ゼブラフィッシュ胚における機械的血管損傷

サマリー

この記事は、ゼブラフィッシュの胚に機械的な血管損傷を作成する方法について説明しています。この損傷モデルは、リアルタイム顕微鏡検査に最適な生物の止血、損傷関連炎症、および創傷治癒を研究するためのプラットフォームを提供します。

要約

ゼブラフィッシュ(Danio rerio)の胚は、さまざまな発生過程や病気の過程を研究するための強力なモデルであることが証明されています。 外部発生と光学的透明性により、これらの胚は特に顕微鏡観察に適しており、特定の細胞タイプを蛍光タンパク質で標識する多数のトランスジェニック株が利用可能であり、ゼブラフィッシュの胚は、in vivoでの損傷や修復中の血管、造血、およびその他の細胞タイプの相互作用を視覚化するための理想的なシステムとなっています. ゼブラフィッシュのフォワード遺伝学とリバース遺伝学は十分に発達しており、薬理学的操作が可能です。これらの特徴のいくつかを利用して、止血や血管修復などの血管損傷に対する反応を研究するマイクロマニピュレーション技術を使用した機械的血管損傷モデルについて説明します。ビデオ顕微鏡とタイムラプス顕微鏡の組み合わせを使用して、この血管損傷の方法が止血および創傷修復中に測定可能で再現性のある反応をもたらすことを実証します。この方法は、全動物モデルで血管の損傷と修復を詳細に研究するためのシステムを提供します。

概要

ゼブラフィッシュは、血管の発達、血管新生、造血の発達と病理学^1-3など、血管生物学のさまざまなトピックを研究するために広く使用されてきました。胚は、受精後1日(dpf)^1,4,5までに、白血球や自然免疫系の他の構成要素と同様に機能循環を発達させます。損傷に対する炎症性および白血球の反応の保存により、ゼブラフィッシュの胚は、結核性感染症、腸炎、組織再生^6-9などの多様な炎症過程の情報モデルとなっています。ゼブラフィッシュの胚は、特に上皮創傷と好中球反応の文脈で、損傷関連の炎症を研究するために使用されてきました^10,11。胚の損傷は、損傷部位の細胞からの高度に保存された細胞応答と、損傷に応答してその分解能を調節するために動員された自然免疫細胞^11,12をもたらします。他の損傷モデルでは、集束レーザーパルスを使用して、ニューロン、筋肉細胞、心筋細胞などの特定の細胞タイプに損傷を空間的に局在化しています^13-15。

ゼブラフィッシュの胚は、薬理学的および遺伝的操作の条件下での止血および血栓症を研究するためのモデルとして使用されてきました。これは、機械的およびレーザーによる血栓形成の両方を使用して行われます^16-19。凝固カスケードの成分はよく保存されているようであり、トランスジェニックは凝固部位での血小板およびフィブリン沈着の詳細な研究を可能にしました^17,20,21。この論文で紹介する手順は、血管の破損、血栓の形成と解決、および血管の修復につながる機械的な血管損傷を研究するためのシステムを提供することにより、これらの方法を補完します。

プロトコル

注：ゼブラフィッシュを使用した手順は、UCSFの施設内動物管理使用委員会によって承認された。

ツールの調製

1. ピンホルダーに特徴点のピンを挿入し、ピンをクランプ。
2. 先端の細い鉗子を使用して、慎重にわずかにフックを作成するために、ピンの先端を曲げる。
3. 負傷中の胚の操作および安定化のために、ラジオペンチを使用して、インスリン注射器に取り付けられた28ゲージ1/2インチの針の端を曲げ。

傷害のためのゼブラフィッシュ胚の作製

1. ゼブラフィッシュの繁殖ペアを設定し、以前に²²示すように、卵の水（60ug / mLの水族館塩）で卵を集める。
2. 胚はメラニン化を防ぐために、約8時間後に受精（HPF）であるとき、卵の水に0.003％、N-フェニルチオ尿素（PTU）を追加します。
3. 先端の細い鉗子を用いた実験に先立ってDechorionate 2日後の受精（DPF）の胚。
   注：循環開始後胚はいつでも怪我をすることができます。ここに示されたデータは、胚のdpf 2のためであるが、技術は成功し5のdpfまでの胚で適用されている。
4. 0.02％緩衝化3-アミノ安息香酸（トリカイン）前の操作に約10分を有する胚を麻酔。

