線虫を用いて生殖化学毒性を総合的に評価<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

サマリー

生殖細胞毒性を評価するために使用された線虫Caenorhabditis elegansにおけるハイスループット化学アッセイの詳細な手順を説明します。このアッセイでは、異数性胚に特異的な蛍光レポーターを使用して、化学物質曝露後の生殖細胞機能の破壊をモニターします。

要約

我々の環境中に存在する化学物質の何千もの生殖毒性を識別することは環境衛生の分野で最も食欲をそそる課題の一つとなっている。これは、（1）正確に生殖過程のキーの機能を再現し、（2）脊椎動物の多数を必要とせず、ハイスループット様式に、中で行うことができ、モデル系の不足に一部起因する。

ここでは、線虫C.でのアッセイを説明異数性胚の誘導を監視することにより、生殖細胞系の毒物の迅速な同定を可能にする虫 。 GFPレポーターラインを利用することにより、生殖細胞の破壊に起因する染色体分離におけるエラーは、容易に自動化蛍光顕微鏡により可視化し、定量化される。したがって、その毒性のための化合物の特定のセットのスクリーニングは、数日のうちに96の384ウェルプレート形式で実施することができる。正hの二次分析その染色体異常が減数分裂の破壊または初期胚染色体分配誤差に由来するかどうかを決定するために行うことができる。要するに、このアッセイは、化学物質曝露後の生殖細胞系の機能障害を迅速に評価するための迅速な初回通過戦略を表す。

概要

米国では商業用に登録さ約87000薬品、これらは潜在的な健康への影響¹のためにテストされたのまだごく少数があります。テストされたもののうち、一部のみ、特に女性の生殖細胞の発生および分化の間、哺乳動物における早期の生殖イベントの変更を決定する際の困難さに一部起因生殖健康への影響について評価された。確かに、最初の減数分裂事象は、雌の哺乳類における胚発生の初期段階で行われ、スクリーニング目的に適した番号にアクセスして収集することは困難である。

生殖細胞は、世代間の重要なリンクを提供し、その適切な機能は、細胞の染色体分裂の複雑なプログラム減数分裂と呼ばれるの正確な実行に依存している。減数分裂プロセスの調節不全が減少生殖能力との産生をもたらす可能性染色体の異常な数の配偶子および胚は、条件が異数性と呼ばれる。減数分裂における染色体の分離エラーが人間の健康に非常に関連しています。染色体異常は1〜150で出生の頻度、21トリソミー、18と13だけでなく、最も一般的なタイプ^2,3であるXとY染色体のエラーで、共通している。さらに、染色体の起源のものを含め先天性奇形は、環境の影響は、染色体分離や行動に影響を与えることができるという考えは⁵新しいものではないが、それでも十分に理解されていない米国⁴で乳児死亡の主要な原因である。それは人間の生殖能力、初期の開発および全体的な生殖に関する健康に干渉している私たちの環境に導入された化学物質のどの調査することが重要である。

哺乳動物モデルのこれらの制限に照らして、我々は、回虫生殖毒性を試験するためのハイスループットスクリーニングアッセイを開発した C。エレガンス。我々は、その小さなサイズ、低コスト、短い再生サイクル、生殖細胞の割合が高いと操作⁶の容易として一般的に使用される遺伝モデルシステムによって提供されるいくつかの重要な機能を動員している。ワームは、96ウェルプレートに、または大量の液体培養で増殖することができ、それらの透明性を直接蛍光レポーターを検出するためにプレート上に結像することができる。以下に記載のアッセイは、これらの特性を利用して、蛍光レポーターPxol-1を含むウォーム株を活用:: GFPの胚の異数性の生殖細胞を破砕した誘導を検出すること。

このレポーター株の使用は、主に雌雄同体のワームの人口の男性の一般的まれな出来事に基づいています。これらの男性（<0.2％）が自然にX染色体⁷の分離の誤差に由来する。しかし、生殖細胞系列の中断などの頻繁に常染色体の分離におけるエラーにつながるそしてheterochromosomesのではなく、男性の表現型（Xの分配異常）ならびに胚性致死（常染色体の分配異常）の高められた発生率との両方を相関させる。胚の致死性の問題を回避しながら、容易に雄の誘導を検出するために、雄特異的プロモーター（XOL-1）は、依然としてワームの子宮内に含まれる初期胚におけるGFPの発現を駆動するために使用される。このように、GFPを発現する胚の外観は、異数性胚の存在のためにプロキシとして使用される。この方法は、以前に生殖細胞維持および分裂^8,9に関与する遺伝子を同定するために使用されている。化学物質のスクリーニングに適合し、この菌株は、ハイスループットスクリーニングに媒体中で使用される。重要なことは、株は忠実に化学物質のaneugenicityを報告し、そのための哺乳動物の生殖エンドポイント¹⁰に関連している。ここに記載のアッセイは、見て、製薬および化学産業の設定で毒物学者に特に有用であろう急速生殖エンドポイントに向かっての化学物質の毒性を評価した。さらに、このアッセイは、完全に21世紀^のレポート¹¹に毒性で強調表示政府の優先事項と整合する。

