ハイスループットの使用インビトロマイクロ流体システム

Summary

この方法の論文の目的は、典型的にはヒト歯肉縁上の歯垢内で識別種を含む多種バイオフィルムの開発のための微小流体システムの使用を説明することである。バイオフィルムのアーキテクチャ、バイオフィルムの生存率、および文化に依存またはカルチャに依存しない解析が強調表示されるための収穫バイオフィルムへのアプローチを記述するための方法。

Abstract

いくつかのハイスループットは、一般に、インビボでの経口バイオフィルム内で検出された多数の種を含む多種バイオフィルムの発達を促進するインビトロ系である。また、代わりに人工のメディアの、栄養源として天然のヒト唾液を使用するシステムは、 インビボでのコミュニティを模倣する細胞およびバイオ固有のプロパティの表現をサポートするために特に望ましい。我々は、ヒト口腔と同様の条件下で、歯垢、歯肉縁上ために、種の組成物に関して、同等である多種の口腔バイオフィルムの開発のための方法を記載する。具体的には、この方法の記事は、市販のマイクロ流体システムは、から誘導される多種の口腔バイオフィルムの発達を促進するように適合され、そしてプール唾液内で成長させることができる方法を説明する。さらに、どのようにシステムの説明はconfocaと組み合わせて使用​​することができる建築および生存分析のために3-Dバイオフィルム再構成を生成するためのLのレーザ走査型顕微鏡が提示される。 （ 連鎖球菌 、 ナイセリア 、 ベイヨネラ 、 双子菌属 、及びポルフィロモナス含む）マイクロ流体システムにおけるバイオフィルム内で成長する微生物の幅広い多様性を考えると、プロトコルは、さらにサブカルチャーやDNA抽出および分析のためにバイオフィルム細胞を採取する方法を説明した表示されます。微小流体バイオシステムと現在の最先端のデータ分析の両方の限界に対処する。最終的には、この物品は、口腔バイオフィルムの研究を向上させ、マイクロ流体プラットフォームに統合することができる付加的な技術の開発に助けとなるベースライン技術を提供することが想定される。

Introduction

バイオフィルムは、アーキテクチャ^面 1,2に集約された細菌の複雑な社会である。これらのコミュニティは、一般的にバイオフィルム²内の互いに対話多数の種が含まれている。オーラルバイオフィルム、最も視覚的に目立たなく歯垢は、ヒトでの永続的な問題と分類学的に多様なマルチ種コミュニティ³の世代での制御されていない開発の成果である。これらの多様なコミュニティの構成要素細菌は彼らのフリーフローティング（プランクトン）の対応^4-6より抗菌剤に対する耐性が1,000倍までとすることができる。虫歯や歯周病を引き起こす可能性がこれらの経口バイオフィルムのコミュニティを、治療の失敗は、重大な公衆衛生上の負担な結果になっています。5億以上の米国における年間歯科医のオフィスを訪問し、約1080億ドルを歯周の治療または予防のために、病気や虫歯^7。

⁸ -Smithコンテンツ">" 多くの微生物学者は、自然条件の下での微生物の挙動を研究提唱しているが、それらのいくつかがそう。困難を克服するための彼らの士気は常に実験室の培養での作業の魅力的な容易さによって搾り取っているためです 。」。

