方法論記事

全組織生検からヒト上皮EnteroidsとColonoidsの確立

DOI：

10.3791/52483

⸱

2015年3月6日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatric General and Thoracic Surgery, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Medicine, Section of Gastroenterology and Hepatology, Baylor College of Medicine

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

私たちは、小さな腸の陰窩からヒトの腸を、手術組織と生検の両方から採取した結腸の陰窩からコロノイドを確立する方法を説明しています。この方法論の記事では、ヒトエンテロイドとコロノイドの成長と維持を成功させるために不可欠な培養モダリティを紹介します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

消化管の上皮は、それがひっくり返るたびに絶えず更新されます。このプロセスは、腸幹細胞(ISC)と子孫の増殖によって引き起こされ、それらは徐々に移動して絨毛の先端に向かって分化します。これらのプロセスは、胃腸の恒常性維持に不可欠であり、複数のアプローチを使用して広く研究されてきました。ex vivo技術、特に初代細胞培養は、腸管上皮機能の理解に有望であることが証明されています。マウス腸管陰窩の長期初代培養系が確立され、3次元上皮オルガノイドを作製しました。これらの上皮構造には、正常な腸上皮を連想させる陰窩および絨毛様ドメインが含まれています。一般に、小腸由来の場合は「エンテロイド」、結腸由来の場合は「コロンイド」と呼ばれ、間葉組織も含むオルガノイドとは異なります。さらに、これらのエンテロイド/コロノイドは、腸上皮内で正常に見られるすべての細胞型を連続的に産生します。このin vitro臓器様培養システムは、腸管幹細胞生物学および上皮細胞生理学の研究における新たなゴールドスタンダードとして急速に普及しつつあります。この技術は最近、人間の腸の研究に移されました。小腸および結腸からのヒト由来の上皮エンテロイドおよびコロノイドの確立は、それらの成長と長期にわたる維持を可能にする特定の培養培地の利用を通じて可能になりました。ここでは、ヒトの全組織または生検から小腸および結腸陰窩由来のシステムを確立する方法について述べる。私たちは、ヒトエンテロイドとコロノイドの良好な成長と維持に不可欠な培養モダリティを強調しています。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

消化管のライニング上皮は一定のリニューアルです。このプロセスは、連続的に裏返すように迅速に腸上皮を交換する子孫を産生腸管幹細胞（のISC）の増殖によって引き起こされる。のISCを含む増殖性コンパートメントは陰窩の下部に限定される。のISCは、最終的に吸収または分泌系統に分化子孫を生じさせる。彼らはルーメン1に剥離する前に上向きに移動するように地下室を出て、絨毛または表面上皮上に移動すると、細胞が徐々に分化する。のISCは、腸細胞、microfold細胞、腸細胞、杯細胞、房細胞およびパネート細胞を含むすべての腸管上皮細胞タイプを生じさせる。コロンは、散乱腸と房細胞2で、結腸および杯細胞から主に構成された細長い陰窩ことを特徴としている。

エクスビボ CULトゥーレ·システムは、ISCのメンテナンスと腸組織の恒常性を研究するための有望なツールを構成している。生理学的な条件を完全に再生し、上皮の微小環境は、多くの場合、3,4変更されないようにしかし、それは組織培養技術に頼ることは困難である。 ISCの分野における主要な進歩は、正常な腸のニッチ信号を置き換えるために定義された成長因子を使用して、個々のマウスのISCを維持し、拡大した組織培養技術を確立した。長期培養条件は佐藤らによって記載され、その単一陰窩または腸上皮から単離された幹細胞は、複数の陰様ドメイン5-7を含む3次元の上皮構造を形成するために成長する。これらの三次元構造は、連続的に拡大する分裂事象を受ける。興味深いことに、起源の組織に固有のすべての腸の細胞型が生成され、同様に内腔8内に押し出される。このシステムの改変を用いて、上皮オルガノイドは、胃、小腸および大腸から生成することができる。具体的には、小腸からの上皮オルガノイドはenteroids 9であり、コロンからのものがcolonoids 9,10です。これらの上皮オルガノイド培養系は、このように単離された細胞5,6,10-15の「幹細胞性」を試験するインビトロで幹細胞として機能する単離された単一細胞の能力を試験するために使用されてきた。他の研究者は、個々の上皮細胞16〜21の機能を研究するenteroidsとcolonoids両方を使用している。したがって、enteroidとcolonoid培養は、幹細胞および非幹細胞の両方の機能を評価し、腸内の基本的な細胞間相互作用に新たな洞察を与えるために使用することができる。