プロトコル

摂食細菌の調製

注：このセクションでは、給紙細菌（ 大腸菌株 OP50）の調製を記載する。

1. Eの単一コロニーを分離無菌的にLB培地（LB）寒天プレートとから大腸菌株 OP50は、オートクレーブしたLBブロス300mlに接種する。
2. 飽和状態に達するまでに接種培養は、200rpmで、37℃でシェーカーで一晩増殖させる。
3. 6無菌、予め秤量した50ミリリットルコニカルチューブにOP50を転送します。 6000 RPM（5000 XG）で5分間遠心分離することによって細菌をペレット化。
4. 上清を捨て、滅菌したM9 50mlで細菌を洗う。二回繰り返します。
5. 第二回目の洗浄後何M9がチューブ内に残っていないことを確認して、残りのM9を削除します。
6. 細菌ペレットを含むチューブを計量することによってペレットの重量を測定し、50ミリリットルコニカルチューブの重量を差し引く。
7. ペレットIを再懸濁nはM9に100mg / mlの濃度で。
8. それはワーム培養に使用されるまで4℃でOP50ソリューションを保管してください。

線虫成長培地（NGM）ペトリ皿の調製

注：このセクションでは、C.プレートであるNGMペトリ皿、の調製を記載elegansのワームは、日常的に研究室で維持されている。

1. NGM寒天培地をオートクレーブ。
2. 滅菌手順を使用して、蠕動ポンプを使用して6センチメートルペトリプレートにNGM寒天溶液17mlを分注する。
   注：プレート内の寒天の一定量を別のプレートから切り替えるときに顕微鏡を再集束の必要性を低減。
3. 寒天が固化してみましょうと余分な水分を蒸発できるようにするため、使用前に2〜3日間室温でプレートにしておきます。
4. 無菌技術を用いたNGMプレートをシード。 OP50液体培養の1-2滴を適用し、ガラス棒を用いて拡散。ことを確認していないすべての道のプレートの端に細菌の芝生を広げます。
5. OP50の芝生がワームを成長させるのプレートを使用する前に、室温で1〜2日間増殖することを許可する。

同期ワーム人口の調製

注：Cのライフサイクル虫は胚段階、4幼虫期（L1-L4）と成人期から構成されている。このセクションでは、ワームの年齢同期人口の製造を記載し​​ている。漂白処理後の線虫と接触する全ての材料は、無菌でなければならない。

1. 1日目- 、妊娠ワーム人口の調製
   1. ワームの人口の大半が飢餓のL1幼虫で構成されているNGMプレートを使用してください。
   2. 滅菌ワームとのL1幼虫が選ぶ収集し、新鮮に6cm NGMプレートにそれらを転送するには、OP50を播種。ワームの大半は妊娠大人になるまで20℃で約65時間インキュベートする。へプレート過密を回避し、ワームは細菌を破壊することなく成長させる、各新鮮なNGMプレートにL1幼虫の1つまたは2つ以上のクラスタを転送しないでください。
2. 4日目-シンクロナイズドL1幼虫人口の確立
   1. M9 1-2 mlのそれらを洗浄することにより、NGMプレートから妊娠ワームを収集し、円錐形の15ミリリットルチューブに転送。
   2. 妊娠ワームは約5〜10分間15ミリリットルコニカルチューブの底に沈降してみましょう。ワームペレットを乱すことなく、上清を取り除きます。
   3. 2-4マイクロ遠心チューブにワームペレットを移し、漂白剤/ NaOH溶液1ミリリットルを追加します。 RTで2〜3分間インキュベートする。死んでいるすべてのワームを確認するために、実体顕微鏡下で反応の進行状況を監視します。胚が死ぬことができるようになりましたが5分を漂白しないでください。
   4. 3000 RPM（900 XG）で1分間遠心分離することにより、ワームを収集します。上清を除去し、滅菌M9の1ミリリットルを追加反応を中和する。
   5. 3000 RPM（900 XG）で1分間遠心分離することにより、二回のワームを洗ってください。
   6. 上清を除去し、最大で100〜200μlにM9を追加。
   7. ガラスパスツールピペットを使用すると、NGMプレートをクリアして、胚が孵化することを可能にするために20℃で少なくとも24時間のためにそれらをインキュベートするワーム/ M9ミックスのドロップを追加。
      注：食べ物がないと幼虫の成長がL1段階で停止されます。
3. 5日目-シンクロナイズドL4幼虫人口の確立
   1. M9 1-2 mlのプレートを洗浄することにより明確なNGMプレートからのL1幼虫を収集し、円錐形の15ミリリットルチューブに転送。
   2. 約5分間の15ミリリットルコニカルチューブの底に死んだ成虫の堆積物をしましょう​​。
   3. 新しい円錐形​​の15ミリリットルチューブ内のL1虫である上清を、収集し、2600 RPM（1,000 XG）で2分間遠心分離することによりワームを沈殿させる。
   4. 上清ルを削除約500μlのAVING。
   5. 実体顕微鏡を使用してドロップ10μlのワームの数をカウントすることによりM9溶液中のワームの濃度を決定する。少なくとも5滴を数える。
   6. 20-25ワーム/μlにワームの濃度を調整し、NGMプレートにワーム/ M9ミックス50μlのを追加OP50を播種。
   7. 彼らはL4段階に到達するまでに成長するL1同期化された人口を可能にするために（週末を通してインキュベーションのために）15℃で65時間インキュベートする。

