方法論記事

エフェクターCD4の養子移入によるマウス腸の炎症の誘導 + CD45RB高い免疫不全マウスへのT細胞

DOI：

10.3791/52533

⸱

2015年4月21日

 ,  , 
1Center for Gastrointestinal Biology and Disease, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Microbiology and Immunology, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Genetics, University of North Carolina at Chapel Hill, 4Curriculum in Genetics and Molecular Biology, University of North Carolina at Chapel Hill

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、同系CD4+CD45RB高T細胞をT細胞およびB細胞欠損レシピエントに養子として移すことにより、マウスに結腸炎症を誘発するプロトコールを提示します。臨床的および組織病理学的特徴は、ヒトの炎症性腸疾患を模倣しています。この方法により、結腸性炎症の開始と疾患の進行の研究が可能になります。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ヒト炎症性腸疾患（IBD）、それぞれに長所と短所の病因を研究するために利用可能な多くの異なる動物モデルがある。ここではTおよびB細胞欠損レシピエントマウスに同系の脾臓CD4 + CD45RB high T細胞の養子移入によって開始される実験的大腸炎モデルを記述する。主にナイーブ、エフェクター細胞からなるCD4 + CD45RB 高 T細胞集団は、密接に、ヒトIBDの重要な側面に似た、慢性的腸炎を誘導することができる。この方法は、疾患の発症および進行の側面を研究するために操作することができる。さらに、それは腸の炎症、すなわち 、先天性、適応性の機能、及び調節免疫細胞集団、および環境曝露の役割は、微生物を研究するために使用することができる。この記事では、ステップバイステップのプロトコルで大腸炎を誘発するための方法論を示している。このINCludes成功裏に研究目的のために実験的大腸炎のこのマウスモデルを開発するために必要なキー技術的な側面のデモビデオ。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

炎症性腸疾患(IBD)クローン病と潰瘍性大腸炎は、宿主の免疫応答、遺伝的感受性、環境要因、および腸管腔内容物との間の不完全に定義された複雑な相互作用から生じます。最近のゲノムワイド関連研究は、免疫細胞制御遺伝子とIBD感受性との関連を報告しています2,3。これらの研究では、自然免疫細胞と適応免疫細胞の両方の固有遺伝子が表されており、IBDの病因におけるこれらの細胞集団の中心的な役割を示しています。

現在、ヒトIBDの動物モデルは50以上存在します。ヒトIBDを完璧に表現コピーするモデルは1つもありませんが、疾患の発症や進行、創傷治癒反応など、ヒトの疾患のさまざまな側面を研究するのに役立つものが多くあります。本明細書に記載の方法では、同系脾臓CD4+CD45RB高T細胞養子移行により腸の炎症がT細胞およびB細胞欠損レシピエントマウス4に開始される。CD4+CD45RB高T細胞集団には、主に活性化のために準備されたナイーブT細胞が含まれており、慢性的な小腸および結腸の炎症を誘発することができます。この方法により、研究者は、自然免疫細胞集団と適応免疫細胞集団の両方を含む主要な実験変数を変更して、疾患の病因に関連する生物学的に関連する質問に答えることができます。さらに、この方法では、疾患の発症を正確に開始し、十分に特徴付けられた実験時間経過を得ることができます。これにより、マウスの疾患進行の臨床的特徴の動態学的研究が可能になります。この方法によって誘発される腸の炎症は、慢性的な大腸および小腸の経壁炎症、TNFやIL-12などのサイトカインによって引き起こされる病因、消耗などの全身症状など、ヒトIBDと多くの特徴を共有しています5。したがって、ヒトIBDの病因を研究するための理想的なモデルシステムです。

ここでの方法は、CD4+CD45RB高T細胞のRag1-/-マウスへの養子移植による実験的大腸炎の誘発プロトコルを詳細に説明しています。主要な技術的手順、期待される結果、最適化、およびトラブルシューティングについて説明します。私たちは、この腸の炎症のマウスモデルの開発を成功させるために必要な要素に取り組みます。

