腫瘍間質相互作用のための三次元共培養モデル

サマリー

ここでは、多細胞相互作用やがん細胞の挙動の細胞外マトリックス依存性調節を調査するのに役立つ、3次元での共培養のプロトコールを紹介します。この実験モデルでは、ヒトのがん関連線維芽細胞を包埋したコラーゲンゲル上でがん細胞を培養します。

要約

がんの進行(開始、成長、浸潤、転移)は、悪性細胞と周囲の腫瘍間質細胞との間の相互作用を通じて起こります。腫瘍微小環境は、細胞外マトリックス(ECM)に埋め込まれた線維芽細胞、免疫細胞、血管内皮細胞、周皮細胞、骨髄由来細胞など、さまざまな種類の細胞で構成されています。がん関連線維芽細胞(CAF)は、可溶性因子の分泌、血管新生、ECMリモデリングを通じて腫瘍形成促進の役割を果たしています。がん細胞の生存、増殖、遊走、浸潤の実験モデルは、主に二次元単細胞および単層組織培養またはボイデンチャンバーアッセイに依存してきました。しかし、これらの実験は、疾患臓器の生理学的または病理学的状態を正確に反映しているわけではありません。腫瘍間質または腫瘍マトリックスの相互作用をより深く理解するために、多細胞培養および三次元培養は、がん細胞の挙動の細胞間コミュニケーションおよびECM依存性調節を研究するためのより強力なツールを提供します。このような研究のプラットフォームとして、CAFの初代培養物を包埋したコラーゲンゲル上でがん細胞を培養する実験モデルを提示します。

概要

がん組織は、がんと腫瘍間質微小環境との間の密接な相互作用を通じて進化する器官の一種として認識することができます。これは、がん関連線維芽細胞(CAF)、免疫細胞、腫瘍血管、および細胞外マトリックス(ECM)で構成されています。CAFは、がん細胞に分裂促進作用、遊走促進作用、および侵襲促進作用を発揮する可溶性因子(サイトカイン、成長因子、ケモカイン)の主要な供給源です。また、腫瘍血管形成を刺激し、骨髄由来細胞(BMDC)などの前駆細胞を動員します。活性化されたCAFは、ECMの産生とリモデリングに関与しており、それによってがん細胞の増殖と拡散を促進します¹。CAFはまた、腫瘍細胞のコロニー形成と転移を促進するニッチを提供し、幹細胞の表現型を隣接するがん細胞に付与することができます。病理学的観察から、がん組織における間質反応または線維性変化が予後不良を示していることが示唆されている。最近の研究では、遺伝子シグネチャーなどの腫瘍間質の特徴が患者の予後を予測できることも実証されています。さらに、CAF由来の因子は化学療法に対する感受性を調節することができ、薬剤の感受性と耐性を決定する上でのCAFの役割が浮き彫り^{になっています2}。

CAFは、腫瘍微小環境内の異なる細胞タイプとCAFとの間の相互作用を媒介するシグナル伝達経路を通じて、腫瘍の進行を促進する上で多面的な役割を果たしているため、がん治療の新たな標的としてますます注目を集めています。がん微小環境内の細胞集団の不均一性は、CAFを標的とする上での障害となります。CAFのいくつかのマーカーが提案されており、α-平滑筋アクチン(α-SMA)、線維芽細胞活性化タンパク質(FAP)、線維芽細胞特異的プロテン-1(FSP-1:S100A4とも呼ばれます)などがあります。しかし、これらの分子マーカーは、非がん組織に存在する他の細胞とCAFを区別するために特異的ではありません³。したがって、CAFの特定の特性についてより多くの知識を得るためには、さらなる研究が必要です。この目的のために、初代培養CAFを患者に適合した正常な線維芽細胞と比較して特徴づけることは有益です。

最近、患者由来のCAFに関する分析がいくつかの癌タイプで報告され、非癌性組織に由来する線維芽細胞と比較したユニークな遺伝子発現パターンと細胞挙動が明らかになりました。ヒト肺がん組織から単離したCAFを用いて、三次元共培養法を開発し、肺CAFの性状評価を可能にしました。このモデルでは、肺がん細胞の浸潤、増殖、コラーゲンゲルの収縮に対するCAFの影響を調査し、肺CAFの腫瘍促進の役割を実験的に再現しました⁴。

