ここでは、同系CD4+CD45RB高T細胞をT細胞およびB細胞欠損レシピエントに養子として移すことにより、マウスに結腸炎症を誘発するプロトコールを提示します。臨床的および組織病理学的特徴は、ヒトの炎症性腸疾患を模倣しています。この方法により、結腸性炎症の開始と疾患の進行の研究が可能になります。
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この記事について
サマリー
要約
ヒト炎症性腸疾患（IBD）、それぞれに長所と短所の病因を研究するために利用可能な多くの異なる動物モデルがある。ここではTおよびB細胞欠損レシピエントマウスに同系の脾臓CD4 + CD45RB high T細胞の養子移入によって開始される実験的大腸炎モデルを記述する。主にナイーブ、エフェクター細胞からなるCD4 + CD45RB 高 T細胞集団は、密接に、ヒトIBDの重要な側面に似た、慢性的腸炎を誘導することができる。この方法は、疾患の発症および進行の側面を研究するために操作することができる。さらに、それは腸の炎症、すなわち 、先天性、適応性の機能、及び調節免疫細胞集団、および環境曝露の役割は、微生物を研究するために使用することができる。この記事では、ステップバイステップのプロトコルで大腸炎を誘発するための方法論を示している。このINCludes成功裏に研究目的のために実験的大腸炎のこのマウスモデルを開発するために必要なキー技術的な側面のデモビデオ。
概要
炎症性腸疾患(IBD)クローン病と潰瘍性大腸炎は、宿主の免疫応答、遺伝的感受性、環境要因、および腸管腔内容物との間の不完全に定義された複雑な相互作用から生じます。最近のゲノムワイド関連研究は、免疫細胞制御遺伝子とIBD感受性との関連を報告しています2,3。これらの研究では、自然免疫細胞と適応免疫細胞の両方の固有遺伝子が表されており、IBDの病因におけるこれらの細胞集団の中心的な役割を示しています。
現在、ヒトIBDの動物モデルは50以上存在します。ヒトIBDを完璧に表現コピーするモデルは1つもありませんが、疾患の発症や進行、創傷治癒反応など、ヒトの疾患のさまざまな側面を研究するのに役立つものが多くあります。本明細書に記載の方法では、同系脾臓CD4+CD45RB高T細胞養子移行により腸の炎症がT細胞およびB細胞欠損レシピエントマウス4に開始される。CD4+CD45RB高T細胞集団には、主に活性化のために準備されたナイーブT細胞が含まれており、慢性的な小腸および結腸の炎症を誘発することができます。この方法により、研究者は、自然免疫細胞集団と適応免疫細胞集団の両方を含む主要な実験変数を変更して、疾患の病因に関連する生物学的に関連する質問に答えることができます。さらに、この方法では、疾患の発症を正確に開始し、十分に特徴付けられた実験....
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プロトコル
注：すべての動物のプロトコルはによっておよび施設内動物管理使用委員会（IACUC）規制や実験動物の管理と使用に関する米国学術研究会議·ガイドに準拠して承認されていることを確認します。ドナーマウスは、男性または女性のいずれでもよいが、レシピエントマウスは、雄であるべきである。女性の受信者が使用する場合、ドナーマウスは、雌5でなければならない。 、したがって、マウス5,6の大腸炎の表現型を、これらが腸内細菌叢に影響を与える可能性があるように、定期的に、非滅菌寝具と非酸性化した水を使用してコロニーを維持し、。
1。実験の準備
- 氷のように冷たいメディアとバッファを使用。実験を通して氷上で細胞を保管してください。
- 無菌技術を用いた無菌のバイオハザードフード中で実験を行います。
脾臓T細胞の2の分離
- 子宮頸dislocatio続くCO 2チャンバー内でドナーマウス/マウスを安楽死させるN。 70％エタノールで腹部スプレー。
- 腹部の横切開を行い、腹膜を露出するために皮膚をはがし。腹膜離れて鉗子で内臓からのホールドと脾臓を露出し、切除する左腹部腹膜の切開を作る。
- ペトリ皿の中で完全なメディアの10ミリリットルで脾臓を置きます。脾臓から....