96ウェルプレート中で化学物質へのワームの4暴露

注：このセクションでは、Pxol1の使用が記載されている:: Cを含むGFP転写レポーターエレガンス株は、異数性の誘導のためにスクリーニングする。

1. M9 1-2 mlのプレートを洗浄することにより明確なNGMプレートからL4幼虫を収集し、円錐形の15ミリリットルチューブに転送。
2. L4ワームの底に沈降してみましょう約5〜10分間15ミリリットルコニカルチューブ。ワームペレットを乱すことなく、上清を取り除きます。
3. M9 3〜5 mlを加え実体顕微鏡を用いて10μlの滴でワームの数をカウントすることによりM9溶液中のワームの濃度を決定する。各サンプルについて少なくとも5滴を数える。
4. M9 1000ワーム/ mlの濃度でワームを再懸濁する。
5. M9でセクション1の10倍からOP50細菌を希釈する。より低い温度では、ワームの開発に影響を与えるために再懸濁させ、細菌が室温に達することを確認してください。
6. マルチチャンネルピ ​​ペットを用いて、第一（ステップ8.8）ワーム/ M9ミックス100μlのを追加し、2ミリリットル深い丸底96ウェルプレートの各ウェルに（ ステップ4.5から）で希釈OP50細菌の400μlを添加する。最後に、各ウェルを500μlの100ワームを持つことになります。
7. 提案され、最終的なconcentrを達成するために、被験化学物質または所望のウェルに適切な制御のどちらかの0.5μLを追加します。100μMのationが、濃度は一般的にCの化学画面で使用虫 ^12。 0.1％の最終濃度でエタノールまたはDMSO溶媒対照を公開します。
   注：我々は、陽性対照としてノコダゾール（100μM）の使用をお勧めします。
8. 接着フィルムを使用してプレートをシール。ウェル間のクロスコンタミネーションを防ぐためにウェルプレートをシールしてください。
9. アルミホイルでプレートを包みます。
10. 時間の適切な長さのために適切な温度（24または65時間）のシェーカー（170〜180 RPM）にプレートを転送します。部屋の温度は、ワームの成長に影響を与えます。 20℃前後の温度を維持する。

384ウェルプレート中で、妊娠ワームの5.画像取得

注：このセクションでは、大人の雌雄同体の子宮内の胚におけるGFPの発現を可視化するために、画像さらさPxol1 :: GFPワームに高いコンテンツ顕微鏡の使用が記載されている。のためにスクリーニングされる各384ウェルプレートに、4×96ウェルプレートからワームを使用する。

1. シェーカー中の化学暴露後に、10〜15分間、96ウェルプレートの残りは成虫がプレートの底に沈降することを可能にすることができます。
2. マルチチャンネルピペットを用いて、プレートの底にワームを邪魔しないように非常に気をつけながら、M9の350μlのを削除します。
3. M9の1ミリリットルを繰り返しステップ5.1でワームを洗ってください。
4. マルチチャンネルピペットを用いて、プレートの底にワームを乱さないVEYように注意しながら、M9の1ミリリットルを削除します。
5. マルチチャンネルピペットを使用して、残りのM9にワームを再懸濁し、96ウェルプレートからワーム/ M9ミックス100μlのを収集し、黒壁/透明底384ウェルプレートのウェルにロードします。 384ウェルプレートの全てのウェルがロードされるまで、4×96ウェルプレートからワームを使用してプロセスを繰り返す。
   注：すべてのウェルに増加させるために、同じ体積を有することが重要である画像取得プロセス中にオートフォーカスの効率と速度。各ウェルを80から100のワームとの間で含まれている必要があります。
6. 各ウェルにレバミゾール（100μM）の1μl加え、ワームは、約30分間インキュベートしましょう​​。
   NOTE：レバミゾールアセチルコリン受容体アゴニストとして作用し、ワームを固定する。
7. 自動化されたイメージングを提供することが可能な広視野高含量顕微鏡にプレートに移す。
8. 画像取得のために、製造業者のガイドラインに従って高含量画像収集および解析ソフトウェアを使用します。ウェルあたり1画像を取得する4X対物レンズを選択する。
9. 画像取得を開始する前に、xは2160 2160への曝露と画像解像度の45ミリ秒にGFPの撮像パラメータを調整する。
10. ウェル中のワームの総数で割ったGFP陽性虫の数などのデータを収集し、後者の指標は、ウェル間の比較的一貫している。