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プロトコル

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注：すべての動物のプロトコルはによっておよび施設内動物管理使用委員会（IACUC）規制や実験動物の管理と使用に関する米国学術研究会議·ガイドに準拠して承認されていることを確認します。ドナーマウスは、男性または女性のいずれでもよいが、レシピエントマウスは、雄であるべきである。女性の受信者が使用する場合、ドナーマウスは、雌5でなければならない。 、したがって、マウス5,6の大腸炎の表現型を、これらが腸内細菌叢に影響を与える可能性があるように、定期的に、非滅菌寝具と非酸性化した水を使用してコロニーを維持し、。

1。実験の準備

  1. 氷のように冷たいメディアとバッファを使用。実験を通して氷上で細胞を保管してください。
  2. 無菌技術を用いた無菌のバイオハザードフード中で実験を行います。

脾臓T細胞の2の分離

  1. 子宮頸dislocatio続くCO 2チャンバー内でドナーマウス/マウスを安楽死させるN。 70％エタノールで腹部スプレー。
  2. 腹部の横切開を行い、腹膜を露出するために皮膚をはがし。腹膜離れて鉗子で内臓からのホールドと脾臓を露出し、切除する左腹部腹膜の切開を作る。
  3. ペトリ皿の中で完全なメディアの10ミリリットルで脾臓を置きます。脾臓から余分な組織を除去し、廃棄する。
  4. つぶすと単一細胞懸濁液に脾臓を離れていじめる2滅菌ガラススライドを使用してください。 50ミリリットルに70μmのストレーナーを通してフィルタ細胞懸濁液円錐管に完全メディア5mlでストレーナーをすすぐ。 1 50ミリリットルコニカルチューブに5脾臓まで置きます。
  5. 7分間450×gで遠心分離した細胞。オフ注ぐことによって、または廃棄物容器に真空吸引により上清を捨てる。
  6. 穏やかに室温で10分間、赤血球を溶解するために溶解緩衝液の脾臓当たり5mlの細胞を再懸濁。チューブへの完全なメディアの等量の（脾臓あたり5ミリリットル）を追加します。
  7. 静かにラベル緩衝液10mlで細胞を懸濁します。
  8. トリパンブルー排除により、細胞を数える。
    1. 細胞懸濁液の20μlのを削除し、マイクロチューブに180μlのトリパンブルーに加え、十分に混合する。 5分後、顕微鏡下で非青色細胞を血球計数器とカウントする10μlの標識細胞を追加します。生存細胞の総数を決定します。セル/パンブルーミックスを破棄します。
  9. 7分間450×gで標識化緩衝液10mlで遠心細胞。オフ注ぐことによって、または廃棄物容器に真空吸引により上清を捨てる。

CD4 + T細胞の3濃縮

注：このセクションで使用される特定の製品については、製造元の指示に従ってください。

  1. 穏やかに冷たいラベル20×10 6細胞/ mLの単一細胞懸濁液に細胞を再懸濁INGバッファー。
  2. ビオチン化CD4 T細胞濃縮抗体の1×10 6細胞あたり5μlを添加する。 15分間氷上で細胞をインキュベート。
  3. ラベルバッファーの10倍のボリュームを追加します。 7分間450×gで遠心した細胞。慎重に廃棄物容器内に真空吸引を使用してすべての上清を吸引する。
  4. 徹底的にストレプトアビジン結合磁性粒子をボルテックス。 1×10 6細胞当たりの粒子の5μlを添加する。
  5. 徹底的になく穏やかに混合。 30分間6-12℃でミックスしてください。
  6. 20-80×10 6細胞/ mlの濃度に標識バッファーを加える。 12×75ミリメートルの丸底試験管当たりの標識細胞を1.0mlにまで転送する（「ポジティブフラクションチューブ」と称する）。
  7. 6-8分間磁石上の各ポジティブフラクションチューブを置きます。
  8. まだ磁石に正のフラクションチューブを、慎重に新しい無菌の50mlの円錐チューブにガラスパスツールピペットでポジティブフラクションチューブから上清を移す（referre「濃縮画分」などからd）。この濃縮画分は、CD4 + T細胞が含まれています。磁石に引きつけ標識細胞を破壊しないように注意してください。
  9. 精力的に上下にピペッティングすることによって、ステップ3.6のようにラベル表示のバッファの同じ体積でポジティブフラクションチューブに残って細胞を再懸濁し。 6-8分間背面磁石に正のフラクションチューブを置きます。
  10. まだ磁石に正のフラクションチューブを、慎重に磁石に付着した細胞を破壊することなく、ステップ3.8から50ミリリットルのコニカルチューブを無菌ガラスパスツールピペットでポジティブフラクションチューブから上清（濃縮画分、CD4 +）を転送。
  11. 繰り返して得られたCD4 + T細胞の収量を増加させるために3.9から3.10までを繰り返す。濃縮画分（CD4 +細胞）を使用してプロトコルを継続します。