プロトコル

注：この研究は、適切な倫理委員会によって承認された。

ヒト肺線維芽細胞の1。初代培養

1. 肺組織のコレクション：
   1. 直接の外科手術室からのヒト肺組織のサンプルを得る。できるだけ離れ腫瘍から収集した非癌性サンプルと、癌性及び非癌性肺組織から約1cm ³ブロックを収集します。
   2. 100単位/ mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシンおよび0.25 / mlのアンホテリシンB（無血清培地）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中でサンプルを懸濁する。無菌50mlチューブ中の浮遊サンプルを維持し、実験室に移す。
      NOTE：線維芽細胞は、上皮細胞、内皮細胞および平滑筋細胞などの他の細胞型と比較して高度回遊あり、増殖性。成長方法は、線維芽細胞のこれらの機能を活用し、かつoutgro組織切片から翼細胞は、線維芽細胞に豊富に存在する。いくつかの細胞継代後に、他の細胞型は、精製された線維芽細胞培養物中で得られる、生存し、10％ウシ胎児血清（FBS）を含むDMEM中で伝播することができない。細胞は、初代​​培養後3~7通路を使用することができる。
2. 細胞成長のための移植片培養およびコンディショニング：
   1. 修正⁵と以前に報告されたプロトコルを使用して、線維芽細胞の初代培養を行います。
   2. 研究室では、培地なし10cmの組織培養皿に組織サンプルを配置し、小さな切片に切断〜滅菌ピンセットとメスを用いて大きさ2〜3mmの。このプロセスの間、部分乾燥を避ける、そうでなければ細胞伸長の効率が損なわれる。
3. 上皮細胞層および結合組織の分離。
   1. 4℃で16時間培養2000 PU / mlのディスパーゼIを含む培地と培養中の切断組織切片を浸し。
   2. 皿に組織切片を転送し、隣接する結合組織から上皮細胞層を分離する。微生物の汚染を避けるために、クリーンベンチ内でセクションを処理する。
      注：上皮細胞の初代培養が必要な場合は、ステップ1.3を行う。唯一の線維芽細胞を単離することがある場合は、その後の移植片培養し、細胞の継代は、精製線維芽細胞集団をもたらす上皮細胞、のために不利であるため、ステップ1.3を省略します。
4. 組織切片の添付ファイル：
   1. 2メスを使用して1ミリメートル片に組織をミンチ。片が十分に小さくない場合は、皿からより容易に切り離して、細胞をディッシュ表面に脱却することができないであろう。
   2. 各ピースを囲む空の領域を維持するために、互いに離間して小肺組織切片を置く。組織切片の取り付けを容易にするために、手術用メスの刃を用いて組織培養皿の表面に傷を作る。
      注：スクラッチまた、細胞が移動することができ、それに沿ってトラックを提供し、細胞成長を促進するために表示されます。
      1. 代替的に、個別に6ウェルプレートの各ウェルに細分化した組織片を置き、カバースリップでそれらをカバー。シリコーングリースを使用したプレートの表面にカバースリップを取り付けます。
      2. 無菌のピンを使用して、各ウェルに1.5センチメートル離れた2点でのシリコーングリースを配置します。組織片のカバレッジは、いくつかの継代後の細胞成長および細胞増殖の効力を増強する。
5. その後の移植片培養：
   1. サンプルが完全に乾く場合は、効率的な細胞成長は大部分が失われているように、組織切片は、完全に乾く前に静かに皿に培養液を追加します。あまりにも急速に組織切片を切り離すと同じようにメディアをかけないでください。
   2. 10％のFBSを含むDMEM中で培養細胞。追加の浮力から脱離を促進するようにそれは、浮動可能にすることをあまりにも多くのちょうど組織をカバーするために十分なメディアを使用してではなく、一品。
6. 細胞継代：
   1. 培養皿の繰り返し運動が組織切片の剥離につながることができように、常に注意して培養液を処理します。
   2. 5-7日間、37℃のインキュベーターで培養皿を置きます。一日おきに培地を更新し、培地交換の際に最小限の培養皿を扱う。線維芽細胞は、今後数週間にわたって組織切片の端から脱却する。
      NOTE：〜2-3週間後、外部増殖線維芽細胞は、ほとんどの表面積の量に依存して、コンフルエンスに達する。
   3. 1×PBSで細胞を洗浄し、私はプレートにトリプシンの1ミリリットルを追加します。
   4. トリプシン処理後、10％FBSを補充したDMEMの9ミリリットルを用いて細胞を切り離す。組織切片と一緒に、10ミリリットルチューブ内の培地に懸濁した細胞を収集します。細胞ペレットを形成するために遠心分離した後、新しい培地で得られたペレットを再懸濁する。
   5. 新しいCUL上に細胞や組織切片をシードトゥーレの料理は、その時点で組織は、細胞が付着し、成長しながら、皿に​​取り付けることができない。翌日、吸引により、浮遊組織片を除去し、培地を変更してください。添付線維芽細胞は、その後の文化に伝播する。

