マウス骨髄単球の追跡インビボ

サマリー

単球は自然免疫の主要な調節因子であり、末梢の単核食作用系の更新や炎症の場合に重要な役割を果たします。この原稿では、単球の動員メカニズムを研究するためのマウスのカルバリア骨髄のリアルタイムイメージングの手順について説明します。

要約

リアルタイムの多光子イメージングは、生理学的3次元環境での細胞輸送と細胞間相互作用を研究する絶好の機会を提供します。免疫細胞の生物学的活動は、主にその運動能力に依存しています。血液単球は血流中の半減期が短いです。それらは骨髄に由来し、骨髄から構成的に放出されます。炎症状態では、このプロセスが促進され、血液モノサイトーシスとそれに続く末梢炎症組織の浸潤につながります。骨髄から血管網への単球輸送を制御する生体力学的事象を特定することは、単球の生理病理学的関連性を理解するための重要なステップです。Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP(MacBlue)マウスの頭蓋骨骨髄の2光子顕微鏡によるin vivoタイムラプスイメージングを行った。MacBlueマウスは、骨髄特異的プロ^{モーター1}の制御下で、血管ネットワーク標識と組み合わせて、蛍光レポーター増強シアン蛍光タンパク質(ECFP)を発現します。このアプローチにより、個々の髄質単球をリアルタイムで追跡し、骨髄実質と血管系内の移動行動、および細胞間相互作用をさらに定量化する方法について説明します。このアプローチは、骨髄単球サブセットの生物学に関する新たな洞察を提供し、これらの細胞が特定の病理学的状態においてどのように影響を受けるかをさらに解明することを可能にします。

概要

骨髄は造血において中心的な役割を果たし、血液と髄質の間を恒常的に循環し、^{短い寿命で}循環する単球のプールを更新し、定常状態の組織マクロファージと樹状細胞⁴の再構成に関与する単球の主要な貯蔵庫を表しています。.炎症中または一過性無形成後、単球は骨髄または脾臓^5、6、7のいずれかから活発に動員され、炎症を起こした臓器にコロニーを形成します。いくつかの走化性軸は、骨髄からの骨髄細胞動員のプロセスに関与しています8^、5、6、9。骨髄コンパートメントを超えて、骨髄はTリンパ球のプライミング¹⁰の重要な部位であり、免疫学的記憶のニッチ^11,12でもあります。したがって、この組織は、血液学および免疫学の分野における数多くの研究の中心です。髄様骨髄系細胞の構造組織に関する我々の知識は、主に固定組織の組織切片の解析から生じている¹³。この静的なビューでは、骨髄の機能的活性の基礎である骨髄の異なるコンパートメント間の細胞交換ダイナミクスの研究はできません。

生体内イメージングは、以前はin vitroシステムからのみ記載されていた細胞移動性、細胞接着、細胞間相互作用の研究において重要な生物学的インプットを構成しています。適切な生体内イメージングの技術的課題には、光学的観点から関心のある組織に到達する能力、生理学的(呼吸、筋肉、蠕動収縮)または機械的ドリフト(手術後の組織の破壊と伸展、顕微鏡の対物レンズへの曝露、温度、血管/酸素化の摂動)から組織を最大限に分離する能力が含まれます。微視的なドリフトは、焦点を長時間保持する能力を制限する可能性があり、細胞の運動性の定量化にアーティファクトをもたらす可能性があります。これらの技術的な困難を軽減するためにいくつかの組織で検証された1つの選択肢は、温常化および酸素化培地でインキュベートされた外植組織に取り組むことです。ただし、リンパ循環と血管循環の完全な混乱が問題になる可能性があります。頭蓋骨骨髄の生体内イメージングには、これらの問題に関していくつかの利点があります。まず、最小限の外科的作用が必要です。第二に、この領域の骨の厚さは、摩耗することなく骨髄ニッチを直接視覚化することを可能にするため、生理学的摂動が減少します。髄質ネットワークは、骨の傍矢状領域で画像化できます。ただし、正弦波は、骨基質が薄い前頭頂部でより目立ちます^12,14。