4.ラベル付けとソートセル7

  1. 遠心7分間450×gで細胞を濃縮。または真空suctをオフに傾けて上清を除去廃棄物容器にイオンを打ち込む。
  2. ラベル緩衝液1mlに細胞を再懸濁。カウントするとステップ2.9のようにトリパンブルー排除により、細胞生存率のために評価するために、細胞のアリコートを削除します。
  3. 10×10 6細胞/ mlに標識バッファーの容量を追加する。細胞が既にある場合は<10×10 6、7分間450×gで遠心分離は、廃棄物容器に捨てるか、真空吸引により上清を捨て、そして10×10 6細胞/ mlに標識バッファーの容量を追加する。
    1. マイクロチューブ内アイソタイプ染色し、染色されていない、および単一染色対照細胞のために約5〜10×10 5個の細胞それぞれの個別の分量を設定します。
  4. 細胞に5μg/ mlのCD4-FITCおよび1μg/ mlのCD45RB-PEを追加します。マイクロチューブ中でアリコートを適切な同じ濃度で、アイソタイプ対照汚れやシングルの汚れを追加します。うまくしかし穏やかに混合し、30分間、光から保護氷上でインキュベートする。
  5. 細胞とコントロールにラベルバッファーの10倍のボリュームを追加します。S。 7分間遠心450 XG。廃棄物容器に真空吸引により上清を捨てる。
  6. ステップ4.5でボリュームにラベルバッファーに懸濁します。 7分間遠心450 XG。廃棄物容器に真空吸引により上清を捨てる。
  7. 10×10 6細胞/ mlに標識化緩衝液に再懸濁する。 FACSチューブに70μmのストレーナーを通して細胞を渡します。 FACSの準備が整うまで、光から保護氷上に保管してください。
  8. 設定し、非染色細胞と単染色コントロールとセルソーター上の適切な補償を決定する。
  9. 順方向及び側方散乱ゲーティング（ 図1A）と生育不能細胞を除外します。アイソタイプ染色コントロールとCD4 +およびCD45RB +細胞のためのゲーティングを設定します。 CD4 +集団上のゲート細胞。
  10. 完全なメディアの2ミリリットルにチューブにPE染色細胞のための単純なヒストグラムを用いた高 CD45RBとCD45RB 低集団にソートCD4 +細胞。 高 CD45RB + CD45RB +細胞（ 高 CD45RB）の最高40％を表し、CD45RB 低集団はCD4 + CD45RB +細胞の最低20％である（ 低 CD45RB; 図1B）。

figure-protocol-1
図1：FACS分析中CD4 + CD45RB T細胞集団のプロット代表的なフローサイトメトリー（A - C）FITC CD4-、ドナーからPE CD45RB染色した脾細胞C57BL / 6マウスを、CD4 +高 CD45RBおよびCD4 +にFACSによって選別した。 CD45RB 低い T細胞集団。 （A）ダブレットイベントが前方散乱プロット上除外された。 （B）、リンパ球を前方および側方散乱プロットにゲートした。 （C）CD4 + 商標> T細胞をゲートし、および（D）CD4 + CD45RB + T細胞を、PEに対するイベントヒストグラムにプロットした。 CD4 + CD45RB low細胞をCD45RB +細胞の最低20％であると考えられた。 CD4 + CD45RB high細胞をCD45RB +細胞の最大40％と定義した。

  1. 集団の純度を評価するためにFACSマシン上の各細胞集団のアリコートを実行する。
  2. 遠心7分間450×gで細胞を選別した。 1mlのPBSで再懸濁します。カウントするとステップ2.9のようにトリパンブルー排除により、細胞生存率のために評価するために、細胞のアリコートを削除します。