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結果
約成体C57BL / 6ドナーマウスから脾臓を10から10×10 6個のCD4 + CD45RB high T細胞を確実に分離されている。この数は、年齢や歪みドナーマウスの研究者の習熟度に応じて変化するであろう。 - / - 4×10 5 C57BL / 6 CD4 + CD45RB high T細胞をC57BL / 6 RAG1に転送されたとき、レシピエントマウスマウスは、より重篤な疾患に遺伝的に感受性である場合、疾患の臨床徴候は、（5週後の補充または早く周囲に現れる図2、3）11,12。 - / -早くも3週間後（ 図3A）12のような受信者のCD3 + T細胞を、RAG1の結腸内蓄積が見られる。
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ディスカッション
ここでは、免疫不全マウスにCD4 + CD45RB + T細胞の養子移入によってマウスでの大腸の炎症を誘導するステップバイステップのプロトコルを記述します。 - / -レシピエントマウス、他の系統であるが（ 例えば 、BALB / C、129S6 / SvEv、非肥満糖尿病（NOD））及び免疫不全の遺伝的モデル（ 例えば 、SCID、 が、Rag2我々はC57BL / 6ドナー脾臓と同系RAG1を使用- / - ）4,14-16をも使用することができる。これはよくバックグラウンド系統マウス1における実験的大腸炎の重症度に影響を与えることが確立されている。さらに、マウスの集団内の腸内細菌叢は、同じ機関6,17内のものとの間で、施設間で大きく異なる。 - / -マウス4週目の転写後、私たちのと他人の経験RAG1で- / - 図2および
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開示事項
著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。
謝辞
この作品はアメリカの消化器協会（AGA）研究学者賞とクローン病とアメリカの大腸炎財団（SZSへ）（CCFA）キャリア開発賞、（ECS）は、NIH NIDDK F30 DK089692、胃腸生物学ノースカロライナ大学のセンターによってサポートされていましたと疾病グラントのP30のDK34987（組織学コア）。 UNCフローサイトメトリーコアファシリティは、UNCラインバーガー総合がんセンターのNCIセンターコアサポートグラント（P30CA016086）によって部分的にサポートされています。私たちは、病理組織学的分析および免疫組織化学との彼の助けを獣医のノースカロライナ州立大学からルークB.ボーストに感謝。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬名/装置名 | 会社 カタログ番号 | コメント/説明 | |
| 10x PBS | ギブコ | 14200075 | |
| 12 mm x 75 mm 丸底チューブ | ファルコン | 352052 | |
| 15 ml 円錐形 | コーニング | 430790 | |
| 26 G x 3/8 ニードル | BD バイオサイエンス | 305110 | |
| 50 ml 円錐形 | コーニング | ||
| 70 μm Cell Strainer | Fisherbrand | 22363548 | |
| BD IMagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| &-mercaptoethanol | Thermo Scientific | 35602 | |
| CD4-FITC IgG2b | eBioscience | 11-0041 | |
| CD45RB-PE IgG2a | BD Pharminogen | 553101 | |
| Complete Media | RPMI-1640, 1%ペン/連鎖球菌、10% FBS、0.0004% &β;-ME | ||
| FACS チューブ + ストレーナー | BD Falcon | 352235 | |
| ガラス顕微鏡スライド | フィッシャーブランド | 12550A3 | |
| 熱不活性化 FBS | Gemini | 100-106 | |
| ラベリングバッファー | 1x PBS、0.5% BSA、2 mM EDTA | ||
| 溶解バッファー | 0.08% NH4Cl、0.1% KHCO3、1 mM EDTA | ||
| MoFlo XDP | ベックマン・コールター | ||
| マウス CD4 T リンパ球濃縮セット - DM | BD Biosciences 558131 | ||
| マウス IgG2a-PE | BD BD ファーミノーゲン 553457 | ||
| マウス IgG2b-FITC | eBioscience | 11-4732 | |
| パスツールピペット | フィッシャーブランド | 13-678-20D | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン溶液、100X | Corning Cellgro | 30-002-CI | |
| [header] | |||
| ペトリ皿 | フィッシャーブランド | 875713 | |
| Pure Ethanol 200 Proof Decon | Labs | 2705-HC | |
| RPMI-1640 | Gibco | 11-875-093 | |
| Syringe | BD Biosciences | 309597 | |
| Trypan blue | Corning Cellgro | 25-900-CI | |
| ウォッシュメディア | RPMI-1640、1% ペン/溶連菌、0.0004% β-ME |
参考文献
- Xavier, R. J., Podolsky, D. K. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 448 (7152), 427-434 (2007).
- Cho, J. H., Brant, S. R. Recent insights into the genetics of inflammatory bowel disease. Gastroenterology. 140 (6), 1704-1712 (2011). <....
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再版と許可