胚の3。機械的血管損傷

1. 転送ピペットを用いて、解剖実体顕微鏡でうつ病のスライドに麻酔をかけた胚を転送します。
2. 利き手で胚を操作するために注射針の短い平らな面を使用して、腹面が針から離れて向けてその側に胚を配置する。
3. 先端で特徴点のピンの位置を決め泌尿生殖器の開口部に魚の後部の腹面に対して直接指摘した。湾曲した先端が尾静脈（ 図1 <に直接周皮を貫通することができるようにわずかな角度で特徴点のピンを配置します/強い>）。
4. 胚を操作するために注射針を使用して、少し静脈にピンをフックするピンに胚をタップして特徴点ピンと尾静脈を貫通。
5. 注射針を使用して、容器内の小さな涙を作成するために離れて特徴点ピンから胚を引き出します。
   注：成功した損傷は静脈から即時の出血になります。

止血4.分析

1. 目に見えて、この手順のために血液細胞の循環を持つ唯一の胚を選択してください。
2. とすぐに特徴点ピンが容器から引っ張られるようにタイマーを開始する準備をします。
3. とすぐに血液損失を傷から可視化することができるようにタイマーを起動します。傷口からの血液損失がなくなると、タイマーを停止し、出血時間として総時間を記録する。凝固が抑制される場合には、もはや目に見えて循環する血液細胞が存在しないときまでの時間を記録する。

創傷治癒の5.分析

1. 転送POS顕微鏡用ガラスボトムイメージング皿上にT-傷害動物。
2. 卵の水の大部分を削除します。
3. アガロース42〜45ºCに加熱し、卵の水に溶解し、0.02％トリカインで補充0.3から1.2パーセントの低融点で胚をカバーする。
4. ピンセットを用いて、その両側に位置胚。
5. アガロースが冷却した後、卵の水中の0.02％トリカインで料理を埋める。
6. 明視野、落射蛍光、または共焦点顕微鏡を用いて画像を取得する。
7. ピンセットを用いてアガロースから胚を取り出し、卵の水に戻って転送する。

結果

機械的な血管損傷が2 dpfの胚（ - C図2A）で行った。 （ 図2D）出血の停止までの時間によって測定されるように、迅速かつ信頼性の高い凝固応答の傷害をもたらす。凝固応答の差異を測定することができたか否かを判断するために、抗凝固ヒルジンはのために（直前に（水に溶解μlのヒルジンあた​​り1単位の5~10オランダ）を創傷にキュビエのダクトへの注入によって胚に投与したキュビエのダクト内に注射のデモンストレーション、前回のJoveの記事^23）24を参照してください。損傷前にヒルジンの投与は、車両制御（ 図2D）対出血時間の増加大幅にもたらした。

と赤血球（gata1a：DsRedの：血管損傷及び凝固の証拠は、直ちに損傷後の内皮のためのトランスジェニック系統（EGFP kdrl）を使用して見ることができますEM>）25,26マーカー。画像を順次エピ蛍光を用いて、12時間の期間のために5分ごとに取得...

ディスカッション

ゼブラフィッシュは、レーザー傷害^13-15、レーザー誘発血栓^16、および上皮創傷¹⁰を含む創傷の異なるタイプのモデルとして成功裡に使用されている。我々は、実行が簡単であり、リアルタイムの顕微鏡検査に非常に適しているin vivoモデルで制御怪我を生産機械的損傷の方法を報告している。迅速かつ測定可能な止血応答映像やタイムラプス顕微鏡を用いてモニターすることができる再現可能な創傷修復プログラムで損傷をもたらす。

そのシンプルかつ血管微視的に定義され、アクセス可能な部位で再現性のある損傷を許容する解剖学、最も血管および造血細胞型の存在をステレオタイプは、傷害に対する応答を研究するためのゼブラフィッシュ胚を特に有用にする。しかし、ゼブラフィッシュの胚は、ほとんどのAPこのシステムを作り、開発^5,6の最初の数週間の間に機能的なリンパ球を持っていない炎症および修復における自然免疫の寄与を研究するためpropriate。現在、トランスジェニックゼブラフィッシュの多種多様な血小板、フィブリノゲ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
微細ピン	ファインサイエンスツール	26002-10	先端直径0.0125 mm、ロッド直径0.1 mm
ピンホルダー	ファインサイエンスツール	26016-12
モン#5ファインチップ鉗子	ファインサイエンスツール	11254-20
ガラス窪みスライド	水生生態系	M30
低融解アガロース	ロンザ	50081	42 & ordm;C
N-フェニルチオ尿素 (PTU)	シグマ アルドリッチ	P7629
3-アミノ安息香酸 (トリカイン)	シグマ アルドリッチ	E10521
ヒルディン	シグマ アルドリッチ	H7016
ガラス底イメージングディッシュ	マットテック	P35G-1.5-14-C
解剖顕微鏡	オリンパス	SZH10
蛍光顕微鏡	ツァイス	アクシオオブザーバー
水族館塩	インスタントオーシャン
インスリンシリンジ28.5G針	ベクトンディキンソン

デュ329461