受信者への細胞の5インジェクション

  1. 再懸 ​​濁し、4×10 6細胞/ ml（CD45RB 高 ）またはPBS中の2×10 6細胞/ ml（ 低 CD45RB）に細胞を選別した。
  2. 新しい滅菌チューブに受信者ごとCD45RB high細胞の100μlのを転送します。 PBSあたり100μlのを追加します。このチューブに受信者。したがって、動物あたりの総注射容量は200μlであり、受信者ごとの細胞の総量は、4×10 5個のCD4 + CD45RB 高ナイーブT細胞である。
  3. 制御性T細胞を受けた実験群が必要な場合は、新しい滅菌チューブに受信者ごとCD45RB 高い細胞100μlを移す。同じチューブに受信者ごとCD45RB 低細胞100μlを追加。動物あたりの総注射容量は200μlである。 CD45RB 高の比率：CD45RB low細胞は2：1である。
  4. ハイ / CD45RB 低 CD4 +細胞の腹腔内各受信者の腹部（200μLの合計）の右側と左側にCD45RB 高またはCD45RB100μlのを注入。

レシピエント動物における疾患進行の6モニタリング

  1. レシピエント動物の臨床状態を評価するために、以下のparameteの集計臨床スコアを割り当てる注射の日のRS 8、その後毎週、および屠殺時：
    1. 重量損失を測定することによって無駄に判断します。0 - なし減量を。 1 - 初期体重の0.1〜10％の損失。 2 -最初の体重（ 図2A）の10％以上の損失。

figure-protocol-2
図2：炎症の臨床的および肉眼的病理学的徴候は、RAG1に野生型CD4 + CD45RB high T細胞の転写後に起こる- / -およびNRDKOレシピエントマウス11（A）NRDKO受信者5によってその初期体重の平均は10％で失わ週間後転送、RAG1のに対し、- / -レシピエントは、この時点で疾患の臨床徴候を示さなかった。各点は、平均±SEMコホートの初期体重の平均パーセンテージを表す。 **、P <0.005。直腸脱の存在によって示されるように（B）いくつかのマウスは、重篤な腸炎を発症した。これはNRDKOレシピエントマウスにおける直腸脱の代表画像です。 （C）肉眼、からコロン両方RAG1 - / -とNRDKOレシピエントマウスは、RAG1からコロンに比べて厚くなったと短縮されている- / -およびT細胞の養子移入せずにNRDKOマウス。 NRDKOレシピエントマウスからのコロンが重度の炎症と増加したコロンの重み（データは示していない）を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

    1. それが経過するまで、清潔な容器内に動物を置くことによって、糞便の質を決定するスツール：0 - なし。 1 - ソフトスツール。 2 - 水っぽい及び/または血便。
    2. 病気の以下の徴候の存在によって動物の全般的な健康状態を決定します。0 - なし猫背の姿勢、毛皮、または皮膚病変を毛。 1 - 次の本のいずれか：猫背の姿勢は、毛皮、皮膚病変を剛毛。
    3. 直腸脱の存在の決定：0 - 不在を。 1 -現在（ 図2B）。
  2. 彼らは彼らの開始体重の20％を失ったか、いずれか早い方所望の時点、でてきたとき頸椎脱臼に続いてCO 2吸入により動物を生け贄に捧げる。臨床疾患は週5ポスト充満から始まる通常は明らかである。
  3. 以前に5,7を説明するように、疾患の重症度について評価します。
    1. ステップ6.1 8のように、臨床スコアを割り当てます。
    2. 結腸の長さと重さ（ 図2C）を測定します。
    3. 炎症の組織学的分析を実行します5。
    4. 腸組織外培養における自発的なサイトカイン発現9、腸間膜リンパ節10、および/ ​​または血清11を決定します。
      1. 簡単に言えば、外植片培養9のために、縦方向に開いて、屠殺後のコロンを削除して、PBSで洗浄してください。室温で30分間完全培地中で、250rpmでオービタルシェーカーセットにコロンをインキュベートします。
      2. 組織を小片にチョップし、24時間完全培地中で37℃でインキュベートした。上清を収集し、ELISAにより100 mgの組織あたりのサイトカインの定量のために使用します。
    5. T細胞の表現型および/ ​​または機能10のex vivoでの特性評価を行います。