Intravitalイメージングは、関心のある集団をタグ付けする最も正確な蛍光レポーターの利用可能性に依存しています。養子移し前の精製細胞集団のin vitro標識は、造血幹細胞ニッチ¹⁵または腫瘍生着¹⁶に有利な骨髄内皮マイクロドメインの重要な特性評価につながり、免疫学¹⁷の主要な概念に関するいくつかの基本的なインプットを提供しました。しかし、このアプローチでは通常、後でin vivoで細胞を検出する機会を得るためには、数十万個の細胞が必要です。これは、染色後の死亡率が高いこと、全身で希釈されること、活性化状態が変化することで説明でき、ホーミングが偏っている可能性があります。トランスジェニックマウスシステムからの内因性標識は、これらの制限を大幅に克服し、内因性骨芽細胞⁸、巨核球¹⁸、または骨髄系譜サブセット⁶の挙動を画像化することを可能にした。それにもかかわらず、研究されたサブセットの中での蛍光レポーターの特異性を考慮する際には注意が必要です。

Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFPは、MacBlueマウス¹と呼ばれ、リアルタイムイメージング⁶で髄質単球を研究するための貴重なトランスジェニックシステムです。高分子量ローダミン-デキストランの静脈内注射は、髄質を骨髄の血管正弦波ネットワークと区別します。このアプローチを使用すると、関心のある特定の生理病理学的状況で、さまざまな髄質コンパートメントでの単球の挙動を追跡することができます。さらに、特定の抗体を使用したin vivo標識を通じて単球のダイナミクスを好中球のダイナミクスと比較する追加の戦略を提案します。

プロトコル

注：すべての実験プロトコルは、フランスの動物実験や倫理委員会によって承認され、番号A-75から2065に「サービスの保護らサンテAnimales、エンバ」によって検証された。サンプルサイズは、実験の再現性を確実にするために選択され、動物の倫理規定の3Rに応じている。

マウスの作製

1. 麻酔
   1. イメージングの短時間（1時間未満）のために、ケタミン（100mg / kg）およびキシラジン（10mg / kgの）を含有する生理食塩水200μlを腹腔内注射してマウスを麻酔し。
   2. あるいは、（4時間まで）イメージングの長期間適合マスクを介して、O ₂ / N ₂ Oの70/30混合物で気化イソフルラン2.5％の吸入で、マウスを麻酔し。
   3. 注：この方法は、より安定した無意識のために提供し、薬のシリアル腹腔内注射を避けることができます。
   4. マウスを麻酔したら、ニッパーで足パッドの刺激を通じて無意識をチェック。
2. 血管染色/追加の染色
   1. 血管の染色：尾静脈に静脈内にローダミン - デキストランを200μl（2 MDA、生理食塩水緩衝液中10mg / ml）を注入する。
   2. 好中球の染色のために：尾静脈に静脈内に生理食塩水100μl中Ly6G-PE（クローン1A8）2μgのを注入する。
3. 固定化
   1. 固定化のために、顕微鏡に及び麻酔ガス吸入器に適合したカスタムメイドの定位ホルダーを使用しています。
      注：sterotacticホルダーは、動物の頭を締め、2金属板ブラケット、固定されている1と他のリムーバブルと適応性を持つ金属支持体である。
   2. 呼吸動きからの分離を確実にするために、保持プレート間のマウスの頭部をインストールします。 SKをストレッチする保持プレートとヘッドと耳を締めインチ安定性と動物の呼吸福祉のために確認してください。
4. 頭皮を削除
   1. 慎重に眼との接触を避け、無菌のアプリケーターで頭皮の髪を濡らし、エタノール70％使用しています。
   2. 完全に前頭骨に頭頂骨の後方から頭皮を削除するには、滅菌ハサミやニッパーで皮膚をカットします。大規模な出血を防ぐために、目と耳から3ミリメートルまで遠ざけること。頭蓋骨（骨膜）をカバー疎性結合組織を削除します。暖かいPBSに浸したペーパータオルで残りの髪を洗ってください。
5. 液浸システムのセットアップ
   1. 分布を制御するための小さなゲージの針を用いて頭蓋骨に直接外科的接着剤で直径18mmのゴムリングを貼り付けます。 （30μlのに十分であるべきである）の漏洩を防止するために、ゴムリングの全周を接着。
   2. PBSに浸したペーパータオルでリング下に最後にもう一度頭蓋骨をきれいにし、その後の完全な浸漬し、37℃のPBSを追加頭蓋骨。眼の乾燥を避けるために、マウスのそれぞれの眼にNaClの0.9％溶液または特定の眼軟膏のドロップを追加します。目的の下に定位ホルダーをドラッグします。
   3. 約ダイレクトトランスミッションを介し顕微鏡接眼レンズを使用してフィールドを配置します。

