CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas(CRISPR関連)システムなどのゲノム編集ツールは、ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)の遺伝子ターゲティング効率を大幅に向上させました。この原稿では、CRISPR/Casシステム支援相同組換えを使用して系統特異的なhiPSCレポーターを生成するためのプロトコルについて説明します。
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方法論記事
hiPSC神経系統を効率的に生成するCRISPRを使用して特定のノック記者/ Cas9とCas9ダブルニッカーゼシステム
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この記事について
サマリー
要約
遺伝子ターゲティングは、現代の生物医学研究における遺伝子機能を特徴付けるための重要なアプローチです。しかし、ヒト細胞における遺伝子ターゲティングの効率は低く、そのためにヒト細胞株を所望の速度で作製することができません。この2年間で、CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas(CRISPR関連)システムなどのゲノム編集ツールによる遺伝子操作の効率化が急速に進んでいます。この原稿では、CRISPR/Casシステム支援相同組換えを使用して、系統特異的なヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)レポーターを生成するためのプロトコルについて説明します。CRISPR/Casシステムを用いて神経系統レポーターラインを作製するために必要な成分を得るための手順について、ターゲティングベクターとシングルガイドRNAの構築を中心に説明する。このプロトコルは、hiPSCのプラットフォーム確立と変異修正に拡張できます。
概要
CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas(CRISPR-associated)システムは、他のゲノム編集ツールとともに、近年のヒトゲノム操作に革命をもたらしました1-7。CRISPR/Cas9システムの主要コンポーネントは、シングルガイドRNA(sgRNA)とCas9です。Cas9は、RNA誘導II型DNAエンドヌクレアーゼです。HNHとRuvCの2つのヌクレアーゼドメインを持ち、これらはプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)7-10に隣接する特定のゲノム領域でDNA二本鎖切断(DSB)を作る役割を担っています。sgRNAは、crRNAとtracrRNAの複合機能を持ち、細菌(化膿連鎖球菌など)と古細菌で同定された2つの適応免疫RNA分子の複合機能を持ち、外因性源のDNA侵入と戦う9-11。適切に設計され、哺乳動物細胞に共導入されると、sgRNAはPAM配列を認識し、標的DNAの相補鎖と塩基対を形成し、Cas9を誘導してトランス活性化し、PAM7のすぐ上流にある両方のDNA鎖で切断します。その後、相同指向性組換え(HDR、標的ベクターの存在下)または非相同末端結合(NHEJ)が起こり、DSBを修復します。cDNA、レポーターカセット、または抗生物質耐性フラグメントなどの導入遺伝子を統合し、トランスジェニックまたはノックインラインを作成することができます。
CRISPR/Cas9システムは非常に効率的で比較的特異的ですが、望ましくないオフターゲット活性が報告されています12-15。オフターゲット事象を最小限に抑えるために、Cas9ニッカーゼ(Cas9n)も設計されています9,10,14,16,17。Cas9n(Cas9 D10AまたはCas9 H840A)は、2つのヌクレアーゼドメインのいずれかに変異を持つCas9酵素であり、DNAの1本鎖にのみニックを誘発します。両方の鎖で切断を達成するために、2つのsgRNAが一対のニッカーゼをガイドするように設計されており、ニッカーゼは2つの異なるDNA鎖の近くの遺伝子座で別々に切断されます。「ダブルニッキング」戦略は、従来のCas9プラットフォームよりも厳格な設計が必要であり、遺伝子編集実験に高い効率と高い特異性の両方を提供します。
