神経疾患の研究のための生成および使用方法hiPSC派生のNPCへのガイド

サマリー

このプロトコルは、神経前駆細胞がヒト人工多能性幹細胞からどのように分化できるかを説明しています。これにより、多くの神経障害における疾患の病因に寄与する発生経路を特定するために使用できる、堅牢で複製的な神経細胞集団を生成することができます。

要約

多くの疾患は症状が現れる前に長期間の疾患進行を含むため、疾患発生の根本的な原因を特定するのに理想的ではありません。患者や健常者から採取した線維芽細胞は、ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)に効率的に再プログラムされ、その後、神経前駆細胞(NPC)やニューロンに分化してこれらの疾患の研究を行うことができるため、患者の症状発症前に発生した発生事象を再現することが可能になりました。私たちは、ヒトiPS細胞をNPCに効率的に分化させる方法を提示します。NPCは、機能的なニューロンへのさらなる分化が可能なだけでなく、頑健に継代、凍結融解、または移行してニューロスフェアとして成長することもでき、複製、遊走、酸化ストレス、アポトーシスなどの細胞表現型に影響を与える分子因子を特定するための迅速な遺伝子スクリーニングを可能にします。患者由来の hiPSC NPC は、遺伝子発現の操作による細胞または分子の影響の経験的試験に最適な独自のプラットフォームです。

概要

我々 ¹ヒト誘導多能性幹細胞（hiPSCs）からインビトロで分化したニューロンおよびその他^2,3の遺伝子発現研究は、hiPSCニューロンは、胎児ではなく、成人の脳組織に似ていることを示している。現在では、hiPSCベースのモデルではなく後期の特徴、神経疾患より、素因の研究のため、より適切な場合があります。我々は以前のNPCは、統合失調症¹に貢献する分子経路を研究するために有用な細胞型であり得ることを示している、統合失調症hiPSC由来の神経細胞の遺伝子特性のかなりの部分が、統合失調症のhiPSC由来神経前駆細胞（NPCの）に保存されていることを報告している。我々は、他の統合失調症hiPSCのNPC ^1,4-6における酸化ストレスおよび活性酸素種、サブスレッショルド環境ストレスに対する感受性およびミトコンドリア機能障害の増加、ならびにニューロンcと減少し、異常な移行が報告されているonnectivityと統合失調症のhiPSCニューロン^5,7-10におけるシナプス機能。統合失調症hiPSC NPCの中で異常な移動及び/または酸化ストレスに貢献する分子の要因も統合失調症hiPSC由来の神経細胞における減少し、ニューロンの接続性の根底にある場合は、NPCが疾患の原因のメカニズムを研究するために、堅牢性の高い複製神経細胞集団である可能性があります。一つは、急速に多数の細胞を生成することができるし、ニューロン成熟のために数週間または数ヶ月待つ必要がないので、さらに、NPCベースのアッセイは、より大きな患者コホートの研究に適しており、ハイスループットスクリーニングにより適している。我々はすでに統合失調症¹およびハンチントン病¹¹のように多様な疾患において実証されているようにhiPSCのNPCは、潜在的に疾患の病因に貢献発達経路のためのプロキシとして機能することができると信じている。

hiPSCs、の初期の神経からのNPCを区別するために生産は、デュアルSMAD阻害（0.1mMのLDN193189および10mMの^{SB431542）12}によって達成される。これらの小分子とシグナリングBMPおよびTGF拮抗することにより、内胚葉および中胚葉の指定は、神経分化を促進し、めっきの一週間以内に目に見える神経ロゼットの形成をもたらす、遮断される。神経パターニングは、おそらく神経ロゼット形成の期間中とその直後に、早期にこのプロセスで発生します。他の手がかりがない場合には、これらの原始的な神経細胞は、前前脳のような運命^13を想定^しています。すぐにNPCの拡大を通じて、神経ロゼット形成以下、および継続的な、前脳NPCはFGF2 ^8,14と培養される。これらは、二重系統可能性を有し、70〜80％のIII-チューブリン陽性ニューロン及び20-30％グリア線維性酸性タンパク質（GFAP） -陽性星状細胞（ 図1）の神経集団に分化させることができる。前脳のhiPSCニューロンの大半はVGLUT1陽性であるニューロンの約30％が、GAD67陽性（GABA作動性）であるが、したがって、おそらくグルタミン酸である^8。