現在、口腔バイオフィルムの研究はインビボおよびインビトロのアプローチの多様性を用いて行われる、独自の長所と、それぞれが^9,10不利。 インビトロでは 、多くの場合、セットアップするのが比較的容易であるが、臨床欠いてモデルバイオシステムを使用近づく/現実世界の関連^10,11。 インビボで ^、典型的にはヒト口腔環境の特定の局面を再現するが、やはりにより動物とヒトの間で¹²解剖学、生理学、微生物学および免疫学の違いに制限を受けることができる動物モデル系に依存して接近する^13。それは、口腔バイオフィルムに留意すべきであるまた、ヒトのボランティアの口の中にステントに保持されているエナメル質表面上に現像され、このアプローチは、現在、比較的高価であり、労働集約^14,15であることができる。最終的には、新規薬剤または口腔ヘルスケアを改善するための技術は、制御された臨床試験の条件の下で¹¹ヒトで試験されている。現在では、新しい経口の医療薬剤を同定し、評価するためのよく使用する手口は、まず潜在的有効性を識別するために実験室での研究を行うことで、その後の動物研究と技術⁹の成功を評価するために臨床医を採用する「実地試験」を実行^{、 16,17。}残念ながら、実験室での研究は、大面積を占めるモデル系に依存する傾向が使用する技術的に挑戦的であり、しばしば^10,18を意味する可能性のある現実世界を導出するために、1つのまたはほとんどの少数の種で簡略化コミュニティを含む。歯垢バイオフィルムはCOMPLに複数の種とフォームが含まれていることを考えると唾液環境を流れるexは、人工培地でつを含むバイオフィルムまたは数種の開発は実際のシナリオ^10,19のものと同様に挙動するコミュニティを生成する可能性は低い。時間、コスト、訓練要件、及び実際の環境と比較して、実験室モデルバイオフィルムシステムの貧弱な代表的な性質に対処するために、我々は最近、ハイスループットかつ環境ゲルマンバイオシステム^20（ 図1）を開発した。接種材料として培地および未処理のプールされたヒトの細菌細胞を含有する唾液（CCS）などの無細胞のプールされたヒト唾液（CFS）の使用によるシステムの利点。独自に、システムはまた、マイクロ流体技術、共焦点レーザー走査顕微鏡、および文化に依存しない細菌多様性の解析技術を組み合わせた。このように、モデル系は37で、多種のバイオフィルムを成長させるために接種物として唾液を使用して（環境的に密接​​な関係である 濾過滅菌流れる中で°C唾液）と口腔バイオフィルムは初期の歯肉縁上プラーク²⁰に見られるものの存在量を代表に連鎖球菌 、 ナイセリア 、 ベイヨネラ 、及びポルフィロモナス種を含む種を（）が含まれています。

この作品は、新たに開発したモデルシステムの使用が記載されていることを考慮すると、特に注意は、共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）マイクロフルイディクス、および文化に依存しない多様性解析技術の融合を考慮しなければならない。私たちの研究グループによるこれらの技術の労働組合は、意図的だったとだけでなく、新たに開発されたモデル系に高スループットの機能を追加するだけでなく、質問は簡単に他のシステムとの前に対処しなかったことを尋ねられることを可能にする。それはバイオフィルムの三次元解析が可能になるように、まず、CLSMは、従来の顕微鏡検査に比べて明らかな利点を有する。バイオフィルムは異質ウィットあるように頻繁に正しく評価されていない、これは非常に重要です。時間種組成と空間位置に対してだけでなく、生理的な条件は、バイオフィルム^6,21内の異なる空間的位置に課されている。 3次元レンダリングソフトウェア、画像分析ソフトウェアと協調して、バイオフィルムのアーキテクチャコンポーネント種間の空間的関係、および抗菌死滅の程度は^{、22〜24を}分析することができる。このような能力は、標準的な透過光またはエピ蛍光顕微鏡を使用して可能ではありません。それは慎重に制御された条件（流量、温度、pH値、 など ）の下でバイオフィルムの研究を可能にし、液体のみ^25-27の小さなボリュームを必要とする次に、マイクロフルイディクスは、微生物学の分野で特に注目を集めています。達成されたものと同様の流速及びせん断で20時間フローセルモデル系（ほぼ間違いなく、多くの口腔バイオフィルムの研究のための主力モデルと考えられているシステム）内のヒト唾液の経口バイオフィルムの成長の比較点としてマイクロ流体デバイス^28〜31に800μlのとは対照的に、マイクロ流体システムにおいて、少なくとも200ミリリットルが必要である。このように、マイクロ流体モデルバイオフィルムシステムは、規定された条件下で数量限定の材料の研究を可能にします。最後に、パイロシーケンシング技術は、社会の分析を実行するために材料を少量しか必要とする過去10年間に最適化され、さらに希少バイオ種の同一性を得るために、配列決定の深さを制御するのに十分な汎用性がありされている。そのような細菌のタグエンコードされたFLXアンプリコンのパイロシーケンシング（bTEFAP）としてこの技術の使用は^、32,33の対処すべきバイオフィルムの生態に関する適切な質問を可能にした。このような質問は、ピロシーケンスが原因で、プラスミドライブラリやデータ^33,34を引き出すために必要な複雑な技術や分析の手順を作成するために必要な時間とコストのため利用できませんでした、過去の困難を吹き込ま。もちろん、文化に依存しないAPとの大きな利点従来の実験用培地（ すなわち 、生存するが、非耕作種）内で分離して成長させることができない細菌種が成長し、識別されたモデルシステム内で、コミュニティ内での相対的な存在量は^35、36を定量することができるようにパイロシーケンシングなどproachesを、ある。視点を追加するには、早くも1963年のように、後半ジークムントSocranskyはヒト口腔歯肉裂け目から単離された物質中の細菌の約50％が実験室の成長条件^37を用いて培養することができなかったと推定。