2011年には、佐藤らは、人間の小腸および結腸22,23から派生した上皮オルガノイドの長期培養を生成した。培地組成の違い、ヒト上皮enteroidsに加えとcolonoidsは彼らのネズミの対応と同じ特徴を示す。さらに、それらは、バレット食道、腺腫または腺癌、および嚢胞性線維22,24として病変組織から生成することができる。人間enteroidsは腸管幹細胞および上皮粘膜生物学を研究し、正常と異常の両方胃腸生理学3を研究するための新たな実験系として機能するように貴重なシステムを構成している。

ここでは、人間の小腸および結腸陰窩（ 図1）からenteroidsとcolonoidsを確立するための方法を説明します。この方法論のレビューでは、全組織と生検から陰コレクションを強調する。私たちは、人間enteroidsとcolonoidsと、このモデルによって実施可能な実験的な戦略の成功成長および維持に不可欠な文化様式を再現。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注：倫理に関する声明：CCHMCでIRBで承認された明細書に記載のヒト組織を使用するすべての実験（IRB＃2012から2858;＃2014から0427）。組織収集、保存、および試料の使用のためのインフォームドコンセントをCCHMCでドナーから得た。

文化1.準備

注：すべての試薬 ​​は、 表1に記載されている。

  1. 次のようにEDTAストック溶液を準備します。0.5 Mエチレンジアミン四酢酸、純H 2 O、0.22μmのフィルターで滅菌フィルター内のpH 8（EDTA）を調製。必要に応じて、無期限にRTでEDTA原液を保存する。
  2. 次のようなキレート緩衝液を調製する：2％ソルビトール、1％スクロース、1％ウシ血清アルブミン画分V（BSA）及びダルベッコのリン酸中で1×ゲンタマイシン/アンホテリシン溶液は、Ca 2+およびMgなし緩衝食塩水2+（DPBS）、濾過滅菌を混ぜる0.22μmのフィルター付き。キレートBUFを準備新鮮なFER。
  3. のWnt-3A-馴化培地は、製造業者の指示（ATCC、CRL-2647）に記載の細胞ラインLのWnt-3Aを使って家の中で行われ、以下のようなWnt-3A-馴化培地を準備します。 0.22μmのフィルターで滅菌2mMグルタミン、10mMのHEPES、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、1 N2サプリメント、1 B27サプリメント、1％BSA及びフィルタを有する培地を補足する。
    注：テストTOPFLASHアッセイを用いてWnt活性のために、すべてのバッチ。製造元の指示に従ってウミシイタケのルシフェラーゼアッセイキットで安定したHEK293 TOPFLASH細胞株（ハンスCleversラボ）を使用します。 100ng / mlのヒト組換えのWnt-3AにTOPFLASHアッセイを標準化する。対照と比較して調整培地の少なくとも10倍チェンジ活性を確認する。 15ミリリットルで10ミリリットルのアリコートに新鮮なWnt-3A-馴化培地コニカルチューブを分割し、最大6ヶ月間-20℃で凍結する。ストアは、活性を失うことなく4℃で5日間にアリコートを解凍した。
  4. PRepareヒトminigut媒体を次のように0.22で滅菌2mMグルタミン、10mMのHEPES、100 U / mLペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、1 N2サプリメント、1 B27サプリメント、1％BSA及びフィルタと補足アドバンストDMEM / F12培地μmのフィルター。
    注：15ミリリットルで10ミリリットルのアリコートコニカルチューブに新鮮なヒトminigut媒体を分割し、最大3ヶ月間-20℃で凍結する。ストアは、活性を失うことなく4℃で5日間にアリコートを解凍した。
  5. 次のように完全な人間minigut媒体を準備します陰窩文化または50％のWnt-3A-馴化培地（1.3を参照）を、1μg/ mlののRスポンジン1（1を添加した培地変更人間minigut培地（1.4を参照）の前に、新鮮な準備：1,000 1 mg / mlの株式の希釈）、100ng / mlのノギン（1：100グラム/ mLの株式1,000希釈）、50 ng / mLでのEGF（1：500μg/ mlのストックを10,000希釈）、500 nMのA-83 -01（1：500 M株式1,000希釈）、10μMのSB202190（1：30 mMストックの3000希釈）、10 nMの[レイ] 15-ガストリン1（1：100μMの10,000希釈株式）、10 mMのニコチンアミド（1：1、M株式100希釈）と1 mMのN-アセチルシステイン（1：1、M株式1,000希釈）。
    注：活性の損失なしに4℃で2日間まで保管完全なヒトminigut媒体。

全組織から2.墓所の単離

注：組織採取から、生理食塩水でサンプルを維持するために不可欠である。これは、輸送中の氷の上に組織を維持することをお勧めします。陰窩の単離のための試料の調製は、可能な限り早く行われるべきである。
注：すべての試薬 ​​は、 表1、工具、機器に表示され、消耗品を表2に記載されています。

