フローサイトメトリーを用いて細胞外小胞の分析のための技術

Summary

多くの異なる方法は、フローサイトメトリー（FCM）を使用して、細胞外小胞（電気自動車）の測定のために存在する。使用する最も適切な方法を決定する際にいくつかの側面を考慮すべきである。電気自動車を測定するための2つのプロトコルは、個々の検出またはビーズベースのアプローチのいずれかを使用して、提示されている。

Abstract

細胞外小胞（電気自動車）は、高度に細胞間コミュニケーションに関与し、生物学的プロセスの多様な範囲を規制する助けている体液で見つかった小さな、膜由来小胞である。フローサイトメトリー（FCM）を使用して、電気自動車の分析は、その小さなサイズと、目的のマーカーに陽性の別個の集団の不足のために悪名高く困難であった。かなり過去10年間に改善し、EV分析のための方法は、まだ進行中の作業である。残念ながら、そこにはフリーサイズのプロトコルではなく、使用するのが最も適切な方法を決定する際にいくつかの側面を考慮しなければなりません。ここで提示個々の検出またはビーズベースのアプローチのいずれかを使用して電気自動車を分析するためにEVやつのプロトコルを処理するための幾つかの異なる技術である。ここに記載される方法は、一般に市販の調製物に見られる抗体の凝集体を排除する信号対雑音比を増加させる、および合理的なfのでゲートを設定して支援するバックグラウンド蛍光の検出を最小にashion。第二のプロトコルをキャプチャ小さいEVやエキソソームを検出するために、ビーズベースのアプローチを使用しながら、第一のプロトコルは、臨床サンプルの高容量を分析するために特によく適している個々の検出方法を使用する。

Introduction

細胞外小胞（電気自動車）は、高度に細胞間コミュニケーションに関与し、生物学的プロセスの多様な範囲を規制する助けている体液で見つかった小さな、膜由来小胞である。フローサイトメトリー（FCM）を使用して、電気自動車の分析は、その小さなサイズと、目的のマーカーに陽性の別個の集団の不足のために悪名高く困難であった。かなり過去10年間に改善し、EV分析のための方法は、まだ進行中の作業である。残念ながら、そこにはフリーサイズのプロトコルではなく、使用するのが最も適切な方法を決定する際にいくつかの側面を考慮しなければなりません。ここで提示個々の検出またはビーズベースのアプローチのいずれかを使用して電気自動車を分析するためにEVやつのプロトコルを処理するための幾つかの異なる技術である。ここに記載される方法は、一般に市販の調製物に見られる抗体の凝集体を排除する信号対雑音比を増加させる、および合理的なfのでゲートを設定して支援するバックグラウンド蛍光の検出を最小にashion。第二のプロトコルをキャプチャ小さいEVやエキソソームを検出するために、ビーズベースのアプローチを使用しながら、第一のプロトコルは、臨床サンプルの高容量を分析するために特によく適している個々の検出方法を使用する。

また、微粒子としても知られている電気自動車は、細胞間コミュニケーションに関与し、生物学的プロセス¹の多様な調節を助けている体液中に見出される小さな膜由来の小胞である。 ^{4 -}

Protocol

注：以下のプロトコルが人間の福祉のためにすべての、制度的、国内および国際的なガイドラインを遵守して行われてきた。すべてのヒト被験サンプルは、治験審査委員会（IRB）承認のプロトコルの下で被験者のインフォームドコンセントを用いて試験した。

1.方法A：個々の検出方法

EVの血液サンプル/単離の1.1）処理

1. 以下の2段階の分画遠心プロトコルを使用して（30分以内に最大）直ちにACD-A液1.5 mlまたは他の適当な抗凝固剤及びプロセスを含む2つの10 mlのガラスチューブ中にドナー/患者から血液を引き込む。
   注：このプロトコルは、採取した血液の組み合わせ〜17ミリリットルから約10ミリリットル乏血小板血漿（PPP）のが得られます。多かれ少なかれPPPが必要な場合には、採血管の数は、それに応じて調整することができる。
2. RTで10分間1500×gでサンプルを遠心軟膜と赤血球から血漿を分離する。軟膜と赤の細胞を含む下層を乱さないように注意しながら、1.5ミリリットル遠心管にプラズマ上清1.2mlのアリコートを転送します。
3. 血小板および大型細胞片を除去し、室温で10分間、13000×gでスピン。慎重にペレットを乱さないよう、新しいチューブにPPPを追加するために、200μlの後ろに残して、PPPを転送する。
4. この時点で、後の分析のために、最大2つの年（....

Results

図1は 、ビーズベースの方法または個々の検出方法のいずれかを使用してEVの分離および検出のための全体的な処理方式の概要を説明します。 FCMを使用したEVの個々の検出は、より大きな電気自動車の分析に適していますが、ほとんどのサイトメーターは、個別にエキソソームと小さい粒子を検出することができない。ビーズベースのアプローチは、一般的に、表1に概説されるが、この方法を使用することに関連する欠点が存在する、小さな電気自動車が検出することができる電気自動車の分離超遠心分離を使用して（またはスクロース勾配分画法の添加なし）である電気自動車は、機能的アッセイのために必要とされている場合、推奨。超遠心は、血清タンパク質と機能的な実験の成果に影響を与えることができるプラズマ、から他の可溶性の汚染物質を含む不純物を除去する。しかしながら、超遠心分離は、時間がかかり、EVの量と質^12を変更することができる。

">二つの検出アッセイのための期待される結果を図2-3に示されている。対応する非溶解サンプルのためのゲート（一番.......

