レンチウイルス形質導入と腸オルガノイドの下流分析のためのプロトコル

サマリー

このビデオプロトコルでは、一次腸上皮のオルガノイドにおけるレンチウイルス形質導入と、定量的RT-PCR、RNA-マイクロアレイ、免疫組織化学によるこれらの培養物の処理と下流分析について、段階的に説明します。

要約

オルガノイドと呼ばれる腸管絨毛構造は、適切な成長因子を補給することで、3次元的に持続的な培養を維持することができます。オルガノイドは、恒常性幹細胞の分化、細胞の極性、および成体腸上皮に知られているすべての最終分化細胞タイプの存在の点で元の組織と非常に類似しているため、上皮に関する実験的研究において不可欠なリソースとして機能します。オルガノイドでレンチウイルスまたはレトロウイルスベクターを使用して導入遺伝子または干渉RNAを発現させる可能性は、腸上皮および腸幹細胞の機能解析の機会を増やし、速度とコストにおいて従来のマウストランスジェニックを上回っています。現在のビデオプロトコルでは、ドキシシリン誘導性導入遺伝子、または過剰発現または遺伝子ノックダウンのためのIPTG誘導性ショートヘアピンRNAを使用して示されるレンチウイルスベクターによる小腸オルガノイドの形質導入を利用する方法を示します。さらに、オルガノイド培養では、実験的処理によっても減少する可能性のある微小な細胞数が得られることを考慮し、定量的RT-PCR、RNA-マイクロアレイ、免疫組織化学を目的としたダウンストリーム分析のためのオルガノイドの処理方法について説明します。腸管オルガノイドでの導入遺伝子発現と遺伝子ノックダウンを可能にする技術は、これらの腸上皮構造が持つ研究の可能性に貢献し、オルガノイド培養を細胞培養の新たな標準として確立します。

概要

腸上皮は、それが癌や幹細胞の研究から幅広い関心を引き付けるために引き起こした最も急速に増殖する身体組織の一つである。 2009年には技術が3次元構造^1を保全、マトリゲルに小腸陰窩の長期的な文化を生成するために出版された。これらの構造は、腸のオルガノイドと呼ばBMPのシグナル伝達経路阻害剤のノギン（ノグ）を含む定義された成長因子の数は、1（Rspo1）をrspondinはWntシグナル伝達経路の増強剤を補充した周囲の媒体との、標準的な技術を用いて培養することができ上皮成長因子（EGF）は、すべての腸の増殖^2-4を増強することが見出さ。

オルガノイドは、それらが非変異している点で、伝統的な癌細胞株を上回る幹細胞の階層構造を維持している、発生期の小さなint型で見つかったすべての細胞系統にそのまま携帯分極、展示分化を表示estinal上皮。これらは導入遺伝子を担持するように形質導入され得るか、またはRNA干渉は⁵構築ので、コストと速度のファセットトランスジェニックマウスを用いた実験を上回るため、特定の遺伝的要素を研究するために使用される。オルガノイドにおけるトランスジェニック発現は、マウスレトロウイルスまたはレンチウイルスベクターは^6,7のいずれかを用いて行うことができる。による有糸分裂細胞もっぱら^8を形質導入することが可能なマウスレトロウイルスの制限のため、レンチウイルス....

プロトコル

トランスフェクション試薬としてポリエチレンイミン（PEI）の調製

1. H ₂ O 100ml中にPEIの約150mgの溶解
2. 溶液が透明になるまで塩酸を加えてpHを7.4に溶液を調整し、完全に溶解するまで撹拌する。これは、10〜60分を取り、1mg / mlの最終濃度に水を追加してもよい。
3. ときに明確な、5ミリリットルの分量で℃の冷凍庫-80℃で滅菌した0.22μmのフィルターとストアを介してPEI溶液をフィルタリングする。

レンチウイルス粒子の2生産

1日目：

1. 細胞株の培養液162 25cm ²フラスコまたは大きなペトリ皿中の60％-80％集密に分割HEK293T細胞（DMEM、10％FCS、1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび2mMグルタミンサプリメントを補充した）。

2日目：

2. 一緒に添加することにより、総プラスミドDNAの45μgのを含有するDNAトランスフェクション溶液を準備レンチウイルスパッケージングベクター（pVSVgの7μgの、のpRSVのREV5μgの、PMDLの13μgの）と、興味や関心のあるshRNAの遺伝子をコードするレンチウイルスプラスミド20μgの。 DME....