  1. 実験を開始する前に、すべての試薬を準備します。 37℃のCO 2インキュベーター中で氷上で基底膜マトリックスとプレインキュベートし、24ウェルプレートを解凍する。
    注：または15μL/ウェル24の中心にを使用して、基底膜マトリックスの薄い層を作る型ウェルプレートを37℃のCO 2インキュベーター内に置かれる。この通性ステップは、重合中に、ドロップなどの基底膜マトリックスを保持します。
  2. 氷のように冷たいダルベッコのリン酸を用いて組織を洗浄は、Ca 2+およびMg 2+（DPBS）なしで緩衝生理食塩水。 DPBSの内容がクリアされるまで進みます。
  3. 直径0.2mm minutienピンを使用して、氷冷DPBSで満たされたシリコーンコーティングされたガラスシャーレに組織を固定する。ストレッチと粘膜面を上にし、フラットな組織をピン。
  4. 解剖顕微鏡下では、マイクロ解剖ハサミと細かい点に湾曲鉗子（ 図2A、B）を使用して、粘膜下層および結合組織から覆っている粘膜を除去します。
  5. ストレッチや粘膜面を上にし、シリコーンコーティングされたガラスシャーレ上解剖粘膜フラットピン。残りの粘膜下結合組織は廃棄されるか、またはさらなる実験（ 図2C）のために使用することができる。
  6. 優しく湾曲した鉗子で粘膜の表面をこすり。このステップは、調製物の品質を向上させる必要がある。
    1. 小腸のために、優しく絨毛を除去するための粘膜をこすり。
    2. コロンのために、静かに粘液と破片を除去するための粘膜をこすり。
  7. 絨毛および破片を除去するために、氷冷キレート化緩衝液で粘膜3-4回洗浄する。
  8. 新たに調製した2mMのEDTAキレート化バッファー（49.6ミリリットルキレート化バッファーで200μlの0.5 M EDTA）で粘膜をカバーしています。
  9. 氷上のペトリ皿を置き、水平オービタルシェーカー上で30分間静かに振る。
  10. EDTAを含まない氷冷キレート化緩衝液で組織を3〜4回​​洗浄する。洗浄後、氷冷キレート化バッファ内の粘膜を残す。
  11. 湾曲したと細かい鉗子を使用して、解剖顕微鏡下で粘膜を処理します。緩やかに湾曲鉗子を使用して腸の陰窩を解放するために粘膜をこすり。
  12. 静かにパイを使用してペトリ皿から陰窩サスペンションを削除50ミリリットルコニカルチューブにそれをpetteと転送。
    注：ほとんどすべての陰窩は粘膜から削除されていることを確認するために組織を確認してください。
  13. 2回メッシュを150μmを通じて陰窩サスペンションをフィルタリングします。
    注：顕微鏡（ 図2D）の下で暗号濃縮のためのフロースルーをチェック。
  14. 遠心分離機50×gで、4℃で陰窩懸濁液を5分間。上清を捨てる。
  15. 5mlの氷冷キレート緩衝液にペレットを再懸濁する。
  16. ステップ2.15からの懸濁液から10μlの滴当たり陰窩の数をカウントします。 5ミリリットル丸底チューブにメッキのために必要な陰窩の数を転送します。 enteroidsまたはcolonoidsを確立するために、24ウェル皿のウェルあたり200〜500陰窩を使用してください。
  17. 遠心分離機150グラム、4℃で10分間、陰窩分。上清を取り除きます。
  18. その後の培養のための陰窩を使用してください。