NPCは日常的に一貫性の分化プロファイルを維持し、核型異常を蓄積することなく、一方、in vitroで 10回以上継代する。グループが40倍以上¹⁵のNPCを継代報告している、しかし、私たちは10継代を超えて、NPCには、アストロサイト分化に増加傾向を示していることがわかります。 NPCは、複数の凍結融雪、よく耐え単に非接着プレートで培養することにより、ニューロスフェアとして成長に移行することができます。 NPCは、効率的に生化学的研究のために十分な材料を得るために急速な遺伝的摂動の分子·細胞影響の評価、および容易に拡張を可能にする、ウイルスベクターによって形質導入されている。ウイルスベクターの過剰発現及び/又は疾患関連遺伝子のノックダウン堅牢許すのでさらに、コントロールまたは患者のいずれかでneur由来らの細胞は、1つは、これらの操作上の遺伝的バックグラウンドの効果を試験するために、このプラットフォームを使用することができる。成熟した神経細胞を必要とするシナプスまたは活動に基づくアッセイに適していないが、NPCは、患者由来の神経細胞の多くの単純な分子または生化学分析のための実用的な代替手段かもしれません。

プロトコル

1. hiPSC分化神経前駆細胞へ

1. 大（ただし、サブコンフルエント）のコロニーが胚様体（EB）中間体を介して神経分化のための準備ができるまで、マウス胚性線維芽細胞（MEF）フィーダー層上で共培養（HES）メディア（ 表1）ヒト胚性幹細胞でhiPSCsを成長と拡大（ 図2）。ルーチンhiPSC培養条件は、他の場所^16,17に記載されている。簡単に言うと、コラゲナーゼ（DMEM中に1mg / ml）で酵素的に通過その後、コンフルエントになるまでMEFフィーダー層上HES培地でhiPSCsを成長させ、約1拡大：7日ごとに3。
2. ポリ-L-オルニチン/ラミニンを調製するためにプラスチック表面（ガラス面50グラム/ ml）のための滅菌水を10g / mlのポリ-L-オルニチンを有するプレート、被覆プレートをコーティングし、3-24時間、室温でインキュベートする。滅菌水で少なくとも一度洗った後、3-24時間、室温で滅菌PBSで5グラム/ mlのラミニンでコート。
   注：プラスチックに包まれている場合、プレートが可能6ヶ月まで-20ºCのために保存。
3. 1日目に、酵素的にDMEM / F12中に1mg / mlコラゲナーゼIVを使用して、プレートのような大きなコロニーから（例えば、マトリゲル上のTeSR ¹⁸として定義された培地中で成長、一般MEF上で成長し、またはhiPSCs）サブコンhiPSCsを持ち上げる。
   注：37ºCでのインキュベーションの1-2時間後、コロニーが皿にフローティングされます。
4. 穏やかに2ミリリットル/ウェルのN2 / B27培地（ 表1）および非接着性6ウェルディッシュに移し（中に再懸濁1に3ウェルを組み合わせ、DMEM / F12に（遠心分離ではなく、沈降によって）1-2xをhiPSCコロニーを洗う型ウェル^）19。
   注：一晩、コロニーは「胚様体」（EBS）と呼ばれるフローティング球状のクラスターを形成することになる。かなりの細胞死を期待。
5. 2日目に、プレートを傾けてEBを沈降させる。慎重にメディアを削除し、破片を除去するDMEM / F12で一回洗浄します。デュアルSMAD阻害剤（0.1M LDN193189と10M ^{SB431542）12}を補足したN2 / B27メディアにフィード。
6. 日3-7日、神経誘導は、デュアルSMAD阻害のコンテキストで発生します。 EBをラウンドしかし、嚢胞性ではないことを確認してください。 EBを0.1M LDN193189と10M SB431542を補足したN2 / B27メディアと一日おきにフィード。
7. 日7月14日、ポリ-L-オルニチン/ラミニンコーティングしたプレートにEBのメッ​​キに続いて、上の神経ロゼットは（apico-基底極性の神経上皮細胞のラウンドクラ​​スタとして特徴づけ、数日以内に出現し始めることを明視野顕微鏡を用いて確認してください。 図1）。 0.1M LDN193189、10M SB431542および1グラム/ mlのラミニンを補足したN2 / B27培地で一日おきに付着したEBを供給し続けます。