結果

オルガノイドレンチウイルス形質導入

レンチウイルス粒子を使用したオルガノイド形質導入の技術は前と形質導入時のオルガノイドの正しい取り扱いに依存します。オルガノイド（ 図3A）を培養し、それらは単一の陰窩（ 図3B）に破砕した。既報の通り、GSK3阻害剤CHIR99021の存在下で培養されたこれらの単一陰窩は、嚢胞性陰窩^9（ 図3C）をとなった。その後オルガノイドは、単一の細胞にウイルス粒子の侵入を可能にするためにトリプシン処理した。レンチウイルス粒子を細胞に形質導入​​する際に、多くの方法は、スピノキュレーションまたは長期インキュベーションなどの伝達効率を向上させることを試みてもよい。高力価PGK-eGFPをレンチウイルスは、蛍光顕微鏡法によって形質導入効率の可視化を可能にするために使用した。このプラスミドオルガノイドの形質導入効率が高く、100％に近づいた（FIGUR電子4E、F）。レンチウイルス粒子（ .......

ディスカッション

現在のビデオプロトコルは、プライマリ腸上皮からオルガノイドのレンチウイルス形質導入および定量的RNA技術と免疫組織化学を使用して、これらのオルガノイドの下流の分析を記載する。

レンチウイルス形質導入は、多くの場合、培養プレート中の付着または浮遊細胞で行われる。オルガノイドの三次元構造は、ウイルス粒子に浸透し、それらを困難にするので、有効性を高めるために多くの方法が使用されている。 CHIR99021を使用したオルガノイドの前処理は、形質導入後、増殖し、それによって生存能力を向上させます。これは、単一の細胞が生存率の低下しておりますので、トリプシン処理した後に小細胞クラスターを維持することが重要である。マウスレトロウイルスを用いたウイルスの形質導入とは対照的に、レンチウイルス形質導入は、より効率的であり、通常、ES細胞¹⁰に増加伝達効率に公知の技術をスピノキュレーションを必要としない。マウスレトロウイルスまたはWHを使用する場合レンチウイルス形質導入の収量が低い効力エン、スピノキュレーションは、任意の形質導入率を高めるために利用することができる。最大限2 0.9.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ポリエチレン イミン	ポリサイエンス	23966-2
DMEM 培地	ロンザ	BE12-614F
子牛胎児血清	ロンザ	DE14-801F
ペニシリン-ストレプトマイシン	Invitrogen	15140-122
グルタミン	Invitrogen	25030-024
マトリゲル		BD BD 356231
Advanced DMEM-F12	Gibco	12634-010
N2	Invitrogen	17502-048
B27	Invitrogen	17504-044
N-acetyl システイン	Sigma	A9165-1G
マウス Egf		PMG8045
Hepes 1 M	Invitrogen	15630-056
glutamax 100x	Invitrogen	35050-038
Chir 99021	Axon	1386
Y27632	シグマ	Y0503-5MG
ポリブレン	シグマ	107689
ニコチンアミド	シグマ	N0636
プシン	ロンザ	BE02-007E
プロマイシン	シグマ	P7255Rneasy
ミニキット	Qiagen	74106
β-メルカプトエタノール	メルク	8,057,400,250
Ovation Pico WTAシステム	NuGen	3300-12
パラホルムアルデヒド	シグマ	252549-1L
ガラスバイアル円錐形12 mm×75 mm 5 ml	VWR	LSUKM12
エオシン イエロー	VWR	1,159,350,025

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