病における網膜障壁を研究するツールとしてアデノ随伴ウイルスを使用して、

サマリー

網膜疾患の動物モデルにおける血液網膜関門透過性と内部制限膜の完全性を調査するために、我々は網膜ニューロンとグリアを標識するためのツールとしていくつかのアデノ随伴ウイルス(AAV)変異体を使用しました。その後、ウイルス媒介レポーター遺伝子発現を網膜バリア透過性の指標として使用します。

要約

ミュラー細胞は網膜の主要なグリア細胞である。彼らのエンド足は外側と内側の制限膜（ILM）での網膜の限界を形成し、アストロサイト、周皮細胞および内皮細胞と一緒に彼らは血液網膜関門（BRB）を確立。 ILMは、組織学的に網膜と硝子体腔の境界を定義する基底膜として機能している間BRBは、血流と網膜の間で物質輸送を制限します。ミュラー細胞にラベルを付けると、これらの細胞はBRBとILMの不可欠な部分であるように、網膜障壁の物理的状態を研究するために特に関連しています。 BRBとILMの両方が頻繁に網膜疾患に変更され、病気の症状の原因であるされている。

そのようなエバンスブルーアッセイまたはフルオレセイン血管造影などのBRBの完全性を研究するためのいくつかのよく確立された方法があります。しかしこれらの方法は、BRB透過tの程度についての情報を提供しないナノメートル範囲の大きな分子、O。さらに、それらは、ILMのような他の網膜の障害の状態に関する情報を提供していません。網膜のILMと一緒BRB透過性を研究するために、我々は、疾患状態におけるILM及び細胞外マトリックスタンパク質の状態を示しているが、より大きな分子にBRBの透過性に関する情報を提供するAAVベースの方法を使用する。 2つのAAV変異体は、そのような研究のために有用である：AAV5とShH10。 AAV5は、光受容体のための自然な指向性を持っていますが、ILM（ すなわち、野生型の網膜に）完全である硝子体内に投与した場合には、外側の網膜に渡って取得することはできません。 ShH10は、グリア細胞に対して強い親和性を有しており、選択的に、健康と病気の両方の網膜にミュラーグリアにラベルを付けます。 ShH10はILMが侵害された網膜におけるより効率的な遺伝子送達を提供しています。免疫組織化学および血液DNA分析と相まってこれらのウイルスのツールは、疾患における網膜の障害の状態に光を当てる。

概要

ミュラー細胞は網膜の主要なグリア要素である。形態学的には、彼らが放射状に網膜にまたがるとそのエンドフィートは、硝子体に接触して、ILMと後者の秘密のコンポーネントに直面しています。 ILMは、約10種類の細胞外マトリックスタンパク質（ラミニン、アグリン、パールカン、ニドジェン、コラーゲン、いくつかのヘパリン硫酸プロテオグリカン）からなる基底膜である。開発中、その存在は、網膜組織発生、視神経軸索のナビゲーション、および神経節細胞^1-3の生存のために不可欠である。しかし、ILMは、成体網膜において本質的でないし、外科的網膜損傷^4を引き起こすことなく、特定の病状を除去することができる。遺伝子治療では、この膜は、硝子体内注射⁵のAAVを用いて網膜の効率的な伝達のための物理的障壁となる。

彼らのプロセスの豊富な樹枝状分岐を経て、ミュラー細胞は、栄養や規制スッポを提供網膜ニューロンおよび血管細胞の両方に室温。ミュラー細胞は、BRB ⁶の形成および維持において、網膜の恒常性の調節に関与する。網膜毛細血管内皮細胞、ミュラー細胞、星状細胞および周皮細胞間のタイトジャンクショ​​ンはBRBを形成する。 BRBは、糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞、呼吸器疾患などのretina.In多くの疾患に入るの特定の物質を防ぎ、網膜の低酸素症は、BRB ^7-9を通る漏れの原因となる。この破裂は血管原性浮腫、網膜剥離や網膜損傷につながる血管透過性の増大と関連している。