ヒト肺癌線維芽細胞と癌細胞の2三次元共培養

1. 細胞および試薬の調製
   1. 約2×10 ⁵上皮細胞およびウェルあたり2.5×10 ⁵線維芽細胞を使用しています。コラーゲンタイプIA（3 mg / mlの、pHが3）、FBS（100％）、再構成緩衝液（50mMのNaOH、260ミリモルのNaHCO _3、200mMのHEPES）、5×DMEMを調製し、DMEMは、線維芽細胞培養10％FBSを補充した3次元共培養培地（1：癌細胞に対する線維芽細胞培養培地および培地の1：1混合物）。
   2. 培養A549肺腺癌細胞、線維芽細胞およびDMEM中でA549の三次元共培養は、10％FBSを補充した。
2. コラーゲンゲルfはormation：
   1. 1×PBSで10cmディッシュ上で培養した線維芽細胞を洗浄し、プレートにトリプシンの1ミリリットルに私を追加します。 37℃で約5分間トリプシン処理した後、10％のFBSを添加した9ミリリットルのDMEMを用いて細胞を切り離す。 10ミリリットルチューブに培地に懸濁した細胞を収集し、細胞ペレットを形成するために、200〜300×gで、それらを遠心する。
   2. 5×10 ⁵ / mlの密度で、100％FBS中で得られたペレットを再懸濁する。
   3. 氷上のコラーゲンゲルを準備します。次の手順の前に冷蔵庫での試薬、ピペット、チューブクール。偶数氷上で、混合物をある程度固化し、全量を全成分の合計よりも小さい。
   4. 各ウェルに、（2.5×10 ⁵細胞）、線維芽細胞懸濁液を0.5mlとを混合してコラーゲンゲルを調製FBS、2.3ミリリットルタイプIAコラーゲン、670μlの5×DMEM、および330μlの再構成緩衝液中で。ゲルは、室温で容易に設定することができます。
      1. 激しく均質マイルを確実にするためにピペット固定装置。ペッティングプロセス中に気泡を作成しないでください。
   5. 6ウェルプレートの各ウェルに、混合物（3 ml）を添加し、30〜60分間妨害することなく、37℃のインキュベーター内でゲル化することを可能にする。
3. コラーゲンゲル上の癌細胞培養：
   1. ⁶変更を加えて、以前に報告されたプロトコルを使用して、3次元共培養を行います。
   2. 3D共培養培地に再懸濁癌細胞（またはA549細胞の場合は10％FBSを含むDMEM中で）1×10 ⁵ / mlの密度で。
   3. 各ゲルの表面上に再懸濁した細胞溶液2ml（2×10 ⁵細胞）を注ぐ。実験条件に依存して、共培養中の癌細胞または線維芽細胞の細胞数を変更する。
4. ゲル収縮：
   1. 癌細胞がコラーゲンゲルに付着することができるように、37℃で一晩ゲルをインキュベートする。各ゲルを切り離し、およびOを各ウェルに「浮遊培養 'を生成6ウェルプレートfは。
      NOTE：浮遊培養を使用することにより、ゲルの大きさの様々な変更は、共培養癌細胞と線維芽細胞との間の細胞の相互作用によって媒介される機械的張力およびコラーゲン分解によって誘導される。
   2. ウェルの端から各ゲルを分離するために角度の付いた21 G針や小さなへらを使用してください。 2〜3日おきに、3次元共培養培地2mlでウェルをリフレッシュ。 5日間毎日各ゲルの大きさを測定します。
5. コラーゲンゲルの分析：
   1. このようSircolアッセイコラーゲン定量法を用いて、各ゲルのコラーゲン含有量を測定する。ゲル⁵からRNAを収集した後、トランスクリプトーム解析または定量的RT-PCRを行います。