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結果

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約成体C57BL / 6ドナーマウスから脾臓を10から10×10 6個のCD4 + CD45RB high T細胞を確実に分離されている。この数は、年齢や歪みドナーマウスの研究者の習熟度に応じて変化するであろう。 - / - 4×10 5 C57BL / 6 CD4 + CD45RB high T細胞をC57BL / 6 RAG1に転送されたとき、レシピエントマウスマウスは、より重篤な疾患に遺伝的に感受性である場合、疾患の臨床徴候は、（5週後の補充または早く周囲に現れる図2、3）11,12。 - / -早くも3週間後（ 図3A）12のような受信者のCD3 + T細胞を、RAG1の結腸内蓄積が見られる。

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ディスカッション

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ここでは、免疫不全マウスにCD4 + CD45RB + T細胞の養子移入によってマウスでの大腸の炎症を誘導するステップバイステップのプロトコルを記述します。 - / -レシピエントマウス、他の系統であるが（ 例えば 、BALB / C、129S6 / SvEv、非肥満糖尿病（NOD））及び免疫不全の遺伝的モデル（ 例えば 、SCID、 が、Rag2我々はC57BL / 6ドナー脾臓と同系RAG1を使用- / - ）4,14-16をも使用することができる。これはよくバックグラウンド系統マウス1における実験的大腸炎の重症度に影響を与えることが確立されている。さらに、マウスの集団内の腸内細菌叢は、同じ機関6,17内のものとの間で、施設間で大きく異なる。 - / -マウス4週目の転写後、私たちのと他人の経験RAG1で- / - 図2および

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開示事項

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この作品はアメリカの消化器協会（AGA）研究学者賞とクローン病とアメリカの大腸炎財団（SZSへ）（CCFA）キャリア開発賞、（ECS）は、NIH NIDDK F30 DK089692、胃腸生物学ノースカロライナ大学のセンターによってサポートされていましたと疾病グラントのP30のDK34987（組織学コア）。 UNCフローサイトメトリーコアファシリティは、UNCラインバーガー総合がんセンターのNCIセンターコアサポートグラント（P30CA016086）によって部分的にサポートされています。私たちは、病理組織学的分析および免疫組織化学との彼の助けを獣医のノースカロライナ州立大学からルークB.ボーストに感謝。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬名/装置名会社 カタログ番号コメント/説明
10x PBSギブコ14200075
12 mm x 75 mm 丸底チューブファルコン352052
15 ml 円錐形コーニング430790
26 G x 3/8 ニードルBD バイオサイエンス305110
50 ml 円錐形コーニング
70 μm Cell StrainerFisherbrand22363548
BD IMagnetBD Biosciences552311
&-mercaptoethanolThermo Scientific35602
CD4-FITC IgG2beBioscience11-0041
CD45RB-PE IgG2aBD Pharminogen553101
Complete MediaRPMI-1640, 1%ペン/連鎖球菌、10% FBS、0.0004% &β;-ME
FACS チューブ + ストレーナーBD Falcon352235
ガラス顕微鏡スライドフィッシャーブランド12550A3
熱不活性化 FBSGemini100-106
ラベリングバッファー1x PBS、0.5% BSA、2 mM EDTA
溶解バッファー0.08% NH4Cl、0.1% KHCO3、1 mM EDTA
MoFlo XDPベックマン・コールター
マウス CD4 T リンパ球濃縮セット - DMBD Biosciences 558131
マウス IgG2a-PEBD BD ファーミノーゲン 553457
マウス IgG2b-FITCeBioscience11-4732
パスツールピペットフィッシャーブランド13-678-20D
ペニシリン-ストレプトマイシン溶液、100XCorning Cellgro30-002-CI
[header]
ペトリ皿フィッシャーブランド875713
Pure Ethanol 200 Proof DeconLabs2705-HC
RPMI-1640Gibco11-875-093
SyringeBD Biosciences309597
Trypan blueCorning Cellgro25-900-CI
ウォッシュメディアRPMI-1640、1% ペン/溶連菌、0.0004% β-ME
430828

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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