生検から3.墓所の単離

  1. 前に、すべての試薬を準備実験開始。 37℃のCO 2インキュベーター中で氷上で基底膜マトリックスとプレインキュベートし、24ウェルプレートを解凍する。
  2. で生検を洗って、氷冷ダルベッコのリン酸は、Ca 2+およびMg 2+（DPBS）なしで緩衝生理食塩水。
  3. 直径0.1mm minutienピンを使用して、氷冷DPBSで満たされたシリコーン被覆ガラスシャーレ上で生検を確保する。ストレッチや粘膜側が（ 図2E）を上に向けて平らな粘膜をピン。
  4. 穏やか絨毛および破片を除去するために、湾曲鉗子で粘膜の表面を削り取る。このステップは、調製物の品質を向上させる必要がある。
  5. 絨毛および破片を除去するために、氷冷キレート化バッファーで生検3-4回洗浄する。
  6. 新たに調製した2mMのEDTAキレート化バッファー（49.8ミリリットルキレート化バッファーで200μlの0.5 M EDTA）で生検をカバーしています。
  7. 氷上のペトリ皿を置き、水平オービタルシェーカー上で30分間静かに振る。
    8. <李は> EDTAを含まない氷冷キレート化バッファーで生検3-4回洗浄する。洗浄後、氷冷キレート化バッファ内の生検を残す。
  8. 湾曲したと細かい鉗子を使用して、解剖顕微鏡下で生検を処理します。緩やかに湾曲鉗子を使用して腸の陰窩を解放するために粘膜をこすり。
  9. 静かにピペットを用いてペトリ皿から陰窩サスペンションを削除し、50ミリリットルコニカルチューブに移す。
    注：ほとんどすべての陰窩は粘膜から削除されていることを確認するために組織を確認してください。
  10. 2回メッシュ150μmのナイロンを通じて陰窩サスペンションをフィルタリングします。
    注：顕微鏡下陰窩濃縮のためにフロースルーをチェック。
  11. 遠心分離機50×gで、4℃で陰窩懸濁液を5分間。上清を捨てる。
  12. 1ミリリットルの氷冷キレート化バッファーにペレットを再懸濁。 1.5mlマイクロチューブに陰窩サスペンションを転送します。
  13. 遠心分離機150×gで、4℃で10分間、陰窩分。上清を取り除きます。
  14. その後の培養のための陰窩を使用してください。

基底膜マトリックス4.墓所文化

  1. あらかじめ冷却ピペットチップを使用して、基底膜マトリックス（200〜500陰窩/ 50μlの基底膜マトリックス）で（ステップ2.18または3.15から）陰窩ペレットを再懸濁。
  2. 予め温めておいたプレートにウェル当たり基底膜マトリックスに陰窩懸濁液50μlを適用します。ゆっくりとウェルの中央に基底膜マトリックスを取り出す。
  3. 30分の基底膜マトリックスの完全な重合を可能にするために、37℃、5％CO 2インキュベーター中で24ウェルプレートを置き。
  4. 2.5μMCHIR99021を補足した完全なヒトminigut培地500μlの基底膜マトリックスをオーバーレイ（1：4000希釈10 mMストックの）と2.5μMThiazovivin（1：4000希釈10 mMストックの）。
  5. 37℃、5％CO 2インキュベーター中でプレートをインキュベートする。
  6. 新鮮な完全フーマーを有する媒体を交換してくださいnは2日ごとに培地をminigut。

培養EnteroidsとColonoidsの5継代。

注：すべての7から10日最初のプレーティング後にパッセージEnteroidsとColonoids。一般的に、3から4ウェルにも1を分割します。

  1. 実験の開始前に、すべての試薬を準備します。 37℃のCO 2インキュベーター中で氷上で基底膜マトリックスとプレインキュベートし、24ウェルプレートを解凍する。
  2. 氷冷DPBS 1mlの滅菌チップとオーバーレイを使用してメディアを取り出します。
  3. 1,000μlのチップで前後にピペット。新しい15ミリリットルコニカルチューブ内の溶液を移す。
  4. 培地1mlあたり5％FBSを添加した人間minigut培地2mlを追加します。
  5. 遠心分離機50×gで、4℃で5分間この溶液。上清を捨てる。
  6. （：10 mMストックの千希釈1）10μMのY-27632を補足した細胞解離酵素の2ミリリットルでペレットを再懸濁。 5メートルインキュベート水浴中で37℃である。
  7. 18-Gの充填/ブラント針を装備した3ミリリットルルアーロック注射器を用いて細胞塊を解離する。穏やかに注射を10回使用して前後に溶液をピペット。
  8. 遠心機500×gで、4℃で5分間のサスペンション。上清を捨てる。
  9. あらかじめ冷却ピペットチップを使用して、基底膜マトリックスに細胞ペレットを再懸濁します。
  10. 予め温めておいたプレートにウェル当たり基底膜マトリックスに陰窩懸濁液50μlを適用します。ゆっくりとウェルの中央に基底膜マトリックスを取り出す。
  11. 20分の基底膜マトリックスの完全な重合を可能にするために、37℃、5％CO 2インキュベーター中で24ウェルプレートを置く。
  12. 10μMのY-27632（：10 mMストックの千希釈1）を補充した完全なヒトminigut培地500μlの基底膜マトリックスをオーバーレイ。
  13. 37℃、5％CO 2インキュベーター中でプレートをインキュベートする。
  14. 2日後（：10 mMストックの千希釈1）、10μMのY-27632を補足した新鮮な完全なヒトminigut培地で培地を交換してください。その後、一日おきに新鮮な、完全な人間minigut培地で培地を交換してください。