2.二光子イメージングの取得

1. 選択的に680から1080ナノメートルまで調節可能で、NIR光の140fsパルスを提供するサファイア結晶レーザ、レーザパワー制御のための音響光学変調器：チタンと結合し、多光子顕微鏡を使用する。 2ダイクロイックミラー（565 nmおよび690 nm）で、610分の565と550分の500バンドパスフィルタの組み合わせ（3蛍光チャネルの同時録画を可能にする）3外部の非デスキャン検出器（NDD）を含む構成を使用して、プランアポクロマート485ショートパスフィルターは、水浸対物レンズ（NA = 1）×20。
2. anaesの良いhomeothermyを可能にするために加熱室を設定thetizedマウス。、
   注：温度が、より安定性のためにセッションを画像化する1時間前に設定されることがあります。我々のケースでは、32°Cで麻酔したマウス（36~37℃）の最適な体温を得るために選択され、4時間後まで維持される。この温度は、使用されるシステム（デジタルプローブは、この点を確認するために使用することができる）に適合させることができる。また、使用される加熱チャンバは、黒/暗い、外光の混入を避けるために、システム（目的および電動プレート）の一部を覆う。
3. システムの電源を入れます
   1. サファイアレーザー、その後全体の顕微鏡システム：TIの電源をオンにします。取得ソフトウェアを起動します。 870 nmのレーザー波長範囲を設定する。記録のために適切なNDDを選択します。
      注：この例では、第二高調波発生^（SHG）19と、シアン蛍光タンパク質（ECFP）は485ショートパスフィルタの後NDDによって検出される。 550分の500バンドパスフィルタ及びローダミン - デキストランをtで検出された後ECFPもNDDによって検出される彼NDD 610分の565バンドパスフィルタの後。
4. 取得の設定を調整
   1. ソフトウェアの「ライブ取得」イメージングコマンドを使用し、顕微鏡、方向コントロールを使用して、ECFP及びローダミン信号の領域にフォーカスを調整します。最小限の光損傷を有する最良の信号対雑音比を得るために、最小限にレーザパワーを設定する。
      注：使用される電力設定は、関心領域の深さに応じて変化する。典型的には、AOMの設定は、15ミリワットの周りの目的を超えてレーザパワーを表して約20％に設定される。各NDDは、光退色および光損傷を低減することがPMTのゲインに電力を増加させる方がよい。典型的な取得の設定は、単一の1.58マイクロ秒のピクセル滞留時間でスキャンし、1.5倍率512×512ピクセルの解像度である。
5. 関心領域を選択します
   1. 記録パラメータが設定されると、再び「ライブ」の取得コマンドを使用リアルタイムで監視すべき所望の（x、y、z）の欄を選択するための組織を調査する。
      注：通常、我々は両方の血管および実質領域を含むフィールドを選択しました。
   2. 「位置」ソフトウェアコマンドを使用してフィールドを登録します。
      注：このコマンドは異なる遠いフィールドのx、y、z座標を記憶する。
   3. 同じ手順を使用して、（3まで）興味のある追加のフィールドを選択し、登録します。
   4. 選択した倍率で、必要量に応じて第一記憶した位置にある「zスタック」ソフトウェアコマンドを使用して、3次元zスタックを設定します。最初の深い位置し、次に最も高い位置を記憶します。深さのレーザパワーを正規化する。
      注：複数の付随フィールドイメージングのために、我々は12μmの厚さのボリュームを取得するフィールドごとに3μmのZ-段階で区切られた5スライスを獲得する。これらの設定は、研究細胞の種類に適合させることがあります。
6. 起動買収
   1. 選択する220と、時系列「ソフトウェアコマンドと時間間隔の持続時間とサイクル数を選択します。 「実験を開始する「ソフトウェアコマンドを選択することで、必要な時間の経過と期間に応じてタイムラプスイメージングを開始します。
      注：私たちのケースでは、30分のリアルタイムを表す60サイクルの間に各30秒1のボリュームを取得する。短い時間の経過は、血管内の速い細胞ローリングを追跡するために行うことができる。この場合、薄いzスタックと2以下の異なるフィールドを同時に記録することができる。
   2. セットアップの定期的なモニタリング。
      1. 常にそれが無意識であることを確認するために動物を監視します。
         注：動物のウィスカーまたは脚の振動復活の指標である。動物の呼吸がぎくしゃくしている場合には、イソフルランの量をわずかに減少させることができる。取得中の強力な組織ドリフトは、マウスの復活の指標である。
      2. 目的が適切に浸漬していることを確認します。 37℃のPBS betweeリニュー2件の買収（30分）をn個。
         注：買収時の信号のプログレッシブ消失は、PBS漏れの指標である。
7. 手続きの終了
   1. 必要な動画が記録されると、急速に蘇生する前に頚椎脱臼により動物を安楽死させる。
      NOTE：創傷治癒は、長手方向の撮像を実行するための可能性を制限24〜48時間でかさぶたの形成をもたらす。