神経ロゼットの2収穫

注：我々は、神経ロゼットが酵素的に神経ロゼットセレクション試薬²⁰または類似の選択試薬を用いて回収することをお勧めします。神経ロゼットは、Th1、6ウェルポリ-L-オルニチン/ラミニンコーティングされたプレートに手動でピックアップすることができますがの方法は、さらに、NPCのために豊かにし、非神経細胞型を枯渇させるために、20日目でのピッキングの第二ラウンドを必要とすることが、ユーザのスキルに依存して、マスタに広範囲の訓練をとり、。

1. 14日目の神経ロゼットの酵素的選択のために、付着したEBから吸引メディアと6ウェルプレート用のウェルあたりの神経ロゼット選択試薬の1ミリリットルを追加します。 1時間37ºCでインキュベートする。
2. P1000のピペットマンを使用すると、静かに各ウェルから酵素を除去。洗浄するためにウェルあたりDMEM / F12の1ミリリットルを追加します。
3. P1000では、DMEM / F12の1ミリリットルを収集し、すぐにこのようにプレートからロゼットを取り外し、バックウェルにDMEM / F12を追放。ファルコンチューブにロゼットを収集します。
4. ピペットDMEM / F12とすぐに別の1ミリリットルが残りロゼットを切り離すために、同じウェルに放出する。 （粉末化しないでください。ロゼット凝集体を分割しないようにしてください）​​。同じファルコンチューブに神経ロゼットを収集します。
5. 手順を繰り返し、必要に応じて2.4。ロゼットは、容易に切り離すていない場合は、MOを追加酵素を再し、プロセスを繰り返す（2.1〜2.4ステップ）
6. 3分間300×gで細胞をスピン。吸引しNPC培地（ 表1）2ml中の洗浄、および再懸濁ロゼット。転送細胞（1：1）、ポリ-L-オルニチン/ラミニンコーティングした6ウェルプレートに。
7. 日15-21からは、神経ロゼットが展開されます。 NPCメディアに一日おきにロゼットを養う。
8. 神経ロゼットの品質を評価し、平らな線維芽細胞様細胞が培養中で拡大されていないことを確認してください。
   注：非ロゼットが解決しない場合は、NPCの文化は時々のAccutaseに拾っロゼットの唯一の最高の選択、手動ピッキングによって救済することができます。 37ºCで15分間解離する。ペレットを、24ウェルのポリ-L-オルニチン/ラミニン被覆プレート上にNPC培地で洗浄し、プレート。

神経前駆細胞の3.拡張

注：hiPSC NPCはマトリゲルまたはポリ-L-オルニチン/ラミニンでコーティングしたプレートのいずれかで成長させることができる。当社は通常Matrigeを使用リットルプレートそれらはより迅速かつ低コストで製造することができる。