その種組成と豊かさと人間の口腔の（I）の条件の代表と、（ii）：このメソッド紙の目的は、下に市販のマイクロ流体（Bioflux）システムの経口マルチ種のバイオフィルムを開発するためのアプローチを説明することである歯肉縁上プラークに匹敵する。さらに、両方のフリーウェアや商用ソフトウェアを使用して、私たちはどのように基本的なバイオフィルムを強調アーキテクチャ対策がバイオフィルムのバイオマス、粗さ、および生存を定量化するためのアプローチに焦点を当て、CLSMデータから導出することができる（ライブ/デッド染色に基づく）。最後に、bTEFAPによって多様性解析のためのバイオ材料を収穫するために必要な手順が記載されている。

Protocol

明細書に記載の唾液収集プロトコルは、人体実験のためにミシガン大学倫理委員会で検討した。
注：このタイプのヒト対象作業のための制度的レビューに関しては、事前に手配と許可がホスト機関から獲得する必要があります。具体的には、金融機関によっては、IRBまたは倫理の承認は、ヒトボランティアから唾液収集を進める前に求め、承認が必要になることがあります。アプリケーションの準備の助けとして、便利NIHアルゴリズム/チャートはここで見つけることができます： http://grants1.nih.gov/grants/policy/hs/PrivateInfoOrBioSpecimensDecisionChart.pdf

環境ゲルマン成長培地として使用するためにプールされた唾液の調製

1. 唾液の寄付のために> 5個人を募集。何individuのないことを確認、すべての識別情報を服用しないでください彼らは病気である、または過去3ヶ月で経口抗生物質をとっている、または食べ物や液体を消費した場合、ALSは、寄付前に、前の2時間で、水を除いて、唾液を寄付します。
2. 50ミリリットルのプラスチックチューブに唾液を収集します。氷上で維持し、プラスチックビーカーに集めた唾液​​をプールする。唾液中のポリマーは、内部のガラス表面に付着するようにガラスを使用しないでください。
3. 100×ストックからの2.5mMの最終濃度までジチオスレイトール（DTT）を加える。 （ストックは-20℃で、単回使用のアリコートで凍結されている °C）。氷上のプラスチック製ビーカー中で10分間攪拌する。
4. 粒子状物質を除去するために、遠心17500×gで30分間、プールされた唾液。
5. 四分の一に濃縮唾液を与えることのdH ₂ Oの3倍量の唾液を希釈します。
6. フィルター滅菌し、0.22μmのポリエーテルスルホン（PES）、低タンパク質結合フィルターを使用して唾液。大きな表面積のフィルタを使用するか、いくつかの小さな領域フィルタを使用。に唾液を保つフィルタリングしばらく氷上のプラスチック容器。
7. -80プールされた唾液をフリーズ  50ミリリットルのプラスチック管で°C、細菌を成長させるために必要になるまで。各プラスチック製のチューブは一つだけの使用のためであり、各マイクロ流体ウェルが1.2ミリリットルの最大（1.2ミリリットル×24井戸= 28.8ミリリットル）を保持し、唾液が凍結中拡大するようにスペースが各チューブに必要とされるようにせいぜい35ミリリットルを含めるべきではない。
8. 使用のために、室温で、プールされた唾液を解凍。一度解凍した、（すべての沈殿物を除去するために0.22μmのポリエーテルスルホン、低タンパク質結合フィルター）もう一度フィルター滅菌する。

