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方法論記事

外科的組織からの初代ヒト結腸腫瘍細胞の単離およびトラクションサイトメトリーのためのソフト弾性基板上にそれらを直接培養

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DOI：

10.3791/52532

⸱

2015年6月4日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Science and Engineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2College of Medicine, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Provena Covenant Medical Centre, 4Micro and Nanotechnology Laboratory, University of Illinois at Urbana-Champaign

この記事について

サマリー

外科的結腸腫瘍および正常組織から初代ヒト細胞を抽出するためのプロトコルが説明されています。次に、単離された細胞を、細胞外マトリックスタンパク質によって機能化された軟質弾性基質(ポリアクリルアミドヒドロゲル)上で培養し、蛍光マイクロビーズを埋め込みます。トラクションサイトメトリーは、細胞の収縮ストレスを評価するために行われます。

要約

癌細胞は、接着受容体と関連するシグナル伝達、膜タンパク質、細胞骨格アーキテクチャ、および分子モーター1、2からなる協調階層メカノケミカル·システムを使用して複雑に機械的剛性をマトリックスに応答する。機械的感受性の異なる癌細胞のin vitroでされていますない主要なヒト癌細胞と不死化細胞株またはマウス由来の一次細胞で主に検討しました。したがって、ほとんどは、 インビトロで原発性ヒト結腸癌細胞の機械的感受性について知られています。ここで、最適化されたプロトコルは、健康及び癌の外科的ヒト組織サンプルからの初代ヒト結腸細胞の単離を記載が開発されています。単離された結腸細胞は、その後、（ソフト（2 kP​​aの剛性）と（10 kPaの剛性）、ポリアクリルアミドハイドロゲルと細胞外マトリックスによって官能硬質ポリスチレン（〜3.6 GPaの剛性）基板硬いフィブロネクチン上で正常に培養されますこの場合）。蛍光マイクロビーズは、細胞培養表面近く柔らかいゲルに埋め込まれ、かつ牽引アッセイはフリーオープンアクセスソフトウェアを使用して、細胞の収縮応力を評価するために行われます。また、異なる剛性基板上の免疫蛍光顕微鏡は、基板剛性の関数としての接着斑を含む一次細胞形態、細胞骨格の組織とビンキュリンに関する有用な情報を提供しています。

概要

機械的な微小環境は、生物化学的要因に加えて、細胞機能の調節において重要な役割を果たしていることが、近年では、ますます明らかになっています。細胞を検知し、それらが3-7（2D培養におけるような）に付着または（3D培養においてなど）によって取り囲まれている基板の剛性に対応することができます。そうすることによって、細胞は、その分化3、形態4、遊走/運動性5、バイオ物性6、成長7、およびその他のプロセスを調節することができます。

癌細胞は、接着受容体と関連するシグナル伝達、膜タンパク質、細胞骨格アーキテクチャ、および分子モーター1,2の協調的、階層的なメカノケミカルの組み合わせを使用して2Dおよび3Dマトリックスの剛性に応答する。例えば、乳腺上皮細胞（のMEC）培養したときの剛性に似て150 Paの基板上に、通常の腺房実質を形成健康な乳房組織の。興味深いことに、彼らは腫瘍間質8の剛性を模倣するより硬い基板（> 5,000 Pa）での培養の構造および転写の両方の開発腫瘍の顕著な特徴は、示します。また、別の実験では、乳房腫瘍形成は、コラーゲン架橋およびECM 9を補強することによって達成されることを示しています。最近の実験は、ヒト結腸癌（HCT-8）を示す細胞は、生理学的に関連する剛性（20から47キロパスカル）を有する2次元基質上で培養したときの表現型（MLP）のような転移を表示ではなく、上の非常に硬い（3.6万気圧）基板10- 12。これらの細胞最初のフォーム腫瘍様細胞クラスターとは、その後、周囲から出発し、互いから解離します。丸みを帯びた形態学（E R遷移）に変更が発生する上皮このように、それらは、細胞 - 細胞および細胞-ECM付着を低減し、増殖、および遊走になります。これらを示さない非常に難しいポリスチレン基板上のHCT-8細胞培養悪性形質。したがって、それがHCT-8細胞が原因で、適切な微小環境への暴露に転移性になると仮定されています。これらの実験は、初代ヒト癌細胞を、一次細胞由来不死化ガン細胞株またはマウスで行われていないことは注目に値します。