ミュラー細胞は緊密BRBとILMの完全性の両方において重要な役割を果たし、血管および基底膜に関連している。その結果、ミュラーグリア細胞を標識すると、これらの網膜障壁の物理的状態の研究に特に関連する。

クラシック味方、BRB透過性は血漿アルブミンに非共有結合し、エバンスブルー色素の全身注射からなるエバンスブルーアッセイを用いて測定される。このアッセイは、網膜への血管^10（プロトコルセクション5を参照）からのアルブミン漏出（中間サイズのタンパク質、〜66 kDaの）を測定する。また、血管漏出は、フルオレセインの漏れを証明する蛍光眼底血管造影により可視化することができる（小分子、〜359ダ、プロトコル第6節参照^）11。それにもかかわらず、両方の方法は、小分子およびタンパク質へBRB透過性の評価を可能にするが、それらは、ILMの整合性についての情報を提供していません。

したがって、BRB透過性を研究するために、我々は、より大きな分子（ 例えば、AAV粒子、25 nmの直径）へBRB透過性に関する情報を提供するAAVベースのメソッドを使用していました。確かに、私たちの方法はそれを示唆している、血液中のAAV導入遺伝子の存在を検出することができる〜25nmの直径の粒子だろう血流に浸透させることができる。この方法はまた、病理学的状態におけるILM及び細胞外マトリックスタンパク質の構造に関する情報を提供する。 2つのAAV変異体は、そのような研究のために有用である：AAV5とShH10。網膜下に注入された、AAV5は、光受容体と網膜色素上皮¹²のための自然な指向性を持っていますが、完全なILM ^5,13と、野生型網膜における硝子体内に投与した場合には、外側の網膜に渡って取得することはできません。 ShH10は、具体的には、ニューロン^14,15の上にグ ​​リア細胞を標的とするように操作されているAAV変異体である。 ShH10は選択的に損なわれた障壁¹⁶と網膜の効率化と健康と病気の両方の網膜でミュラー細胞を標識する。 immuhistochemistry及び血液DNAの分析と結合され、これらのウイルスのツールは、網膜障壁の状態および疾患におけるそれらの関与（ 図1）に関する情報を提供する。

プロトコル

本研究で用いたすべての動物は、眼科と視覚研究における動物の使用に関するARVO声明によると世話と取り扱った。

HEK-293細胞^17,18の一過性トランスフェクションによる組換えAAV（rAAVの）1。生産

注：マクルーアC、Joveの^{（2011）19を}参照してください。

1. AAVベクタープラスミドの大規模プラスミド調製を（少なくとも1 mg / ml）で精製する。 3プラスミドを使用してください。 AAV逆方向末端ことなく複製およびキャプシド遺伝子を保有するAAVヘルパープラスミドは、ITRは、AAV ITRを保有する導入遺伝子発現カセットは、転写プラスミドと呼ばれる、プラスミド、アデノウイルスヘルパー遺伝子の供給E2、E4、およびVA RNA遺伝子と呼ば繰り返すpHELPERとしての。
2. ポリエチレンイミン（または他のトランスフェクション試薬）を用いて、これらの3つのプラスミドで293細胞をトランスフェクション。トランスフェクション効率の80％を超える良好なv​​iのために必要であるRAL利回り。
3. イオジキサノール勾配で293細胞溶解物から組換えAAVを精製する。 15％、25％、40％、60％イオジキサノール勾配を得るために使用される。 、AAV粒子を含む40％イオジキサノール画分を収集し、1時間50万×gで超遠心分離した後に一部を集中し、0.001％プルロニックを含むPBS（リン酸緩衝生理食塩水）に対するバッファー交換。
4. ウイルスゲノム力価^20を決定するには、QPCRに続くDNA分解酵素プロテイナーゼダイジェストを行う。順方向および逆方向プライマーはAAV2 ITRに位置して62 bpの領域を増幅する。プラスミド標準のために、プローブは、FAMで標識し（BHQ）、ブラックホールクエンチャーを有している。
5. ITRプライマー、100nMのフォワードITRプライマー、100nMのAAV2 ITRプローブ、0.4mMのdNTPを、2のMgCl 2、1×プラチナTaqポリメラーゼ緩衝液、1Uプラチナリバース340 nMのを使用して25μlの最終体積で定量PCR（定量的ポリメラーゼ連鎖反応）を行うTaqおよび5μlのテンプレート（標準、サンプルおよび鋳型なしコントロール）。
6. のために標準は、7×10倍連続希釈（5μlの¹⁰月10日から^4月 10日までのゲノムの/ mlの最終濃度とした2×10 ^{9 3} 2×10ゲノム/ mlのそれぞれ）でのトランスフェクションのためのプラスミドを使用する。
7. 1分で1分間の60℃でのアニーリング/伸長のために95℃での変性を40サイクル、続いて15分間95℃での初期変性ステップでプログラムを開始する。短期保存または長期保存期間のために-20℃で、4℃で保存する。