接種物として使用するためにプール唾液の調製

1. 唾液の寄付のために> 5個人を募集。寄付する前に、前の2時間で、水を除いて、過去3ヶ月で経口抗生物質をとっている、または食べ物や液体を消費している、すべての識別情報を取る彼らが病気であれば全く個人が唾液を寄付しませんを確認しないでください。 SAを収集30分かけてmples。
2. 室温で50ミリリットルのプラスチック管で唾液を収集し、室温でプラスチックビーカーに集めた唾液​​をプール。
3. 25％グリセロール、75％の細胞含有唾液[CCS]の最終比率で株式を得オートクレーブ一般的な試薬級グリセロールでプールされた唾液を希釈する。
4. 必要になるまで3ミリリットル使い捨てのアリコートで-80℃で唾液をフリーズします。
5. マイクロ流体システムに接種するために必要に応じて、アリコートを以下のプロトコルのステップ3で説明したようにマイクロ流体システム中にピペットされる前に室温で解凍し、5秒間ボルテックス上で穏やかに撹拌さ​​れている。

オーラル多種バイオフィルムの3成長

1. CFS前処理
   1. まずコートCFSとBiofluxマイクロ流体チャネル。各ウェルコンセントにCFSの100μlのを追加します。 Bioflux制御ソフトウェアを使用して、チャンネルから「手動」と設定フローを選択「B1-B24」THAtが使用される。
   2. 次に、1.0ダイン/ cm 2の剪断力に設定し、チャネルを通じてCFSの均一な分布を確実にするために室温で2分間フローを開始する。 CFSが均等にすべてのチャネルを通って流れていることを確認するために、各入口チャネル内の流体があることを確認します。
   3. 20分間室温でプレートをインキュベートする。
   4. 出口ウェル中に残っているCFS /前処理液を除去し、入口ウェルに移す。 100μlのこの総量はよく口から接種物に適用されている圧力に抗してバランスを取るのに役立つでしょう。
2. 接種
   1. 各ウェルコンセントに、CCS接種の100μlを添加する。正確に6秒間1.0ダイン/ cm 2の入口ウェル（ すなわち 、逆方向）へのマイクロ流体熱板上のプレート（温度37℃に設定）、制御ソフトウェア内の[手動]を選択し、出口ウェルからの設定の流れを置きます。
   2. 可能にするために40分間37℃でマイクロ流体プレートをインキュベート初期付着および接種物中の細菌の成長のため。
3. 一晩増殖
   1. 接種したチャネルが使用されるために、出口の各ウェルからの廃接種材料を吸引する。 （既存のCFSの上に行うことができる）の入口の各ウェルに1mlにCFSの全量を加える。
   2. 37℃でのマイクロ流体プレートをインキュベート、手動選択して、20時間0.2ダイン/ cm 2の時に実行するプログラムを設定する。
4. ステイン予備洗浄
   1. すべての入口と出口のウェルからの流体入口を各ウェルにPBS（pH7.4）中の100μlを添加吸引する。 0.2ダイン/ cm 2で20分間のフロー。
5. 染色混合物の添加
   1. 細胞生存性染色のために染色される各チャネルの染色混合物100μlを作る。具体的には、LIVE / DEADなどの商用細胞生存性染色キットを使用して3 SYTO 9μlの3のPBS 1ml当たりのヨウ化プロピジウムのμlを添加する。これは生成し10μMSYTO 9および60μMのヨウ化プロピジウムを含む染色用混合物。
   2. 入口ウェルから残りのPBSを吸引した後、各ウェル入口に細胞生存性染色混合物100μlを添加する。 0.2ダイン/ cm ²の流れと、室温で45分間入口から出口にソリューションを実行するように設定。
6. ポスト染色ウォッシュ
   1. 入口ウェルの各々の残りの汚れを吸引除去し、各ウェル入口に100μlのPBSを追加。 0.2ダイン/ cm 2の時に流れ、余分な汚れを除去するために室温で20分間、入口から出口にPBS溶液を実行するように設定。