1. すぐに、マトリゲルでコーティングされたプレートを準備解凍し、24ミリリットルでマトリ1mgの凍結した一定分量を再懸濁冷たいDMEM / F12を、すぐに2つの6ウェルプレートの各ウェルに2ミリリットルを配布する。 37ºCで少なくとも1時間インキュベートする。
   NOTE：マトリゲルを洗浄しないだけ吸引する必要がある、使用直前に。
2. 一日おきのNPCを養う非常に高い密度で維持するか、またはそれらが自然発生的にニューロンに分化する。
   より確立されたNPCは、通常、1分割されているが：：注としてまれに1回と隔週2：毎週4を、非常に低い通路NPCは1を分割することができる。
3. 、スプリット最初の吸引メディアと6ウェルプレートのウェルあたり1ミリリットル暖かいのAccutase（1X）を追加する。 10〜15分間37ºCでインキュベートする。
4. 静かにできるだけ機械的ストレスを含むDMEM / F12を含む15ミリリットルチューブに剥離した細胞を移す。酵素にいる間の細胞を滴定しないでください。 spinniによるペレット細胞5分間千×gでngの。
5. 吸引し、6ウェルのオリジナルのウェルあたり〜1ミリリットルNPC培地中での洗浄、および再懸濁のNPC。
   注：6ウェルディッシュのコンフルエントよく5-10万個の細胞を有することを期待する。これは、従来の再メッキ血球計数器を用いて細胞10μlのアリコートを計数することによって確認することができる。
6. NPCは、ニューロンまたはニューロスフェアとして再懸濁、再プレートのNPCに続いて。 NPCは、6ウェルプレートのウェル当たりプレート約100万〜200万細胞を維持するために。ニューロスフェア形成の効率は、実験および細胞株の間で変動するが、200,000から1,000,000細胞を非接着性6ウェルプレートのウェルに播種された場合、一般的に最高の​​発生ができる。ニューロスフェアの凝集が発生した場合、播種した細胞の数を減少させる。ニューロン培地でNPC培地を交換し、6ウェルプレートのウェルあたりのニューロンに分化する、プレート約200,000細胞。
7. 免疫組織化学的にすべての確立されたNPCラインを検証する。十分な細胞物質はEXPANれていたらネスチンおよびSOX2のための抗体とDED、ラベルのNPC。検証済みNPCラインも4〜6週間ニューロンに分化し、およびIIIチューブリンとMAP2ABための抗体で標識されるべきである。
   1. 10分間4℃でPBS中の4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定します。 PBS中1.0％トリトンで室温で15分間のNPCを透過性にし、次いで室温で30分間0.1％トリトン5％ロバ血清でブロックする。
   2. 4℃で一晩、0.1％トリトン5％ロバ血清中で一次抗体と共にインキュベートする。
      注：私たちは、以下の抗体を推奨：ヤギ抗Sox2の、1：200。マウス抗ヒトネスチン、1：200。ウサギ抗βIIIチューブリン、1：500。マウス抗βIIIチューブリン、1：500。マウス抗MAP2AB、1：200。 （ 図2）。
   3. RTで1〜2時間、0.1％トリトンで5％ロバ血清中で、300：PBSで洗浄した後、1でヤギ、マウスまたはウサギへの適切な結合二次抗体と二次抗体の細胞を培養する。を0.5μg/ mlのDAPI（4 '、核染色細胞を可視化、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール）、次いで、封入剤でマウントする。

4. NPC伝達

1. トランスフェクトされた細胞²¹の割合を増加させるためにspinfection（1時間、1,000×gでのウイルスの存在下での細胞培養プレートの遠心分離）を使用する。 NPC培地で希釈感染の所望の多重度（MOI）の力価を測定培地を吸引し、関連する過剰発現（または制御）と交換してレンチウイルス（またはレトロウイルス）、（通常は1-10）、。 1.5ミリリットルを6ウェルプレートのウェル当たりの体積（または組織培養プレートの他のタイプの適切にスケーリングされたボリューム）を使用する。千×gでスピンとプレート遠心機で1時間37ºC。
   注：理想的には、分割の1〜2日以内に、レンチウイルスまたはレトロウイルスベクターでのNPCを伝達する。商用または実験室で準備されたウイルスを使用しているかどうか、それが適切に連続希釈によって事前にウイルスのバッチを滴定するために役立ちます。 （ 図3）。
2. セル画を低減するために、lular死、spinfectionの8時間以内にメディアを交換。
   注：ウイルス統合および導入遺伝子の発現は、レポーター遺伝子蛍光によって24時間以内に検出可能であるべきである。 （ウイルスは蛍光レポーターを欠いている場合、これは評価するのがより困難であり、成功したトランスフェクションは最高の過剰発現製品のイムノブロット、免疫組織化学または定量PCRによって検証することができます。）全式は3〜7日かかる場合があります。追加のウイルスによる反復spinfectionsは、トランスフェクトされた細胞の割合を増加させるために必要とされ得る。再発spinfectionsは、毎日発生する可能性がありますが、そう頻繁である必要はありません。理想的には、蛍光レポーターを使用している場合、> 80％の細胞が標識されるべきである。