AAVの2.硝子体内注射

1. ケタミン（50mg / kg）およびキシラジン（10mg / kg）でC57BL6Jマウスを麻酔し、正向反射の消失、適切な麻酔を示す引っ込め反射とテールピンチ応答を確認する。 neosynephrine 5％の角膜アプリケーションによって生徒を拡張し、点眼薬0.5％mydriaticum。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください。
2. 超微細な30のG disposabを渡すル赤道を通じて針と硝子体腔に、角膜縁の隣に（チウK、Joveの（2007年^）21を参照）。硝子体腔（ 図1）の中央に針の直接観察にShH10-GFPまたはAAV5-GFPの1 ¹¹ 10×4のVPを含む1μlの株式を注入。 ILM実験のコントロールとして片目を使用してください。 BRB実験のために両眼を注入。注入された目に​​、抗炎症、抗菌局所的処置を適用します。
3. neosynephrineで生徒を拡張し、mydriaticum目は、撮影のために低下する。 GFP（緑色蛍光タンパク質）の発現は1週間、2週間、1ヶ月、および硝子体内注射後2ヵ月（ 図1）に従うように眼底カメラを眼底検査を行う。 CO ₂吸入1から2ヶ月後に注射することによってマウスを生け贄に捧げる。

3.免疫組織化学

1. 網膜凍結切片（ 図1）の場合は、Lを削除するには除核の目を解剖1時間、4％パラホルムアルデヒド中ではens角膜、浸漬修正。
   1. 室温で1時間、室温でさらに時間を20％スクロース、10％スクロース中で、以前に固定目をCryoprotect。一晩4℃で30％スクロース溶液中でCryoprotect。フリーズとそのようなクライオマトリックスとして樹脂を埋め込んでアイカップを埋め込む。 10μmの凍結切片を作成し、特別に凍結組織切片のために処理したスライドにマウントし、それは、染色中に組織の密着性を向上。
   2. 5分間PBS（pH7.4）中の0.1％トリトンX100を持つセクションを透過。洗浄PBSで2回、1％BSA、0.1％ツイーン20を含むPBS中で室温で1時間ブロック。
2. 網膜のフラットマウント（ 図1）は、切開を容易にするために、15分間、4％パラホルムアルデヒド中で除核目を固定する。
   1. 15〜30分で、角膜とレンズを削除するには、目を解剖。鋸状縁を中心に切断することにより、網膜色素上皮（RPE）と強膜から網膜を分離し、視神経。網膜と形質導入網膜細胞における蛍光タンパク質を（固定が24時​​間を超えてはならない）を固定するためにさらに30分間4％パラホルムアルデヒド中に浸し。滅菌PBS、pH7.4の中で5分間洗浄する。