この原稿は、CRISPR/Casシステム支援相同組換えを使用して、系統特異的なヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)レポーターを生成するためのプロトコルについて説明しています。CRISPR/Casシステムを介したゲノム編集を用いて神経系統レポーターラインを作製するために必要な成分を取得する手順を、ターゲティングベクターとsgRNAの構築を中心に説明します。このプロトコルは、健康な個人やCNS疾患の患者に由来するものを含む複数のhiPSC系統で成功裏に繰り返されています。当研究室で対象とする遺伝子は、OLIG2、HB9(MNX1)、NEUROG2、SOX1、ALDH1L1、SOD1です。ヒトiPS細胞におけるCRISPR/Casシステムを介した相同組換えによるターゲティング効率は20〜40%の範囲であり、これは以前の報告1,18,19と一致しています。従来の遺伝子ターゲティング実験における一般的な効率が1〜2%であるのに対し、ターゲティング効率は大幅に向上しています。
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プロトコル
1. ターゲットベクトルの設計とベクトル構築
- 系統特異的マーカーが決定されたら、遺伝子のゲノム配列を特定し、それに応じて相同性アームを設計します。5'相同性アームの長さは~1 kb、3'ホモロジーアームの長さは~1.5 kbです(図1)。
- 終止コドンの直前にゲノム配列の下流にレポーターカセットを順次タグ付けし、サブクローニングにより、内在性発現が変化または中断されないようにします。レポーターまたはデュアルレポーターカセットを自己切断2Aペプチド配列(F2A、E2AまたはT2A)20,21、または内部リボソームエントリーサイト(IRES)とリンクします
注:レポーターには、GFP、tdTomato、tagRFP、YFP、ルシフェラーゼ、または蛍光タンパク質と抗生物質耐性カセットを組み合わせた抗生物質耐性カセットなどの蛍光タンパク質が含まれる場合があります。例を図1に示すのは、EGFPおよびネオマイシン耐性カセットでタグ付けされたヒトALDH1L1遺伝子のターゲティングベクターを構築するためのものです。 - レポーターの下流にポジセレクションカセットを追加します。ポジティブ選択は、フロックスされた抗生物質耐性カセットであり、ポジティブクローンが選択されて単離された後、標的 iPSC から切り出されます。
- ネガティブセレクションカセットを3'ホモロジーアームの外側に含めます。一般的なネガティブセレクションカセットは、チミジンキナーゼ、TK、およびジフテリア毒素A(DTA)22です。
- 系統マーカーの配列を含むヒトBACクローンを取得し、PCR増幅によりクローンを確認します。標的部位23を引き下げるために、再結合を使用してpKD46に標的ベクトルを構築する-DH5α。必要に応じて、マルチサイトゲートウェイ、ゴールデンゲート戦略23,24を適用します。
2. CRISPR/Cas9システムのためのsgRNAの設計とベクター構築。
- 報告者になるために対象とする系列固有のマーカーを決定します。NCBIデータベースからcDNA配列をコピーします。ヒトBLAT検索に移動して、ゲノムDNAのアラインメントを取得します。
- 「ブラウザ」タブをクリックして、遺伝子のアセンブリを表示します。「表示」タブで「DNA」をクリックすると、FASTA形式の全ゲノムDNA配列を取得できます。
- DNA配列内の終止コドンの位置を特定し、2A配列とレポーターカセットにタグを付けます。
- 終止コドンのビンシティ(~100 bpの隣接領域)内でプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM、すなわちNGG)を検索します。両方の鎖をスキャンして、適切なNGG配列を見つけます。潜在的なオフターゲットイベントを回避するために、アップストリームシーケンスの特異性を考慮してください。BLAST や CasOT などのオープン ソース ツールを使用します (詳細については、手順 5 を参照してください)。
- NGGのすぐ上流にある20塩基の配列をコピーし、ウェブデザインツールZiFitに貼り付けると、ヒト-gRNA発現ベクター(U6プロモーター付き)MLM3636に適合したオーバーハングを持つオリゴをデザインできます。
- フォワードオリゴとリバースオリゴの両方を合成します 7.