培養EnteroidsとColonoids 6.凍結

注：通常2-3クリオバイアルに1をよくフリーズ。

  1. 繰り返しますが5.1から5.8のステップ。
  2. 冷たい凍結培地でペレットを再懸濁。転送ラベルクライオバイアルに溶液を凍結1ミリリットル。イソプロピルアルコール500ミリリットルを含む冷凍コンテナにクライオバイアルを置きます。
  3. その後、液体窒素貯蔵にクリオバイアルを転送、24時間、80℃のフリーザーに冷凍コンテナを転送する。
    注：最大1年間のための店EnteroidsとColonoids。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

図2Dは ​​、全組織（ 図2D）から新たに単離された陰窩の典型的な例を示している。生検から単離された陰窩の数は、全組織においてより低い。針で標準容量の生検鉗子を使用して、我々は通常、単一のパスで2生検刺さを行う。生検あたり50から100陰窩の平均（ 図2F）と10ミリメートル2面内の各生検一口結果。

基底膜マトリックスで培養後、陰窩は、大腸用、小腸とcolonospheresためenterospheresを形成するために切り上げる。通常出芽cryptは播種後、5〜6日以内に行われます。 （; ムービー1、図3A-C）。しかし、それはenteroids（enteroids）またはcolonoids（colonoids）基底膜マトリックス中に球体を形成するのどちらかを見ることが珍しくありません。継代はenteroidsのサイズに応じて、7日後に行うことができる。 enteroidsまたはcolonoids establ生検からished文化で同じ開発を受ける。播種における陰窩密度が低いほどしかし、継代は、通常、培養物中の10〜12日後に行われる（図4a、b）をEnteroidsとcolonoids文化が再現可能な方法で展開します。

enteroidsとcolonoidsの両方が腔側を提示し、上皮（ 図5A、B）が並んでいます。増殖細胞はenteroids内で観察することができ、芽の先端（ 図5C、D）内に配置される。 E-カドヘリン（ECAD）で染色enteroidsの共焦点イメージングは、上皮細胞（ 図5E）を示している。

enteroidsとcolonoidsの両方が先天性/遺伝性疾患の患者から得た組織から確立することができる。 図6は 、代表enteroidsによる上皮細胞の広告で先天性の変異に嚢胞性線維症（ 図6A）とタフティング腸症の患者から成長して示していますhesion分子遺伝子（のEpCAM）（ 図6B）。遺伝的欠陥の他に、enteroidsは、基底状態の違いを示さない。

figure-results-1
陰窩解離と人間enteroidsと文化におけるcolonoidsの世代の図1.ワークフロー。陰窩（ヒト小腸または結腸から）は、EDTAのキレート化により分離されている。培養された陰窩は、大腸のための小腸とcolonoids用enteroidsを形成している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

figure-results-2
陰窩を単離するための図2の解剖工程（A）小腸specimenは延伸さシリコーンコートペトリ皿に平らに固定されている。 （B）粘膜下層の粘膜下組織から分離される。 （C）解剖粘膜延伸及びシリコーン被覆ペトリ皿に平らに固定されている。 （D）は、EDTAキレート化した後、陰窩の組織から単離される。 （E）One生検を延伸し、シリコーンコートペトリ皿に平らに固定されている。 （F）は 、EDTAのキレート化した後、陰窩は、生検から単離される。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

figure-results-3
図3.墓所の文化と組織全体から人間enteroidとcolonoid世代。（A）単離後に基底膜マトリックス中にプレート空腸の陰窩。陰窩は、3〜4時間後に閉鎖し、この時間を超えてenterospheresを形成するようにバルーンを開始している。 7日目に、腸enteroidsが形成されている。 （B）の単離および培養後、回腸陰窩は腸陰窩のように振る舞うと回腸enteroidsを形成する。 （C）結腸陰窩を単離後に基底膜マトリックスに播種される。 7日（スケールバー：100μm）の後に陰窩近いとフォームcolonoids。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

figure-results-4
生検から図4.墓所の文化と人間enteroidとcolonoid世代。（A）単離後に基底膜マトリックス中にプレート十二指腸陰窩。陰窩は4時間に3の後まで閉じてbeyoアップバルーンを開始しているndは、この時間はenterospheresを形成する。 7日目に、enteroidsが形成されている。 （B）の単離および培養後、結腸陰窩は、基底膜マトリックス中に播種する。陰窩は7日（スケールバー：100μm）をした後、次にcolonoids colonospheresを形成するためにクローズアップ。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

figure-results-5
培養液中の6日後に、図5人間enteroidsの腸系統。（A）ヒトenteroid。 （A）中のenteroidsの（B）ヘマ ​​トキシリン-エオシン切片は、上皮ライニング（100ミクロンスケールバー）を実証する。 EDUの染色後enteroidsの（CD）、共焦点イメージング（マゼンタ）、増殖性細胞の存在を示している。 （E ）enteroidsの共焦点イメージングはの存在を示しています。50μm）をこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

figure-results-6
病変組織から図6.墓所の文化や人間enteroid世代。（A）は、嚢胞性線維症の試料から確立Enteroids。 （B）Enteroidsは先天性のタフティング腸標本から確立（スケールバー：100μm）を。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