   2. （1％BSA、2％正常ヤギまたはロバ血清を含むPBS、0.5％トリトンX-100）を、ブロッキング緩衝液をPBSに変更し、室温で4時間または4℃で一晩のいずれかのために、ブロッキング緩衝液中でインキュベートする。
3. 室温または4℃で一晩のいずれか4時間、ブロッキング緩衝液中で一次抗体を有する組織をインキュベートする。 PBSで洗浄3X。
   注：次のように使用される抗体は、以下のとおりです。抗ラミニン（1 / 1,000）ILM、抗ロドプシンクローン4D2（1/500）ラベリングロッド、抗グルタミンシンテクローンGS-6（1/1500）ラベリングミュラー細胞を標識し、PNAレクチン（1/40）ラベリングコーン。
4. 部屋テンペで1時間（凍結切片）または2時間（フラットマウント）用のブロッキング緩衝液中でアレクサフルオロ結合二次抗体の1：500希釈を有する組織をインキュベートrature、光から保護。 PBSで洗浄3X。
5. 網膜に切り込みを緩和行い、感光体または網膜神経節細胞（RGC）どちら側が上方に向けてスライドガラス上にflatmount。 4℃でカバーガラスとストアを適用し、水性のmountingmediumを追加します。
6. レーザー走査型共焦点顕微鏡上で、共焦点顕微鏡を実行します。励起および発光のクロストークを低減するために、順次行ずつ画像を取得する。ナイキスト - シャノンのサンプリング定理によるとステップサイズを定義する。最終画像で過飽和のピクセルを最小限に露出設定を使用してください。 Zプロジェクトの機能の下に最大強度を使用して、最終的に8ビットRGBカラーモードに変換する単一平面上FIJIとプロセス12ビット画像、プロジェクトZ-セクション。

マウスの血液サンプルの4 PCR分析

1. 麻酔しC57BL6Jマウスの陰茎静脈にAAV-GFPの1〜10×4の¹¹粒子を含有する100μlの株式（イソフルランの5％を注入超微細6mmの針をインスリンシリンジを用いて閉鎖室で誘導手術中、ノーズコーンを介してイソフルランの2.5％）である。この動物は、AAV粒子の循環の陽性対照として役立つ。
2. 注射と3時間、24時間、2日、3日ShH10硝子体内注射後またはintrapenile注射（ 図1）前後のマウスの尾からのサンプルの血液。約10〜20μlをヘパリンチューブに回収される。手続きの完了後にCO ₂吸入によりマウスを生け贄に捧げる。
3. お好みの抽出キットを用いて血液サンプルからゲノムDNAを抽出します。
4. ゲノムDNAのPCR増幅を行う。このプロトコルの以下のプライマー対を使用します。GFPを、5'-CGACACAATCTGCCCTTTCG-3 '、アンチセンス5'-CATGGACGAGCTGTACAAGGGA-3'を感じる。以下のPCRプログラムを実施した：95℃で2分（1サイクル）。 95℃45秒、55℃1分、72℃45秒（30サイクル）; 72℃5分（1サイクル）;4℃の保持。