5.ニューロスフェア遊走アッセイ

注：NPCの酵素的解離以下自発的にニューロスフェアの形、 - 細胞はNPC培地中の懸濁液中で培養される場合、（NPC拡張に使用されるものと同一の方法によっては3.3-3.6ステップ）。

1. 簡単に言えば、解離する成長ニューロスフェアを生成するために非接着性のプレートで48時間NPC培地中のdのNPC。 （ 図4）。
2. 神経球の移行の場合は、96ウェルプレートに、むしろDMEMなく、ピッキングロスフェアの前に1〜2時間を冷たいNPCメディアを使用して新鮮なマトリプレートを準備します。井戸からマトリゲルを吸引しないでください。
3. もともと胚性幹細胞由来のニューロスフェア²²について公表したように、手動で細胞破片を除去するためにNPCのメディアで一度洗浄した後、顕微鏡下でNPC由来のニューロスフェアを選ぶ。マトリゲルコーティングした96ウェルプレートの各ウェルに一つのニューロスフェアを転送する。
4. 各96ウェルプレートにロスフェアに、冷たいNPC培地で希釈さらに0.5 mgのマトリゲルを追加します。
5. 手動でもピペットチップを使用しての途中で、個々の神経球をセンタリング。
   注：これは、結果のばらつきを低減するために、同様のサイズのニューロスフェアを選択することが重要である。
6. 移行が48時間に発生した後、ワット細胞を固定することを許可する目的の免疫組織化学的マーカーを有するi番目の4％パラホルムアルデヒドと汚れ。
7. 半径方向の移行は、それらが完全に4倍の顕微鏡対物レンズを使用して、写真のニューロスフェアを決定しようとする場合。ウェルのエッジまたは分析からの第神経球を接触させ、任意の神経球を除外します。
   注：マイグレーションがより長い48時間発生した場合は、結果の放射状の移行は可能性が4倍対物レンズを用いた画像に大きすぎることになる。
8. NIH ImageJソフトウェア（ 図5）を使用して、各神経球からの平均の移行を測定します。これは、以下に記載の分析方法のいずれかを使用して行うことができる。
   1. ラジアル移行：
      1. 手動で結果として得られる形状の面積を計算するために測定します（Ctrl + M）関数を使用するフリーハンド選択ツールを使用して最も遠い移動細胞のエッジをトレース。面積を測定する前にエリアは[分析 ]タブの下に設定し測定ウィンドウにチェックされていることを確認してください。使用してください面積測定、円（A ^=πR2）の面積についての式の値は、半径（外側）を決定する。
      2. オリジナルのニューロスフェアのエッジをトレース、面積を測定し、同じように半径（内側）を計算します。外側と内側の半径との差である総放射状の移行を計算します。
   2. 最大の細胞移動：
      1. 測定します（Ctrl + M）関数に続く直線選択ツールを使用して内側の神経球の端から5遠いセルの移動距離を測定します。

