はジトリア

参考文献

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再版と許可

訂正


Formal Correction: Erratum: An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast
Posted by JoVE Editors on 2/01/2015. Citeable Link.

A correction was made to An Ex Vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast. There was an error with the author, Marie Shamsheddin's, name. The author's name has been corrected to:

Marie Shamseddin

instead of:

Marie Shamsheddin

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