4.画像コレクション、3Dレンダリング、画像解析

1. 微小流体システムからのバイオフィルムの画像データを収集するために反転され、共焦点レーザー走査顕微鏡（CLSM）を使用する。 CLSMは150グラムに達することができるBiofluxプレートの重量に耐えることができることを確認してください。
   注：ダイムを考えるマイクロ流体チャネルのnsions、バイオフィルム構造を識別するための感度の必要性、および変化する強度の蛍光シグナルを検出するための要件は、40X 1.25 NA対物レンズ又は同様の光学的品質、倍率、開口数を有するものとCLSMに合う。
2. ゲインと発光キャプチャゲートを標準化し、オフセット測定が一定に保たれている。これは、光退色をもたらすことができるように、レーザパワーが25％を超えないことを確認してください。
3. 私はFのイルタイプOMEへ（LIF）（OペンのM icroscopy のE nvironment）ファイルタイプMAGE Lの EICAからCLSMファイルを変換する。これは、ソフトウェア·プログラムとの間のアクセスとの互換性をより容易に可能にする。この型にファイルを変換するようなIMARIS、などの市販のソフトウェアを使用してください。

画像/フィギュア用の3Dレンダリング

4. 一度画像をレンダリングするようIMARISとして市販のソフトウェアを使用して、OME形式に変換3Dで。 「Easy3D」と「突破」オプションを組み合わせて使用してこれを実行します。
   注：バックグラウンド信号と閾値化に注意がなされるべきである。 IMARISヒストグラム関数は、収集範囲を得るために使用することができ、これは、分析される画像間で一定に保たれるべきである。
5. 「 スナップショット 」機能を使用して画像を保存し、ファイルの種類を保存する前に画像の解像度を十分考慮してください。
6. そのようなCorelDrawのやAdobe Illustratorなどの画像編集ソフトを使用して図形に画像を組み立てます。

グラフや表のための3D画像解析

7. 画像解析のために自由に利用できるImageJの²³とCOMSTAT / COMSTAT2 ^38を使用してください。それぞれ、http://rsb.info.nih.gov/ij/とhttp://comstat.dk/からパッケージをダウンロードしてください。最新のJavaのアップデートがインストールされている。
   注：JavaはPRIOをインストールする必要がありますソフトウェアプラットフォーム画像解析ソフトウエアを使用することrは。
   1. 「 スプリットチャネル 」と「hyperstack」モードとビューの各バイオフィルムの画像のためOMEファイルをインポートするCOMSTAT2プラグインでImageJソフトウェアを使用してください。
   2. 個別のImageJの「 ヒストグラム」機能を使用して（チャンネル1は緑/ SYTO-9 / LIVE、チャネル0は赤/ヨウヨウ/死んだ）つのチャンネルを分析。この関数は、無信号（バックグラウンド）と0である画素、255人間と、（「値」として示す）は、0〜255の各色の強度で（「カウント」として示される）8ビットOMEファイルの総画素数を示し完全な信号飽和を有するピクセル。
   3. 表計算プログラムにデータをエクスポートして、対応する信号強度によって各画素を重み付けすることによって、すべての信号値を標準化する。これは、信号強度の数値8ビット値（0〜255）によって与えられた信号強度で総数を乗じることによって行われる。
   4. キャプチャされた各バイオフィルム画像の両方のチャネルについて、すべての重み付けされた値、0〜255を合計。いずれかのチャネルからのパーセント全信号を決定するために、両方のチャネルの重み付けされた値の合計を取る。赤とパーセント緑信号（パーセント「死んだ」とパーセントそれぞれの治療のための「LIVE」IE）相対比またはパーセントを決定するためにこれを行います。
   5. 不等分散のために修正された両側スチューデントt検定を使用して、たとえば、統計分析を実行します。 p <0.05の値を有意であると見なしているとp <0.01これらの値は、非常に有意であると考えている。

文化·独立した分析5.収穫バイオフィルム細胞

1. 入口と出口の井戸からすべての過ごし、未使用の唾液を削除します。 1ミリリットル滅菌蒸留水で3回、ウェルを洗浄。
2. 入口ウェルに滅菌蒸留水100μLを加え、ソフトウェア制御インターフェースを使用して、合格少なくとも5分間、8.0ダイン/ cm ²の（流量> 745μlの/時間、800秒の剪断^-1）>におけるチャネルを介して前方に滅菌蒸留水。少なくとも5分間逆方向に繰り返し、その後前進を繰り返して、洗浄工程プロセスを逆転。
3. 徹底したバイオフィルム除去（ 図2）のために（細胞が染色された場合は、/ラベル）光によって、または落射蛍光顕微鏡によって確認してください。文化·独立した分析のために-80℃で100μlの細胞懸濁液とストアを収集します。コミュニティ組成物の費用対効果の分析は、ナンスらのアプローチを用いて細菌タグエンコードさFLXアンプリコンのパイロシーケンシング（bTEFAP）を使用してを介して達成することができる^。20