5.オプションエバンスブルー法

注：エバンスブルー法^10を用いて、網膜に血管からのアルブミン漏出を測定することにより、血管透過性を定量化する。

1. 5μmのフィルターを介して生理食塩水（6 mg / ml）で、超音波洗浄器で5分間超音波処理し、ろ過に溶解してエバンスブルー色素を準備します。
2. （イソフルラン吸入、ステップ4.1を参照）C57BL6Jマウスを麻酔、適切な麻酔を示す引っ込め反射とテールピンチ応答を正向反射の消失を確認し、陰茎静脈（ 図1）を介した（45mg / kg）のエバンスブルーを注入する。マウスの足、銃口、耳は色素の取り込みと分布を確認し、エバンスブルー注射後、明らかに青になっていることを確認してください。
3. ケタミン（50mg / kg）およびキシラジン（10mg / kg）での色素の注射後C57BL6Jマウスに3時間を麻酔しrightinの消失を確認適切な麻酔を示すGレフ。サンプルヘパリンチューブ中に血液を心臓内に約500μlのクエン酸塩緩衝液を用いて、左心室を介して2分間、マウスを灌流（0.05 M、pHを3.5;蒸留水1 Lクエン酸7.8gのクエン酸ナトリウムを3.8g溶解）血管収縮を防止するために、37℃に予め温めておいた。マウスは、灌流を経由して屠殺する。
4. 慎重に灌流、脱核とした後に網膜を収集するための手術用顕微鏡の下で両眼を解剖（3.2項を参照）。遠心エバポレーターで乾燥網膜は一晩中、重さ、および（100 XG）しながら65℃で18時間ホルムアミド100μlの網膜をインキュベートすることにより、エバンスブルー色素を抽出します。 4°Cで15分間20,798.5×gで4℃で遠心分離血液サンプルで2時間20,798.5×gで30Kオメガフィルタチューブ内の遠心網膜サンプル。
5. 吸光度を測定するために、両方の上清を使用してください。 foの最大吸光度を差し引くことにより、各試料の吸光度を決定する740 nmでの吸光度を最小に620nmの青色rのエバンス。ホルムアミド中のエバンスブルーの標準曲線から血漿および網膜のエバンスブルー濃度を計算します。時間当たりの乾燥網膜（血漿/ gの網膜の乾燥重量/時ずつ）のグラムあたりのエバンスブルーのマイクロリットルでBRB透過性を発現する。

6.オプションフルオレセイン血管造影

注：マウスにおける網膜血管からの漏出は、フルオレセインナトリウムの腹腔内注射することによって可視化することができる。

1. （neosynephrineとmydriaticum）をドロップしC57BL6Jマウスを麻酔（イソフルラン吸入、 ステップ4.1を参照）、目で瞳孔を拡張。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください。
2. フルオレセイン血管造影用の0.1ミリリットル滅菌生理食塩水で10％フルオレセインナトリウムの腹腔内に0.01〜0.02ミリリットルを注入。
3. 眼底カメラを用いて、注射後両目の画像を収集する。プロの後にCO ₂吸入によりマウスを生け贄に捧げるcedure。
   注：網膜の血管は血管造影に見えるようになるために20秒が必要です。画像は、フルオレセイン注射後3-10分最大の間に捕捉されなければならない。漏洩スポット（存在する場合）は2.5分後に観察可能である。後の時点で、画像品質がフルオレセインナトリウムまもなく分析のために使用された後に得られた硝子体、こうして画像のみに拡散するために失われる。

結果

私たちは、動物モデルは、ILM（ - B図2A）の構造における変動を示している場合ShH10を使用してミュラーグリア細胞の網膜の伝達を増加期待しています。例えば、我々は野生型マウス^16（ - F図2C）と比較して、このマウス系統におけるILMの透過性の増加を示す、硝子体内注射によって、そのDP71、ShH10標的の非存在下で特異的に、より効率的にミュラーグリア細胞を示している。

AAV5もILM透過性の指標として使用することができる。野生型マウスにおける硝子体内注射による効果のないAAV5は、このようなDP71ヌルマウス¹⁶として、または他の網膜変性^22（ - H図2G）、侵入した網膜の障害を持つマウスにおける光受容体への遺伝子送達において強く有効となる。これはさらに、ILMの解体と潜在的な透過性increasを確認網膜神経細胞の周囲の細胞外マトリックスの電子。