Discussion

EVの単離、処置および分析のための2つの異なるプロトコルは、個々の検出またはビーズベースのアプローチのいずれかを使用して、提示された。使用する最も適切な方法を選択することは必ずしも容易ではなく、興味のある個々の亜集団と同様にテストされているサンプルを理解する必要があります。最も適切な方法を選択する際にさらに、取得のために使用されるサイトメーターの感度を考慮しなければならない。多くの場合ではなく、メソッドの組み合わせは単独のいずれかの方法よりサンプルに関する詳細な情報を提供し、使用するための単一の最良のプロトコルがありません。理想的には、いくつかの異なる単離および検出技術は、特定のEV集団が研究されてに関してパフォーマンスサイトメーター考慮個体にかかるテーラードプロトコルを開発するために最初に評価されるべきである。代替分離技術は、超遠心分離、ショ糖密度分画、免疫磁気Bを含むEAD分離、クロマトグラフィー、およびアフィニティー精製^12、代替の検出方法は、走査型電子顕微鏡、透過型電子顕微鏡、原子間力顕微鏡法、動的光散乱、及びウェスタンブロッティング^8を含んでいる。異なる技術を組み合わせることで、こ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
LSR II ベンチトップ フローサイトメーター	BD Biosciences		3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633 nm red)
FACS Diva ソフトウェア	BD Biosciences		PCバージョン6.0
FlowJoソフトウェア	Treestar US		Macバージョン9.6.1またはPCバージョン7.6.5
Sphero Rainbow蛍光粒子	BD Biosciences	556298	蛍光強度の一貫性を維持するためにすべてのチャネル電圧を調整するために使用されます
ウルトラレインボー蛍光粒子	間のEVのゲーティングの一貫性を確保するためにMegamix-Plus SSCビーズに加えて使用される	Spherotech	URFP-10-5
Megmix-Plus SSCビーズ	Biocytex	7803	は、FSCおよびSSC 電圧を調整して、実行間の一貫性 を維持するために使用されます。また、同じ流量がすべての実行で使用されていることを確認するために、流量を監視し、ちょうど流量ダイヤルをダイヤルするために使用することができます
AbCアンチマウスビーズキット	ライフテクノロジー		補償制御に使用される&負のAbCビーズ ビーズベースの方法に使用される
Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9)	サンタクルーズ	SC-281108	個別検出法では、ネガティブコントロールとして使用するための初期読み取り後のサンプルの溶解のみに使用されます。ストックはPBSで1:10に希釈し、冷蔵庫で最大1か月間保存できます。
BD TruCOUNTチューブ	BDバイオサイエンス	340334	絶対的なEV濃度が必要な場合に使用できます
Ultrafree-MC、GV 0.22 µm 遠心フィルターユニット	ミリポア	UFC30GVNB	サイズに基づいてEvを染色後洗浄および/またはEVを分画
Vacutainerガラス全血チューブ ACD-A	BD Biosciences
Facsチューブ 12x75ポリストレン	BD Biosciences	352058
50 ml リザーバーを個別に包装	Phenix	RR-50-1s
Green-Pak ピペットチップ - 10 µl	レイニン	GP-L10S
Green-Pak ピペットチップ -200 & マイクロ;l	レイニン	GP-L250S
グリーン -Pak ピペットチップ - 1,000 & マイクロ;l	レイニン	GP-L1000S
ステーブルスタック L300チップ 滅菌済み	レイニン	SS-L300S
Pipet-Lite XLS 8チャンネル LTS 調節可能 スペーサー	レイニン	LA8-300XLS
96ウェル組織培養プレート	E&K Scientific	EK-20180
RPMI 1640 培地 (Hepes なし)	UCSF 細胞培養施設	CCFAE001ビーズ	ベースの検出法に使用される培地
Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2 & micro;m フィルター付き	UCSF 細胞培養施設	CCFAL003
超遠心チューブ、薄壁、超透明	BECKMAN COULTER INC
PANEL I
CD3 PerCP-Cy5.5	Biolegend	344808	2 µl
CD14 APC-Cy7	Biolegend	301820	2 µl
CD16 V450	BD Biosciences 560474		2 & マイクロ;l
CD28 FITC	バイオレジェンド	302906	2 & マイクロ;l
CD152 APC	BD Biosciences 555855		2 & マイクロ;l
CD19 A700	バイオレジェンド	302226	2 & マイクロ;l
PANEL II
CD41a PerCP-Cy5.5	BD Biosciences	340930	2 µl
CD62L APC	Biolegend	304810	2 & マイクロ;l
CD108 PE	BDバイオサイエンス	552830	2 & マイクロ;l
CD235a FITC	バイオレジェンド	349104	2 & マイクロ;l
パネルIII
CD11b PE-Cy7	バイオレジェンド	301322	2 & マイクロ;l
CD62p APC	Biolegend	304910	2 µl
CD66b PE	バイオレジェンド	305106	2 & マイクロ;l
CD15 FITC	exalpha	X1496M	5 & マイクロ;l
CD9 PE	Biolegend	555372
CD63 APC	Biolegend	353008
APC-Cy7 Ms IgG2a, κ	バイオレジェンド	400230