最近の研究では、細胞の増強牽引応力が転移細胞選択図13の研究のための潜在的な生物物理学的な署名として使用することができることを提案しているポリアクリルアミドゲル上の異なるヒト癌細胞株のための牽引力を測定することを含みます。これは、転移性癌細胞は、全てのケース13内の非転移性細胞と比較して有意に高い引張り応力を発揮することができることがわかりました。しかし、これらの結果は、直接に、マウス由来の乳癌細胞株14で先に公開された知見と矛盾します。また、最近の研究では、それらの細胞骨格のリモデリングのプロ中の不死化および初代ヒト細胞間の顕著な違いを強調しテインプロファイリングおよび細胞生存タンパク質発現15。したがって、主要なヒト癌細胞に対するトラクションを含む、生物物理学的アッセイの多くを再検討することが重要です。これは、一次細胞が不死化癌細胞株の牽引傾向を再現するかどうかの質問に対処します。

ここで説明するプロトコルは、ソフト基板（ポリアクリルアミドハイドロゲル）などのペトリ皿の上にそれらを培養する（健常および癌両方）初代ヒト結腸細胞の単離のために最適化されています。プロトコルは、消化し ​​、単一細胞懸濁液16に外科的に組織サンプルの結果としての酵素的解離に基づいています。我々の知る限り、これは直接サイトメトリー牽引用の組み込み蛍光マイクロビーズとソフトヒドロゲル基材上に分離された原発性結腸腫瘍および正常細胞を培養の最初の実証です。透明なゲル基質はまた、免疫染色を可能にします。このアッセイは、F-アクチン組織の違いを明らかにし基板剛性の変化に応じて一次ヒト結腸細胞における接着斑。この細胞培養プラットフォームは、癌の予後のためのパラメータとして、細胞剛性とトラクションのような一次ヒト細胞の様々な生物物理学的特性を探索の可能性を開きます。

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プロトコル

以下で説明するプロトコルは、UIUC人間研究倫理委員会のガイドラインに従っています。

1.収集と外科組織サンプルの消化

  1. 右結腸切除（ 図1Aおよび1B）後の腫瘍組織サンプルを採取します。同様に、隣接する健康な部位から組織を採取してください。
  2. 12ミリリットルのHBSS溶液を含有する15ミリリットルバイアルにすぐに組織を転送します。絶縁発泡ボックス内の氷の上にバイアルをしてください。
  3. 45分以内に、さらなる処理のために、組織培養フードにバイアルを含む組織を輸送します。フード内部の氷のブロックにバイアルをしてください。
  4. ピペットを用いて、HBSS溶液を6-7 mlを含む6ウェルプレート内に供給された組織を注ぎます。
    注：ウェル当たり組織の量は、このすすぎ工程で重要ではありません。
  5. 氷のブロックに6ウェルプレートにしてください。二回HBSS溶液中で組織をすすぎます。
  6. 無菌SCISと分離セクションにきれいに組織を切断SOR。小さ ​​なセクションにミンチ組織滅菌メスの刃でサイズ1〜2 mm 3でより大きくありません。
  7. 組織を転送する前に（0.1％トリプシン溶液1 mlを含む）標識された0.1％のトリプシンバイアルを秤量します。ピペットで0.1％のトリプシンバイアルのそれぞれに〜20mgの組織を転送します。
  8. トリプシンのさらなる希釈を回避するために、トリプシンバイアルにHBSSの移動を最小限に抑えるようにしてください。
  9. 組織転送後、トリプシンバイアルを計量。組織塊のような違いを文書化します。
  10. 24ウェルプレートの各ウェルにトリプシン〜20mgの組織と1ミリリットルを注ぎます。
  11. 16〜20時間4℃の冷蔵庫でシェーカー上で24ウェルプレートを置きます。この待機期間中又は早期に、ポリアクリルアミドゲル基材を準備し、セクション3で説明したようにECMタンパク質とそれらを官能。