培養中のヒトenteroidを形成する映画1. Enterosphere。32時間の時間、周e動画は、培養中enteroidを形成するために後退ヒト小腸から確立enterosphereを示している。 このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。

試薬の名前 会社 カタログ番号 溶剤 ストック濃度 最終濃度 コメント
ダルベッコのリン酸は、生理食塩水のCa 2+、Mg 2+を無料（DPBS）バッファリングライフテクノロジーズ。ギブコ 14190-144 - - 1X
エチレンジアミン
四酢酸（EDTA） 		シグマアルドリッチ 431788 超純のdH 2 O 0.5 M 2 mMの
ソルビトールフィッシャーサイエンティフィック BP439-500 DPBS パウダー 2％
蔗糖フィッシャーサイエンティフィック BP220-1 DPBS パウダー 1％
ウシ血清アルブミン（BSA）フラクションV フィッシャーサイエンティフィック BP1600-100 DPBS パウダー 1％
Gzntamycin /アムホテリシンB溶液ライフテクノロジーズ。ギブコ R-015から10 - 500X 1X
のWnt-3Aは、メディアconditionned 家の中で - - - -
高度なDMEM / F12 ライフテクノロジーズ。ギブコ 12634-028 - - -
HEPES 1M ライフテクノロジーズ。ギブコ 15630-080 - 1 M 10 mMの
グルタMAX（グルタミン） ライフテクノロジーズ。ギブコ 35050-061 - 100X 1X
ペニシリン - ストレプトマイシン（10,000 U / mL）をライフテクノロジーズ。ギブコ 15140-148 - 100X 1X
N2サプリメントライフテクノロジーズ。ギブコ 17502-048 - 100X 1X
B27サプリメントライフテクノロジーズ。ギブコ 17504-044 - 50X 1X
N-アセチルシステインシグマアルドリッチ A9165-5G DPBS 1 M 1 mMの
Nicotidamide シグマアルドリッチ N0636 DPBS 1 M 10 mMの
マトリ、GFR、フェノール無料（基底膜マトリックス） コー​​ニング 356231 - - - REQUIRED
ヒト組換えノギン研究開発 6057-NG / CF DPBS 100μg/ mlの 100ng / mlの他のサプライヤー：R＆D;アナスペックとPreprotech
ヒト組み換えRスポンジン Preprotech 120から38 DPBS 1 mg / mlの 1μg/ mlの
ヒト組み換えEGF シグマアルドリッチ E9644-.2MG DBPS 500 / mlの 50ng / mlの
Y-27632 シグマアルドリッチ Y0503-1MG DPBS 10 mMの 10μM
- 83から01 トクリス 2939 DMSO 500μM 500 nMの
SB202190 シグマアルドリッチ S7067-5MG DMSO 30 mMの 10μM
人間[レイ] 15-ガストリン1 シグマアルドリッチ G9145-.1MG DPBS 100μM 10 nMの
CHIR99021 Stemgent 04から0004 DMSO 10 mMの 2.5μM
Thiazovivin Stemgent 04から0017 DMSO 10 mMの 2.5μM
のTrypLE Expressの酵素（1X）、フェノールレッド（細胞解離酵素） ライフテクノロジーズ。ギブコ 12605-010 - - - 継代のために
ウシ胎仔血清ライフテクノロジーズ。ギブコ 10082-1​​47 - - - 継代のために
CTSシンセ-フリーズミディアム（凍結培地） ライフテクノロジーズ。ギブコ A13713-01 - - - 凍結のために
LのWnt-3A細胞株 ATCC CRL-2647 - - - のWnt-3Aは、メディア制作をconditionned
ウミシイタケルシフェラーゼアッセイプロメガ E2710 - - - のWnt-3Aは、メディアアクティビティconditionned
ヒト組み換えのWnt-3A 研究開発 5036-WN / CF DPBS 100μg/ mlの 100ng / mlののWnt-3Aは、メディアアクティビティconditionned
HEK293 TOPFLASH細胞株 - - - - - のWnt-3Aは、メディアアクティビティconditionned。ハンスCleversの研究室からの贈り物