3.データ分析

1. ドリフト補正
   1. 3D自動追尾のためのIMARISビットプレーンソフトウェアを使用してください。
   2. IMARIS上の3D画像シーケンスを開きます。 SELECTコマンドを「スポット」、そして均一分野で配布可能な場合は、4種類のアンカーポイントの最低すべての時点のマニュアルトラッキング（マウスクリック+シフト）を生成します。
   3. 「編集トラック」タブで「正しいドリフト」コマンドを使用して、ドリフト補正を適用します。
   4. トンの確認彼のx補正、yおよびzは、特に内の品質は人為的な揺れを回避する。
      注：補正が十分でない場合は、他のアンカーポイントを試してみてくださいまたは分析からのビデオを除外する。
2. 細胞追跡
   1. コマンド "新しいスポットを追加」と「トラックスポットの経時"アルゴリズム設定を選択してください。次のステップに進みます。
   2. 「ソースチャンネル」コマンドを使用して、関心の全チャネルのいずれかの自動細胞トラッキング手順を適用します。 10μmとしたオブジェクト（すなわち、細胞）の直径。次のステップに進みます。
      注：選択は、オブジェクトと測定された信号の特異性の区別に依存します。要するに、全チャネル上の自動追尾が検出された信号が対象物に特異的である場合にのみ可能である。 SHG及びECFPの両方が485ショートパスフィルタの後NDDによって検出されるため、トラッキングは5後NDDによって記録ECFP信号を使用して、より特異的かつ効率的になる00/550バンドパスフィルタ。クラスタ化または高密度のパックされたオブジェクトは、3.1.2のステップに類似した個々のオブジェクトを手動で選択が必要になります。
   3. 「品質」フィルタの種類を選択して、非特異的オブジェクトの追跡を除外するようにしきい値を設定。次のステップに進みます。
   4. 2スポット間の「最大距離」と「ギャップサイズ」の正確なパラメータを指定して「ブラウンアルゴリズムモーション」を選択してください。トラックの発生を検証します。
   5. トラックが自動的に計算されると、「トラック継続時間」フィルタの種類を選択し、（4時間点を表す）を120秒より短いトラックを排除するためにしきい値を設定。
   6. 必須：自動追尾した後、トラックの品質をチェック。
      1. オブジェクトは、トラックパスに従うことを確認するためにタイムバーをアンロール。 「編集」タブで利用可能なトラックポイント補正のオプションを使用しない場合は、次の「削除」コマンド（任意のトラックpを削除して虚偽または不適切なトラックを削除個別に「切断」コマンド）を使用してOINT。トラックパスが不足している時点（マウスクリック+シフト）を追加し、不連続である場合には、所定のトラック上のすべての点を選択し、「編集トラック」タブでコマンドを「接続」を使用します。
3. 定量パラメータ
   1. 「環境設定」コマンドで「統計」タブを選択し、リスト内の関心の動的パラメータを選択します。選択してコマンドおよび生成されたExcelファイルを保存」ファイルにすべての統計情報をエクスポート」。
      注：いくつかの動的なパラメータを直接、トラックの長さ、瞬間速度、平均速度などのソフトウェアから得られ、真直度を追跡している。運動係数^6、20を決定すること^ができるが、ソフトウエアにより直接提供されない。
   2. 各セルについて、時間（ΔT）の各期間の変位の平均値を算出（30秒タイムラプス映画のために、ΔTは30、60、90秒、などとなります）。時間間隔の関数としての平均二乗変位をプロットする。曲線の直線部分の傾きを計算することによって、運動性係数を得る。