単一細胞懸濁液に2組織試料の酵素的解離およびECM官能弾性Substratの単離された細胞を培養しますESと硬質ポリスチレン料理

  1. シェーカー上で4℃でよくトリプシンでのインキュベーションの16〜20時間後、ピペットを用いて、（完全な増殖培地2-3 mlを含む）4°C完全な増殖培地バイアルに4℃のトリプシンから組織を移します。増殖培地へのトリプシンの最小限の移動を確認してください。
    注：完全増殖培地処方は以下の通りである：10％ペニシリン - ストレプトマイシン溶液全体の1％の最終濃度までウマ血清を補充したRPMI 1640基本培地。
  2. 12〜15分間37℃の温水浴中でメディアバイアルを含む組織を配置します。
  3. ピペットを用いて、HBSS溶液を含有する15ミリリットルバイアルに組織を移し、静かに振ります。
  4. 2.3を繰り返します。
  5. HBSS溶液を、1mlの溶液を含むバイアル（HBSS）で転送〜0.1％コラゲナーゼ溶液から組織を削除します。加湿細胞培養インキュベーター中で37℃、5％CO 2環境で45分間インキュベートします。待機期間、暖かいgrowt中に15ml中のH培地を水浴中で37℃にてバイアル。
  6. コラゲナーゼのキャリーオーバーを最小限にピペット内にすべての組織片を引き出します。予熱した培地バイアルにちょうど組織片を取り出します。
  7. 6ウェルプレートの各ウェルに40ミクロ​​ンよく挿入フィルタを配置します。 1mLの細胞培養培地を用いてフィルターを湿ら。
  8. 組織が完全に解離されるまで、10mlのガラスピペットで数回メディアでトリチュレート組織。
  9. バイアルの底にできるだけ近いピペットチップを維持します。
  10. 破片や未解離部分を除去するフィルター上に溶液を堆積させます。
  11. 遠心分離は、室温で5分間、150×gで培地中に細胞懸濁液を濾過しました。
  12. その後上清を除去し、2mlの新鮮な培地で細胞ペレットを再懸濁します。
  13. （必要な場合）血球計数器を用いて細胞数を計測します。シードは、細胞外マトリックス（ECM）官能ゲルおよび所望の濃度のポリスチレンディッシュ上で初代細胞を単離しました。

異なる剛性ポリアクリルアミド（PA）ゲルおよびポリスチレン基質の調製と機能化

注：第3の視覚的なデモでは、視聴者/読者は、最近の可視化実験のジャーナル（Joveの）第17条に言及されています。

  1. 採用公開プロトコル18、19は 、12ミリメートル2ガラスカバーは、ハイドロゲルの共有結合を確実にするために、化学的にスリップ有効にしてください。
    1. まず、ガラスカバーは、室温で7分間、3- Aminopropyltrymethoxysilane（ATS）でスリップ扱います。
    2. DI水リンスで完全にATSを削除して、治療のカバーは（70％グルタルアルデヒドのストック溶液からPBSで希釈）の0.5％グルタルアルデヒドで30分間溶液を用いてスリップ。
  2. / vのアクリルアミド溶液および0.05％N、N '-methylenebisacrylamide（ビス）10mMのHEPES緩衝化生理食塩水20内の溶液wの5％を混合して2キロパスカルのゲル溶液を得ます。 Vアクリルアミドおよび0.13 / wの8％を使用してください10 kPaのゲル20のための10mMのHEPES緩衝生理食塩水で％N、N '-methylenebisacrylamide（ビス）ソリューション。
    1. 200過硫酸アンモニウム（10％w / v）を1：両方の場合において、1を使用して2,000 N、N、N '、N'はそれぞれ、重合プロセスの開始剤および触媒として-tetramethylethylenediamine（TEMED）。
    2. また、受託者のマーカーとして2 kPaのゲル溶液に21、22を 100μlの蛍光ビーズを追加します。
  3. 12ミリメートル2活性化ガラスカバースリップ上に20μlのプレポリマーPAゲル溶液の液滴を付着させます。ドロップで別の12ミリメートル2正規ガラスカバースリップを置きます。ドロップが毛細管現象によるカバーガラスの間に広がっていることを確認してください。ビーズの大部分は細胞培養表面の近くに来ることを確実にするために2 kPaのゲルのためのサンドイッチを反転。
  4. RTで45分間、PAゲルを治します。
  5. 単一のエッジかみそりを使用して、トップカバースリップをはがし。
    注：一方の端から剥離、剥離が進行中にサンドイッチの。ゲルは、活性化されたスライドガラスに付着したままです。
  6. 使用前にPBS溶液中にゲルを保管してください。
  7. ECM分子は、公開された方法23以下の50μg/ mlの濃度でヒトフィブロネクチンとPAゲルおよびガラスを官能。
    1. 簡単に言えば、2ミリリットルの純粋なヒドラジン水和物のO / Nを有する基板をインキュベートします。
    2. ヒドラジン水和物を除去し、脱イオン水で十分に基板をすすぎます。
    3. 30分間、5％酢酸で基板を洗浄します。
    4. 酢酸を除去し、脱イオン水で十分に基板をすすぎます。
    5. 30分間DI水に浸漬した基板を保管してください。
    6. 50μg/ mlの濃度で35分間酸化フィブロネクチンを有する基板をインキュベートします。
    7. 10分間の低回転でシェーカー上でPBSで基板を洗浄します。
    8. 細胞をプレーティングする前に30分間、2〜3 mLの培養培地中で、37℃で、すべての基質をインキュベートします。
      注意：プレートの細胞をまばらに移入にD方式（1,000〜3,000細胞/ cm 2）。各ゲルで覆わ​​れたガラススリップを35mmペトリ皿中に含有させる必要があります。細胞は、任意の顕微鏡（少なくともO / N）の前に完全に接着させます。