好適な製造業者およびカタログ番号表1.詳細な試薬リスト。

機器 消耗品 ツール
層流フード 15-と50ミリリットルコニカルチューブデュモン＃5標準鉗子（FST;＃11251から20）
CO 2インキュベーターマイクロチューブデュモン＃7、湾曲した細い鉗子（FST;＃11274から20）
実体顕微鏡 24ウェルプレートファインはさみ（FST;＃14060から09）
遠心分離機 0.22μmのフィルター（ザルトリウス） Vannasスプリングはさみ（FST;＃15018から10）
オービタルシェーカー血清学的ピペット 0.2ミリメートルの直径minutienピン（FST;＃26002から20）
凍結コンテナ（ナルゲン） マイクロピペットのヒント 0.1ミリメートルの直径minutienピン（FST;＃26002から10）
シルガード184シリコーン（ダウコーニング） 150μmのメッシュ開口部、ナイロンスクリーニング（ダイナミックアクアサプライ）
ガラスシャーレ 5ミリリットル丸底ポリプロピレンチューブ（ファルコン）
血清学的ピペッター 18Gブラント塗りつぶし針（BD）
マイクロピペットルアーロックのヒントと3ミリリットルlsyringes（BD）
クライオバイアル

表2.詳細な消耗品、ツール、および機器。

ディスカッション

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この方法は、腸上皮生物学を研究するための便利なツールを構成している腸管上皮系統および上皮ダイナミクスを再現する完全なシステムを提供しています。ここに提示された方法を効率的に人間enteroidsとcolonoidsになり、佐藤とClevers 22によって元のマウス研究から適応されました。ここでは、手動で任意の細胞の汚染物質を避けるために、顕微解剖によって陰窩を拾いました。この方法は、陰窩の直接可視化を可能にし、「振る」ことにより、元の暗号コレクションに比べて一貫性の残業につながる。他のグループは、特にコラゲナーゼ25とEDTAによるキレート化を置き換えるわずかに異なるアプローチを使用して、同様のテクニクスを開発しました。暗号コレクションの違いのほかに、それらのテクニクスは文化22で人間enteroidsを成長するために必要な定義されたメディアを使用。陰窩播種で成長効率を高めるために、GSK3インヒビター（CHIR99021）を追加最初の2日間12。

組織または生検の取り扱いが重要であり、暗号の分離とすぐ組織が実験室に到着したように実行する必要があります。しかし、遅延陰窩の単離および培養は、組織採取後24時間まで実施することができる以前に、マウス組織26について記載した（データは示さず）。腸組織を完全に組織破壊を回避するためにDPBSで満たし、4℃で維持されるべきである円錐管に配置する必要があります。遅延準備は、組織出荷が可能になりますが、温度変化は、輸送中に避けるべきである。初期陰窩めっきに必要な全体的な時間は、陰窩を分離し、めっきする組織と、1〜2時間後に処理するために15〜30分間で約2時間である。組織の顕微解剖は、きれいな地下室の準備の重要な決定要因と述語です。しかし、ハンドシェイクによって陰窩リリース様々なプロトコルに記載されるようにすることが可能である22,23。

ネズミenteroid（enteroids）システムと類似しているにもかかわらず、人間enteroidsは時間をかけて彼らの成長を促進し、維持するために特定の分子を必要とする。成長因子は、EGF、ノギン、Rスポンジン、マウス上皮オルガノイドと同様に使用される。しかし、のWnt-3Aの使用が不可欠である。我々は、形成ならびに成長効率は、ヒト組換えタンパク質よりはWnt-3A条件培地を使用して大きいことを指摘した。同時に、我々は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ3（CHIR99021）12の阻害剤を使用して改良された培養条件を示した。組み換え成長因子は、Wnt-3A、Rスポンジン、及びノギン馴化メディアで置き換えることができる。のWnt-3Aを発現するL細胞株は（ATCC）は、市販されている。他のグループはNoggin- 19、およびWnt-3A / R-spondin3 / Noggin- 28発現細胞株、Rスポンジン1- 23,27を開発した。二つの小分子阻害剤は、培養に使用されている私DIAとは、文化29の維持のために必要である。 - 83から01の成長因子βおよびアクチビン/ノーダル受容体を形質転換の選択的阻害剤である（アクチビン様キナーゼ4、5、7）及びSB202190は、p38マイトジェン活性化プロテインキナーゼ阻害剤（MAPK）である。両阻害剤は、ヒト人工多能性幹細胞の自己再生を維持し、30-32、ヒトナイーブな多能性幹細胞を確立するためにそれぞれ使用されてきた。また、ニコチンアミド、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの前駆体は、長期的22,29にenteroidsとcolonoidsの拡張を維持するために必要とされる。