結果

マウスの頭蓋骨構造は、生体内イメージングによって骨髄生理学を勉強する良い機会を提供しています。フロント頭頂領域の周りに薄くなる骨は、それが骨の摩耗なし髄ニッチへのアクセスを得ることが可能である。1 MacBlueトランスジェニックマウスの頭蓋骨の広い2Dフィールドを表す図 。骨基質は、主にSHG ¹⁹によってIは容易に検出可能なコラーゲンで構成されている。ローダミン-デキストランの注射は、骨髄の血管網を染色し、骨基質と血管¹⁴との間に実質骨髄ニッチの同定を可能にする。 ECFP細胞は骨髄の二つの区画に分布するが、骨基質には存在しない。単球は、手動で、組織内でのそれらの位置に応じて分類される。全細胞が容器のサイズを無視し、脈管構造内にあるとき、血管の単球が定義されている。唯一の大きな収集細静脈は、当社のAから除外されているnalysis。細胞が血管系および骨基質との間に配置されたときに実質球が定義されている。

興味のある特定の領域のタイムラプスイメージング（補足ビデオ1、2...

ディスカッション

インビボイメージング方法の重要な点は、画像の持続時間を最大にし、炎症細胞の動態に影響を与える可能性のある細菌汚染および炎症の危険性を最小限にするために、焦点の安定性を確保するためである。骨髄へのアクセスを得るために行わ手術が最小であるように、頭蓋骨骨​​髄のイメージングは​​、これらの目的に従う。滅菌材料および防腐剤の使用は、細胞恒常性摂動を誘発する可能性があり、感染の危険性を制限することが不可欠である。

定位ホルダーの開発は挑戦することが、各システム（顕微鏡の対物と電動ステージとの距離、麻酔用ガス吸入器の使用）のための具体的なカスタマイズを必要とするかもしれません。より広い撮像面へのアクセスのためにできるだけ水平にマウスの頭を取得することが重要である。動物が配置されると、それは数分requirすると予測される焦点面の良好な安定性を得るために、編。したがって、獲得記録を起動する前に、組織のドリフトをチェックすることをお勧めします。関心の領域の選択と一緒に、このプロセスはしばらく続くことができるので、それはまた、定期的にケタミン/キシラジンが使用され...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ケタミン	メリアル		100 mg/ml、麻酔薬
キシラジン	バイエル ヘルスケア		10 mg/ml、麻酔薬
イソフルラン	バクスター		2.5%、麻酔薬
O2/NO2			70/30 混合物、麻酔薬
Rhodamin-Dextran	Invitrogen		2 MDa、10 mg/ml、血管染色
Ly6G-PE	ベクトン・ディキンソン		クローン 1A8、好中球
定位ホルダー	ホームメイド		手術
エタノール70%			手術
滅菌ハサミ・ニッパー			手術
ゴムリング			直径18mm、手術
グルブラン2	ー医療		外科用接着剤、ゴムリング固定
スモールゲージ針	テルモ		手術
Zeiss LSM 710 NLO多光子顕微鏡	カールツァイス		顕微鏡
Ti:サファイアクリスタルレーザー	Coherent Chameleon Ultra		140 fsec pulses of NIR light
Zen 2010	Carl Zeiss		Acquistion Software
Imaris Bitplane	ビットプレーン		解析ソフトウェア、3D自動追跡
PBS 1X	D.ダッチャー		手術
サーモステーテッドチャンバー	カールツァイス		生体内イメージング