3.気液界面文化と浸潤アッセイ

1. 5日間37℃でコラーゲンゲルを培養した後、新たな6-メッシュ（70μmの孔サイズ）に配置して空気に収縮したゲルを暴露ウェルプレート。フローサイトメトリーのために使用される市販の細胞ストレーナーからメッシュを作成します。
2. 静かに3D共培養培地の11ミリリットルで、各ウェルを埋める。
3. 無菌のスプーンを使用してメッシュ上にゲルを置き、ゲルから、残りの培地を除去。空気にゲルの上面を露出しながら、この状態では、媒体中のゲルを水没。気液界面、この培養条件を定義する。
   注：インキュベーター中、37℃で気液界面培養を維持5-7日後に、浸潤性癌細胞がゲル中に移動する。細胞型および細胞の相互作用の結果として依存して、癌細胞の細胞形態変化の可変度は、気液界面培養によって誘導される。
4. 組織学的評価のために、室温で一晩ホルマリン溶液中でゲルを固定し、パラフィンに埋め込む。ヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）で垂直セクション（4μm）を染色する。免疫組織化学的分析のOを実行nはセクション^4。

結果

この共培養法は、腫瘍微小環境を模倣し、コラーゲンゲルに埋め込まれた癌細胞と線維芽細胞との間の相互作用を研究するための有用なツールである。コラーゲンゲル収縮、癌細胞浸潤および形態学的変化：以前の研究では、3つのパラメータは、この実験モデルで評価した。癌細胞の増殖はKi67の免疫染色^4を用いて推定した。肺の組織サンプルを切除肺葉（ 図1A）の癌性及び非癌切片から回収した。サンプルを小片に刻んだとDMEM中で培養し、10％FBS（ 図1B）を補充した。組織切片から成長した線維芽細胞は、顕微鏡（ 図1C）で観察した。初代培養肺線維芽細胞は、コラーゲンゲル中に包埋した（ 図2A、a）およびA549肺癌細胞をゲル上で共培養した（ 図2A、b）をフローティングCの後培地中のulture（ 図2A、c）は 、ゲルは、気液界面（ 図2A、d）の条件でさらに培養した。ゲルは、ホルマリンで固定し、免疫組...

ディスカッション

CAFSは、癌細胞の周囲のECMの主要な成分を形成し、腫瘍のための足場を提供するだけでなく、積極的に腫瘍の発達⁷に参加するだけでなく。証拠を蓄積すると、CAF媒介腫瘍進行⁸の重要な役割を強調し、最終的な予後上のCAFSまたはその関連分子の影響を解く。

以前の研究では、肺CAFS ^4を単離するための成長方法を用いた。この実験では、皿の表面上に組織切片接着の維持が重要である。細胞は、培地中に浮遊組織切片から移行することができない、組織切片表面から切り離されると、それらはもはや同じ培養皿上の細胞伸長のために使用することができない。組織の切断は、皿表面に付着するための接着剤として機能する排出物を、得られます。カバースリップを有する組織切片を固定する際に、使用されるグリース量もcritiあるCAL。グリース少量の過剰なグリースは、細胞培養領域を隠しながら、取り付けられたカバースリップを維持することができない。カバースリップを、適切な圧力を用いて組織切片の結合は、細胞成長を促進するための鍵である。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
FBS	GIBCO	10437
IA型コラーゲン	新田ゼラチン	CELL-1A
再構成バッファー	新田ゼラチン(株)
カバースリップ	NUNC	174934
シリコーングリース	ダウ コーニング東レ	高真空グリース
ディスパーゼ I	和光	386-02271
6ウェルプレート	BD ファルコン	353046
セルストレーナー (70 μm)	BDファルコン	352350