ディスカッション

BRBは、血液および網膜の間の分子の交換を調節する。その内訳は、糖尿病性網膜症または加齢性黄斑変性症（AMD）などの種々の疾患と関連している。我々は最近、透過BRBを表示ジストロフィンノックアウトマウスにおいて、網膜は、アデノ随伴ウイルスベクター（AAV）によって媒介される遺伝子送達に対してより寛容になることを示した。しかし、BRB透過性AAV粒子にもかかわらず、眼内に、このモデルにおける眼の区画に閉じ込め滞在を注射。我々の結果は、透過性のBRBを表示する疾患に対する遺伝子治療は、全身性の副作用の追加のリスクを表していないことを示している。さらに、それらは、ILMのような他の障壁は、ウイルス粒子へのより良いアクセスを許可する網膜疾患の間に妥協になるという事実を支持している。我々の調査結果は、AAVコード化レポーター遺伝子は網膜疾患の動物モデルにおいて、BRB透過性とILMの整合性を研究するための優れたツールであることを考えるように私たちを導く。 Particularly、特にミュラーグリアにラベルを付けるAAV変種ShH10は、網膜のグリアにラベルを付け、疾患に応じて、網膜の状態を報告するためのツールと​​して使用することができます。...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
C57BL6Jマウス	JANVIER LABS		マウス
ケタミン500	Virbac フランス		麻酔薬
キシラジン ロンプン 2%	、バイエルヘルスケア		麻酔薬
ネオシネフリン 5%、フォーレ	ユーロフタ		拡張剤
Mydriaticum 0.5%	、テア		ジラタント
Sterdex	Novartis		抗炎症
クライオマトリックス包埋樹脂	Thermo Scientific	6769006
Superfrost Plus 接着スライド	Thermo Scientific	10143352	スライド
抗ラミニン	Sigma	L9393	抗体
抗ロドプシンクローン 4D2	ミリポア	MABN15	抗体
抗グルタミン合成酵素クローン GS-6	ミリポア	MAB302	抗体
抗グリア線維性酸性タンパク質	Dako	334	抗体
PNA レクチン	Invitrogen	L32459	プローブ
Alexa fluor 標識二次抗体	Invitrogen		抗体
Fluorsave 試薬	Calbiochem	345789	封入培
QIAmp DNA マイクロキット	QIAGEN	56304
GoTaq DNAポリメラーゼ	Promega	M3001
Evansブルー染料	グマ	E2129	染料
5 µmフィルター	ミリポア
エン酸ナトリウム	シグマ	S1804
エン酸	シグマ	C1909-2.5KG
ホルムアミド分光光度	シグマ	295876-2L
フルオレセイン	シグマ	F2456	染料
ミクロンIII	フェニックス研究所		3-CCDカラーカメラ、フレームグラバー、および既製のソフトウェアに基づく顕微鏡システムにより、研究者はマウスの網膜をイメージングできます。
インスリン注射器	テルモ	SS30M3109
シリンジ 10 & マイクロ;l ハミルトン	・ダッチャー	74487	セレンゲ 1701
ニードル RN G33、25 mm、PST 2	フィッシャー サイエンティフィック	11530332	硝子体内注射
UltraMicroPump UMP3	ワールド プレシジョン インスツルメンツ	UMP3	汎用性の高いインジェクターは、マイクロシリンジを使用してピコリットルの容量を供給
UltraMicroPump (UMP3) (1) SYS-Micro4 コントローラー	UMP3-1	デジタル コントローラー
双眼拡大鏡 SZ76	ADVILAB	ADV-76B2	ズーム 0.66 x 5 x LED スタンド付き エピと直径 / 網膜解剖
春のはさみ ストレート - 8.5 cm	Bionic France S.a.r.l	15003-08	網膜解剖
湾曲 バンナはさみ	15004-08
Pince Dumont 5	11254-20
Veriti 96-Well Thermal Cycler	Life テクノロジー	4375786	サーモサイクラー
超音波洗浄機	実験室用品	G1125P1T
Nanosep 30k オメガチューブ	VWR
Speedvac	ッシャーサイエンティフィック	SC 110 A
分光蛍光光度計	TECAN	無限 M1000