結果

このような微小管毒ノコダゾールなどの化学剤に対するPxol-1 :: GFPレポーター株の曝露（ 図1）は、DMSO対照と比較して露出した成体雌雄同体の子宮におけるGFP発現胚の高い割合の誘導を導く。 GFP陽性胚は、他の胚だけでなく、動物の腸内で観察された自家蛍光で観察弱いバックグラウンド蛍光よりも有意に明るい。露出されたワームは、直接384ウェルプレート上に結像された少なくとも1つのGFP陽性胚を含む虫の数は、各ウェルについてカウントし、そのウェル内のワームの総数によって正規化される。化学画面から正のヒットは、DMSO ¹⁰よりも高い周波数1.7倍でワーム集団におけるGFP陽性胚の割合を誘発した化合物を意味する。しきい値の最適化、高含量画像解析（ 材料ファイルを参照してください）に続いて、自動化されたカルクことができます正のオブジェクトの数のulation（ すなわち、胚）ウェル内のワームの総数で割って、アッセイの大規模な適応のための最適な方法である。

ディスカッション

ここで説明する方法は、生殖系列の毒物を同定するための最初の大規模な戦略を構成する。それは忠実に生殖細胞機能障害のためのプロキシとして使用されている初期胚で異数性の誘導を報告したGFPトランスジェニックPxol-1 :: GFP含む株を使用する必要があります。この方法は、Cの慎重な同期を伴う虫ワームの人口と自動化ハイコンテンツ顕微鏡によってGFP陽性ワームの撮影に続いて、96ウェルフォーマットでの化学物質へのワーム"暴露。

このプロトコルのいくつかのステップは、結果の一貫性に重要である。適切に露光に使用されるL4幼虫を上演したの数を最大としてまず、ワーム集団はに非常に同期している必要があります。このため、ここで説明する方法論は、L1飢餓によるワームの人口の漂白による最初と、2つの同期ステップを含む。第二の重要なパラこの方法のメーターは露出の長さです。ワームは、日常的に24時間または65時間のどちらかのために露出されている。減数分裂のようにCの継続的なプロセスである虫は 、これら2つの露...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
60 mm 通気孔付き、シャープエッジ ペトリ皿	Tritech	T3315
寒天	Apex	20-274
Axygen 96 ウェル クリア ラウンド ボトム 2 ml ポリプロピレン ディープ ウェル プレート	コーニング	P-DW-20-C-S
バクトペプトン	Apex	20-261
バクトトリプトン	フィッシャー サイエンティフィック	BP1421-2
漂白剤	クロロックス
塩化カルシウム (CaCl2)	VWR	AA12316-A1
コレステロール	フィッシャーサイエンティフィック	ICN10138225
DMSO	VWR	IC19018680
E. coli (OP50)	Caenorhabditis Genetics Center		http://www.cbs.umn.edu/cgc
エタノール 200 プルーフ	VWR	EM-4455S
Greiner CELLSTAR 384 ウェルプレート	Sigma-Aldrich	M1937-32EA
ImageXpress Micro XLS System	Molecular Devices
塩酸レバミゾール	Fluka	31742
硫酸マグネシウム無水物(MgSO4)	VWR	97061-438
MetaXpressハイコンテント画像取得&解析ソフト	分子デバイス
リン酸カリウム一塩基性(KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5655
生物培養用レーヨンフィルム	VWR	60941-086
塩化ナトリウム(NaCl)	Sigma-Aldrich	S5886
水酸化ナトリウム(NaOH)	Fisher Scientific	S318
リン酸ナトリウム二塩基性 (Na2HPO4)	VWR	BDH0316
実体顕微鏡	ニコン	SMZ 745	この顕微鏡は、3.35倍から300倍までの合計倍率を持っています。同様の特性を持つ顕微鏡であれば、どれでも機能します。
TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP レポーター株	Caenorhabditis 遺伝学センター		http://www.cbs.umn.edu/cgc
酵母抽出	物 ベクトン・ディキンソン	212750