それは地下室の準備からの収量を決定としてEDTAのキレート化は重要なステップです。私たちは、2 mMのEDTA処理に成功している。しかし、EDTAの濃度は、組織の種類に関して15 mMまでの2mMから変更することができる。その場合には、インキュベーション時間は、実験的に決定されなければならない。初期めっき後、cryptはラウンドuとなりますpと、最終的にはenteroidsを形成する。しかし、enteroidsまたはcolonoidsは、多くの場合、無分化した細胞にはほとんどして球体を形成することにより、「ステム」表現型を示す。その場合には、分化は、Wnt-3A、ニコチンアミドおよびp38 MAPK阻害剤を回収することによって開始することができる。そのようなDAPTまたはDBZなどのNotch阻害剤の使用はenteroids 22内分化を強化するのに役立ちます。

このモデルは、吸収性および分泌分化系統の両方を含む幹細胞区画から生じる継続的な陰出芽イベントならびに絨毛様上皮ドメインを有する腸生理を再現する。興味深いことに、このシステムは、任意の間葉細胞を含有し、ニッチ信号要件を満たすために特定のメディア条件を使用していない。

マウスモデルと同様に、人間enteroidsは、幹細胞として機能するそれらの細胞の能力をテストするために、単離された腸上皮細胞から生成することができる。セベRALの研究は、幹のプロパティ12,23,33を用いて細胞を濃縮する分化マーカー（CD44、CD24またはCD166）とEPHB2陽性細胞のクラスターを使用してきた。一緒に、これらの研究は、幹細胞性を試験するため、ヒトenteroids培養物の有用性を実証する。他の研究者は、感染下痢性疾患、嚢胞性線維症、または結腸直腸癌22,34-37腸疾患を調査するためにこのモデルを使用している。これらの研究は、人間enteroidsパーソナライズスクリーニングに向かって移動する可能性と信頼性の高いヒト疾患モデルを構成していることを示している。人間enteroidsは、遺伝的にウイルス粒子38とDNAトランスフェクションまたは感染を使用して変更することができます。これはヒト上皮オルガノイドまたは正しい遺伝子突然変異内の遺伝子固有の機能を研究するための強力なツールを提供します。最近では、Schwankらは、CRISPR / Cas9システムとゲノムを編集して、交流を引き起こしCFTR遺伝子に突然変異を修正する可能性を実証したystic線維症24。人間enteroidsは腸管幹細胞および上皮粘膜生物学を研究し、正常と異常の両方胃腸生理学を研究するための新たな実験系として機能するように貴重なシステムを構成している。

開示事項

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著者らは開示するものは何もない。

謝辞

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TOPflash細胞のご厚意により、ハンス・クレバース博士(オランダのHubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research)

に感謝いたします。

このプロジェクトは、NIH-R01DK083325（MAH）によって部分的に支援されました。NIH P30 DK078392(消化器系健康センター);NIHのUL1RR026314(CTSA)。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水Ca2+、Mg2+ free(DPBS)Life技術;Gibco14190-144
エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)Sigma-Aldrich431788
ソルビトールフィッシャーサイエンティフィBP439-500
ショ糖フィッシャーサイエンティフィBP220-1
ウシ血清アルブミン (BSA) フラクション VフィッシャーサイエンティフィBP1600-100
グズンタマイシン/アムホテリシン B 溶液ライフテクノロジー;GibcoR-015-10
Wnt-3Aは、社内
高度なDMEM / F12です。Gibco12634-028
HEPES 1MLife テクノロジー;Gibco15630-080
GlutaMAX (グルタミン)ライフテクノロジー;Gibco35050-061
ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)ライフテクノロジー;Gibco15140-148
N2 SupplementLife テクノロジー;Gibco17502-048
B27 SupplementLifeテクノロジー;Gibco17504-044
N-アセチルシステインSigma-AldrichA9165-5G
ニコチダミドSigma-AldrichN0636
マトリゲル、GFR、フェノールフリー (基底膜マトリックス)Corning356231
ヒト組換え NogginR&D6057-NG/CF
ヒト組換え体 R-SpondinPreprotech120-38
ヒト組換え EGFSigma-AldrichE9644-.2MG
Y-27632Sigma-AldrichY0503-1MG
A-83-01Tocris2939
SB202190Sigma-AldrichS7067-5MG
ヒト [Leu]15-Gastrin 1Sigma-AldrichG9145-.1MG
CHIR99021Stemgent04-0004
チアゾビビンStemgent04-0017
TrypLE Express Enzyme (1X)、フェノールレッド (細胞解離酵素)Life technologies;Gibco12605-010
ウシ胎児血清生命技術;Gibco10082-147
CTS Synth-A-Freeze Medium (凍結中)ライフテクノロジー;GibcoA13713-01
L Wnt-3A 細胞株ATCCCRL-2647
Renilla ルシフェラーゼアッセイPromegaE2710
ヒト組換え Wnt-3AR&D5036-WN/CF
HEK293 TOPflash細胞株
ック ック ック のライフテクノロジーで調整された媒体

参考文献

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