Results

バイオフィルムの3Dレンダリング

代表的な結果を図3に示す。IMARISソフトウェアの有用なツールを収集バイオフィルムスタックの各スライスを検討すると、三次元再構成を作成するためにそれらを結合するためのオプションである。また、人工的なシャドウイング効果は、視覚的に三次元構造の解釈を助けるために添加することができる。レンダリングされたバイオフィルムは、バイオフィルムまたはマイクロコロニーの構造を探索するために、異なる倍率で任意の方向に配向することができる。画像は、 図に示す。 3経口マルチ種のバイオフィルムの治療の結果を示している。特に注目すべきは、70％エタノールを用いた治療は、有意な細胞死または細胞損傷を示唆する（緑色から赤色に）バイオフィルムのほとんどの重要な色の変化をもたらしたことである。大型のマイクロコロニーは、基礎となる（と現在露光）マイクロコロニー細胞よりも多くの死細胞を含有するように見えた。 SUCエタノールが膜活...

Discussion

この方法は紙はセットアップに必要な基本的な手順を強調し、プールしたヒト唾液由来し、フィルター滅菌25％のプールされたヒトの唾液中で成長経口マルチ種のバイオフィルムの開発を可能にするような方法でマイクロ流体システムを実行します。バイオフィルムを特徴付けるためのアプローチが示されているが、これらの記載されるアプローチは、例えば、汚れやラベルを導入することができる、などの変更および追加技術であることを忘れてはならない。例の問題として、人はおそらく標識された抗体を使用するか、または可視および経口多種バイオフィルム内の特定の種の空間的な位置を検討する蛍光歪みを導入する可能性がある。さらに、使用されるマイクロ流体システムのモデルに応じて、それは嫌気性条件下でバイオフィルムを開発することが可能である（Biofluxシステムの場合には、テクニカルノートはこの主題についてFluxion.comで入手可能である）。

Biofluxマイクロ流体への重要な側面でICシステムは、複数の技術との互換性であり、これは、培養に依存しない多様性分析（ 図3）を実行する能力によって...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ファルコン50mlコニカル遠心チューブ	フィッシャーサイエンティフィック	14-432-22
ファルコン15mlコニカル遠心チューブ	フィッシャーサイエンティフィック	14-959-49D
ジチオスレイトール(白色結晶または粉末/電気泳動)、フィッシャーバイオ試薬	フィッシャーサイエンティフィック	BP172-5
ソルバル超遠心機 (SS-34対応)	Thermoscientific	Unit依存
型Thermo Scientific SS-34ローター	Thermoscientific	28-020
Thermo Scientific Type 1 試薬グレード脱イオン水	サーモ Scientific Inc	23-290-065
Nalgene Rapid-Flow フィルターユニットおよびボトルトップフィルター、PES メンブレン、滅菌済み。	VWRの	73520-986
グリセロール	サーモフィッシャーサイエンティフィック インク	NC0542269
BioFlux マイクロ流体システム	フラックス	バイオフラックス 200 システム
バイオフラックス 24 チャンネルプレート	フラクシオン	910-0004
PBS (Gibco)	サーモフィッシャーサイエンティフィック インク	10010023
LIVE/DEAD stain (Invitrogen)	Invitrogen	L7012
共焦点レーザー走査型顕微鏡	Lecia	SPEまたは等価システム
落射蛍光顕微鏡	複数選択	多肢選択
パイロシークエンシング施設	複数選択	多肢選択
Decon SaniHol 70 Ethanol Solution	フィッシャーサイエンティフィック	04-355-122
超低温冷凍庫 -80 °C	複数選択	複数選択のヒント
(20、200、1,000 μl)	複数選択
単一チャンネル可変容量ピペッター(20、200、1,000 μl)	複数選択	選択
Software
Bioflux専用ソフトウェア	Bioflux
Imaris	Bitplane
Leica SPE	Leica
ImageJ	フリーウェア (http://imagej.nih.gov/ij/)
COMSTAT/COMSTAT 2	フリーウェア (http://www.comstat.dk/)