- 二本鎖sgRNAを作製するには、両方のオリゴを70°Cで15分間変性させ、徐々に室温まで冷却します。50 μLの反応液には、それぞれ22.5 μLのフォワードオリゴとリバースオリゴ (ストック濃度は0.1 mM) と5 μLのアニーリングバッファー (100 mM Tris-HCl、10 mM EDTA、1.5 M NaCl、pH 8.0) を加えます。
- ステップ2.7で得られたオリゴを、BsmBI消化したヒト-gRNA発現ベクター(U6プロモーターを含む)MLM3636と混合し、ライゲーションします。20 μlの反応液には、ステップ2.7のオリゴ1 μl、100 ngのMLM3636、および1 μl (400 U)のT4リガーゼを加えます。RT O/Nでインキュベートします。
- ライゲーション産物を用いてDH5αコンピテントセルをライゲーション産物で形質転換し、42°Cで30秒間加熱し、LB寒天アンピシリン(100μg/ml)プレートで細菌を増殖させ、37°C/Nで、メーカーのプロトコルに従ってプラスミドミニプレップ用に3~5コロニーを選びます。プラスミドDNAのシーケンシングを行い、市販のベンダーを使用して確認します。Maxiprepは、メーカーのプロトコルに従って正しいプラスミドを使用してください。
- T7エンドヌクレアーゼ1(T7E1)アッセイによりsgRNAを評価します(詳細はステップ4を参照)。プラスミドとsgRNAを含むトランスフェクションhiPSCは、MLM3636骨格に組み込まれたU6プロモーターの下で発現されます(詳細についてはステップ6を参照)。
3. Cas9n二重ニッカーゼsgRNAの設計と構築
- ダブルニッカーゼCas9n、D10AベクターpX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n(D10A)を取得します。
- 各ターゲティング遺伝子座について、フォワードオリゴとリバースオリゴのペアを設計します。ステップ2で説明したように、NGGのすぐ上流にある20塩基の配列をコピーし、ウェブデザインツールZiFitに貼り付けます
- pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n(D10A)と適合するオーバーハングを持つオリゴを得るには、ZiFitデザインツールで示されるフォワードオリゴとリバースオリゴの両方の最初と最後の塩基を取り除きます。
- フォワードオリゴとリバースオリゴの合成7.これらのオリゴを、ターゲットサイトの片側のPAMの場合はf(n)-F、f(n)-R、ターゲットサイトの反対側のPAMの場合はr(n)-F、r(n)-Rと命名します。これらのうち、nは異なるPAMを指定する番号であり、小文字のfとrはセンス(f)またはアンチセンス(r)ストランドのいずれかでのPAMの位置を表し、FとRはフォワードオリゴとリバースオリゴを表します。
- T7E1アッセイ(ステップ4で詳述)を使用して複数のペア(r5とf2など)を試験し、Cas9nに使用する最適化されたsgRNAのペアを特定します。
- 二本鎖sgRNAを作製するには、両方のオリゴを70°Cで15分間変性させ、徐々に室温まで冷却します。50 μLの反応液には、フォワードオリゴとリバースオリゴをそれぞれ22.5 μLおよびリバースオリゴ (ストック濃度は0.1 mM) と5 μLのアニーリングバッファー (100 mM Tris-HCl、10 mM EDTA、1.5 M NaCl、pH 8.0) を加えます。
- ステップ3.5で得られたオリゴを、BbsI消化pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n(D10A)と混合し、ライゲーションします。20 μlの反応液には、ステップ3.5のsgRNA1 μl、Cas9n(D10A)100 ng、T4リガーゼ1 μl(400 U)を加えます。RT O/Nでインキュベートします。
- ライゲーション産物でDH5αコンピテントセルをライゲーション産物で形質転換し、42°Cで30秒間加熱します。LB寒天アンピシリン(100μg/ml)プレートで細菌を増殖させます。メーカーの指示に従って、プラスミドミニプレップ用に3~5コロニーを選びます。プラスミドDNAのシーケンシングを行い、市販のベンダーを使用して確認します。Maxiprepは、メーカーのプロトコルに従って正しいプラスミドを使用してください。
- T7E1アッセイでsgRNAを評価します(詳細はステップ4を参照)。プラスミドとsgRNAを用いたhiPSCのトランスフェクションは、Cas9n(D10A)骨格に組み込まれたU6プロモーターの下で発現します(詳細はステップ6を参照)。
4. T7エンドヌクレアーゼ1 (T7E1) AssayによるsgRNAの評価
- 24ウェルプレート1枚につき、1日前(-1日目)にウェルあたり2 x 105 293FT細胞をプレート化します。
- トランスフェクションの日(0日目)に、293FT細胞をsgRNAプラスミドおよびCas9発現ベクターと同時トランスフェクションします。0.5 μgのsgRNAベクター、0.5 μgのCas9発現ベクターJDS246(Cas9-003)、および1.5 μlのLipofectamine 2000を添加します。
- ネガティブコントロールの場合は、sgRNAベクターの代わりに0.5 μgのGFP発現ベクター(例:pcDNA3バックボーンのCMVプロモーター駆動GFP)を追加します。
- 72時間後(3日目)に、DNA Quick Extraction Bufferを100 μl加え、精力的にトリチュレートして細胞を回収します。
- 混合物を68°Cで15分間インキュベートし、次いで95°Cで8分間インキュベートします。これは、その後のPCR実験のテンプレートです。
- PAMに隣接する配列を増幅するために、フォワードPCRプライマーとリバースPCRプライマーの両方を設計します。通常、ターゲティングPCR産物の長さは約400〜500 bpです。オリゴを合成する7.