4.牽引力顕微鏡および免疫蛍光顕微鏡アッセイ

  1. 牽引力顕微鏡アッセイ
    1. ウォーム0.25％トリプシンEDTA / 10分間水浴中で37℃で10％SDS溶液を牽引実験を開始する前に。
    2. 蛍光倒立顕微鏡ステージ（32X倍率）で、時間と場所で細胞培養インキュベーターから1つのゲルを削除してください。
    3. 視野内の1つのセルを検索します。ペトリ皿のふたを外します。
    4. 細胞の位相コントラスト画像（ 例えば 、 図3）を取ります。
    5. 蛍光に撮影モードを切り替えて、適切なフィルタを選択します。この時間の間に、顕微鏡ステージまたはサンプルを動かさないでください。
    6. 蛍光ビーズの画像を取るdisplac携帯牽引（ 図4C）によって編。
    7. ゲルからの細胞を分離するためにペトリ皿に1ミリリットルのトリプシン/ SDS溶液を追加します。この時間の間に、顕微鏡ステージまたはサンプルを動かさないでください。また、ゲルからの完全な除去を確実にするために、セルの制御画像を取ります。
    8. 細胞を除去した後、ビーズの基準（ヌル力）の画像を取ります。
    9. 他のすべてのゲルのための手順を繰り返し4.1.2-4.1.8。
    10. 各ケースのステップ4.1.6と4.1.8で取得した二つの画像からのImageJを用いた画像スタックを作成します。スタックするスタック→画像→画像：画像スタックを生成するには、画像を開いた後のImageJで次の一連のコマンドを使用します。
    11. 。変位場とトラクションを得るためには、公開された方法21、22次のImageJのプラグインを使用して次のリンク使用して、これらのプラグインのコードと詳細なチュートリアルを入手： https://sites.google.com/site/qingzongtseng/imaをgejplugins。
      1. 「テンプレートマッチング」プラグインを使用して、スタック内の画像の位置を合わせます。 OKプラグインスタックに→整列スライスマッチング→テンプレート→：ステップ4.1.10で生成された画像スタックを開いた後のImageJで次の一連のコマンドを使用します。その結果、画像スタックを保存します。次の手順で、この新しい画像スタックを使用します。
      2. PIV（粒子画像流速）プラグイン（ 図4D）を使用して変位場を取得します。 [OK]を→→OK→このPIVおよび出力を受け入れプラグイン→PIV→反復PIV（基本）：ステップ4.1.11.1に保存された画像スタックを開いた後、次の一連のコマンドを使用します。元の画像スタックと同じディレクトリにPIV出力を保存します。次のステップで入力としてこれを使用してください。
      3. 最後に、FTTC牽引マップ（ 図4E）を得るためにプラグインを（フーリエサイトメトリートラクションを変換）を使用します。プラグイン→FTTC→イン：次の一連のコマンドを使用しますERTの材料特性、 すなわち 、ヤング率およびPAゲルのポアソン比→OK→OKステップ4.1.11.2→で保存したPIV出力ファイルを選択します。保存FTTCは、画像スタックとPIV出力と同じディレクトリになります。
  2. 免疫蛍光顕微鏡アッセイ
    1. 層流フードに免疫染色する基材を取り出し、培養培地を除去します。
    2. PBSで基板を洗浄し、室温で20分間、PBS中の4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定します。
    3. 3回（各5分の時間）のために、PBSで基板を洗浄します。その結果、30分間500μlのシグナルエンハンサーを有する基板をインキュベートし、PBSですすいでください。
    4. RTで45分間、PBS中で250倍に希釈1のモノクローナル抗ビンキュリン抗体で細胞をインキュベートします。 3回（各5分の時間）のために、PBSで基板を洗浄します。
    5. 200希釈：1で二次抗体Alexa Fluor 488ヤギ抗マウスIgGとサンプルをインキュベート室温で30分間PBS中。 3回（各5分の時間）のために、PBSで基板を洗浄します。
    6. F-アクチンの構造を可視化するために、TRITCをRTで45分間濃度を50μg/ mlのコンジュゲートをファロイジンで細胞を培養します。 3回（各5分の時間）のために、PBSで基板を洗浄します。
    7. イメージ共焦点走査型レーザー顕微鏡を用いた試料（ 図5（a） - （d））。