結果

ニューラルロゼットapico -基底極性の神経上皮細胞のラウンドのクラスターとしての特徴的な外観（ 図1）により、明視野顕微鏡を用いて、形態学的に同定することができる。 NPCは、非常に高い細胞密度で典型的に培養されても、すぐに継代の後、わずかに錐体状の細胞体と双極神経構造が見える（ 図1D）である。 IIIチューブリン染色はNPCの一部の割合が絶えず文化（ 図1F）内の神経分化を開始していることを示す、すべてのNPC集団においても見えるけれども検証済みのNPCは、細胞の大部分でネスチン及びSOX2を発現する。そのようなLmx1aのとFOXA2として中脳マーカーが（ 図1G-I）ではないが、このようなSOX2とPAX6、及びそのようなTBR2などの前脳の神経前駆細胞、などの神経幹細胞のマーカーは、また、NPCの中で表現されている。大規模フラット線維芽細胞様細胞のかなりの割合以内 NPC集団は、神経分化（ 図2）は、以下の多数のニューロンを生じる可能性が低いもの、低品質の...

ディスカッション

我々は^、NPCのにhiPSCsを区別することによりメソッド、hiPSC由来の神経細胞の遺伝子特性のかなりの部分が保存された神経細胞の種類を記載しており、それは、潜在的に疾患の病因⁸に貢献発達経路のためのプロキシとして機能することができる^11。私たちは詳細なてきたようにさらに、NPCは確実に複製し、簡単に私たちが病気の素因の分子および生化学的研究のために適切であり得ると信じて神経細胞集団を、形質導入されている。

我々は、前脳、パターン化されたNPCを区別し、培養する方法を詳述してきたが、それらは容易に他の細胞運命にパターニングのNPCを生成するように適合させることができる。フローティングEBを最初に0.5mg / mLのDKK1、10mMのSB431542、0.5 mg / mlのノギン及び1mMのシクロパミンで処理する場合は、海馬のNPCはNPC培地中で拡大し、20 ngのを補充し、ニューロン培地中で分化させることができるが生成される/ mlのWNT3A ⁷ 。代わりに、100...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM/F12	Life Technologies	#11330	HESメディア用
DMEM/F12	Life Technologies	#10565	ニューラルメディア
KO-Serum Replacement	Life Technologies	#10828	Needs to be lot testing
Glutamax	Life Technologies	#35050
NEAA	Life Technologies	#11140
N2	Life Technologies	#17502-048	ロットテストが必要
B27-RA	Life Technologies	#12587-010	ロットテストが必要
FGF2	Life Technologies	#13256-029	PBS + 1% BSA
LDN193189	Stemgent	#04-0074
SB431542	Stemgent	#04-0010
BDNF	Peprotech	#450-02	PBS + 0.1% BSA
GDNF	Peprotech	#450-10	PBS + 0.1% BSA
ジブチリル環状 AMP	Sigma	nbsp;#D0627	PBS + 0.1% BSA
L-アスコルビン酸	Sigma	#A0278	H20
STEMdiff Neural Rosette Selection Reagent	Stemcell Technologies	#05832
Accutase	InnovativeCell Technologies	AT-104
コラゲナーゼIV	Life Technologies	#17104019
CF1 mEFs	Millipore	#PMEF-CF
Poly-L-Ornithine	Sigma	P3655
Laminin, Natural Mouse 1 mg	Life Technologies	#23017-015
BD Matrigel	BD	#354230	10 mg / mlの冷DMEMで氷上に再懸濁し、2つの6ウェルプレート相当あたり1 mgを使用
組織培養処理された6ウェルプレート	Corning	3506
超低付着6ウェルプレート	Corning	3471
ヤギ抗Sox2	サンタクルス	sc­17320	1:200
マウス アンチヒューマン ネスティン	ミリポア	MAB5326	1:200
ウサギ アンチ -&β;III-チューブリン	コーヴァンス	PRB­435P	は1:500マウス
アンチベータで使用します。III-チューブリン	コーヴァンス	MMS­	1:500で
:200	マウス反MAP2AB	シグマ	M1406
プレート遠心分離機	ックマンコールター	ベックマンコールターアレグラX-14(SX4750プレートキャリア付き)