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結果

上述のプロトコルが正常に機関の審査委員会のガイドラインに従って四つの異なる患者からの複数の組織サンプル（N = 12）のために使用される。 図1Aは、右の細胞培養のための組織切片が得られるから、手術後の代表的な大腸の腫瘍を示しています。さらなる処理のために層状フードに移した後HBSS溶液中の代表的な組織切片を、 図1Bに示されています。単一細胞懸濁液に消化および外科組織試料の酵素的解離の概略図を図2に示されています。

成功した組織解離した後、単離された初代ヒト細胞は、PAゲルおよびポリスチレンディッシュに播種します。位相差顕微鏡写真（ 図3Aおよび図3B）は、基板の剛性の関数として、初代ヒト結腸癌および正常細胞の代表的な形態を示しています。これは、ことは明らかです（健常および癌の両方）は、一次結腸細胞は、PAゲル（ 図3Aおよび3B）と比較して、ポ...

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ディスカッション

携帯牽引ストレスが最近転移状態13の潜在的な生物物理学的指標として浮上しています。しかし、原発腫瘍細胞との実験牽引データは、これまで文献に存在しません。また、直接異なる剛性のポリアクリルアミドゲル上で分離された原発性結腸細胞を培養することはまだ報告されていません。したがって、我々は、ゲル、ポリスチレン（ 図2）に最適化された原発性結腸細胞培養条件を確立します。ソフトゲル製剤中の細胞培養表面付近の蛍光マイクロビーズのカプセル化は、一次ヒト細胞（ 図4C、4D及び4E）によって生成された変位場とトラクションの測定を可能にします。また、免疫蛍光アッセイは、細胞骨格の組織と基板剛性が変化すると接着斑（ - 5D図5A）に関する重要な情報を提供することができます。その異なる癌および正常な不死化細胞に注意してください。ラインも広がり、アクチンストレスバンドル形成を増強し、増大した基板の剛性4、24-25と細長い接着斑の成熟を ​​示しています。

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

>jove_content<このプロジェクトは、全米科学財団ECCS助成金10-02165、およびイリノイ大学の学際的イノベーションイニシアチブプログラム助成金12035によって資金提供されました。M.Y. A.は、NIH国立がん研究所のナノテクノロジー・イン・キャンサー・アライアンス・イン・キャンサーの「Midwest Cancer Nanotechnology Training Center」グラントR25 CA154015AからUIUCから資金提供を受けました。免疫ステインおよび共焦点顕微鏡イメージングは、UIUCのゲノム生物学研究所(IGB)で実施されました。M.Y.A.は、UIUCのB.J.ウィリアムズとの分離実験に関する議論を認めています。M.Y.A.は、UIUCのC.NemehとAbdul Bhuiyaが回路図と材料リストの作成を支援してくれたことを認めています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Reagents
HBSSLife technologies14175-095
PBSLonza17-516F
TrypsinWorthingtonLS003736
CollageneseWorthingtonLS004176
3- Aminopropyltrymethoxysilane (ATS) Sigma-Aldrich281778
グルタルアルデヒド・ポリサイエンス社01201-5
アクリルアミドSigma-AldrichA4058<
em>N-メチレンビスアクリルアミド (ビス)Sigma-AldrichM1533
HEPES 緩衝液Sigma-Aldrich83264
過硫酸アンモニウムBio-Rad161-0700
ヒト フィブロネクチンBD バイオサイエンス354008
ヒドラジン水和物Sigma-Aldrich18412危険な
酢酸Sigma-AldrichA6283
パラホルムアルデヒド 電子顕微鏡科学RT15710
シグナルエンハンサーライフサイエンステクノロジーI36933
モノクローナル抗ビンキュリン抗体 Sigma-AldrichV9131
Alexa Fluor 488 ヤギ抗マウス IgGLife テクノロジーA11001
TRITC ファロイジンコンジュゲート シグマ-アルドリッチP1951
0.1 &マイクロ;m フルロセントビーズライフテクノロジーF8801
0.25% トリプシン-EDTAライフテクノロジー25200-056
Materials
12 mm2 ガラスカバースリップコーニング2865-12

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