- 50 μl PCR反応の場合、ステップ4.5のテンプレート1 μl、Herculase II0.5 μl、DMSO0.5 μl、5xバッファー10 μl、dNTPミックス0.5 μl、フォワードおよびリバースプライマーミックス1 μlを添加します。
- 次のPCRパラメータを使用します:98°Cで2分間、98°Cで20秒間の35サイクル、20秒間の59°C、1分間の72°Cでの最終延長
注:ここで説明するPCRパラメータは、試験したいくつかの遺伝子に対して特異的な産物をもたらします。ただし、これらの条件は、ユーザーが選択した目的の遺伝子に依存します。ゲノムDNAをテンプレートとして使用するPCRは、多くの場合、余分なバンドが現れないように最適化する必要があります。これらの余分なバンドは、T7E1アッセイ後の切断産物と混同される可能性があります。 - A260の分光計を使用してPCR産物のDNA濃度を測定します。
- 400 ngのPCR産物を2 μlのDigestion buffer 2に加えます。ddH2Oを最終反応容量19 μlまで添加します。沸騰したお湯で5分間インキュベートします。反応をベンチに置き、自然に室温まで冷まします(45〜60分)。
- T7E1 1 μl (10 units/μl) を加え、37 °C で 15 分間インキュベートし、0.25 M EDTA 2 μl と 6x DNA Loading Dye を混合して反応を停止します。
- 2.5 gのアガロース粉末を1xTAE100 mlに溶解します。混合物を電子レンジで加熱し、ジェルボックスにジェルを注ぎます。ゲルが形成されたら、反応液20μl全体を2.5%アガロースゲルにロードします。ゲルを100〜150Vで30分間泳がせます。
- UV光の下でゲルを点検します(図3)。T7E1 は、一致しないサイトで切断します。非相同末端結合を引き起こしたsgRNAの場合、PCR産物は、ネガティブコントロール(ステップ4.3で説明)と比較して、追加の高速移動バンド(サイズが小さい)を示します。
- Image Jソフトウェアを使用してバンド密度を比較することにより、sgRNAの切断効率と挿入および欠失率(インデル%)を推定およびランク付けします。
- ゲル上を泳動する各サンプルについて、ゲルバンドをアンカットバンド、カットバンド1、カットバンド2として指定します。
- ソフトウェアハンドブックに従って、ImageJを使用して各バンドの密度を測定します。
- 次の式を使用してfカットを計算します:fカット=(カットバンド1+カットバンド2)/(カットされていないバンド+カットバンド1+カットバンド2)
- 次の式を使用してIndel%を計算します:Indel=1- √(1-fcut)。
5. 潜在的なオフターゲットサイトのインシリコ予測
注:潜在的なターゲット外サイトは、PerlベースのプログラムであるCasOT17と呼ばれるオンラインオープンソースツールを使用して予測できます。
- Windowsシステムの場合は、CasOTプログラムとヒトゲノムデータベースファイルをローカルハードドライブにダウンロードします。
- デザインしたsgRNAのターゲットファイルをFASTA形式で調製します。
- 「casot」という名前のファイルを開きます。コマンドウィンドウが表示されます。今のところはそのままにしておきます。
- 「opt-generator」という名前のファイルを開いて、オプション文字列を生成します。ターゲットファイルのパスと名前を「-t」または「-target」オプションのダイアログに貼り付けます。
- ゲノム配列ファイルのパスを「-g」または「-genome」オプションのダイアログに貼り付けます。
- -s または -seed (デフォルト値は 2) と -n または -nonseed (デフォルト値は 255) の入力値。オプション文字列が生成され、ページ上部のボックスに表示されます。
- オプション文字列をコピーして、ステップ 5.3.
で説明されている CasOT コマンド ウィンドウに貼り付けます 注:CasOTプログラムの実行には、オプションと使用するコンピューターによっては30〜90分かかる場合があります。完了すると、「--」という名前のフォルダが生成されます。フォルダには、統計を説明する「.stat」ファイルと、詳細な検索結果を含む.csv(カンマ区切り値)ファイルの2つのファイルが含まれます - スプレッドシートプログラムで.csvファイルを開きます。このファイルには、すべてのオフターゲット部位について、染色体およびゲノムの位置、部位の配列、不一致(Mm)タイプ、不一致塩基の総数、およびオフターゲット部位に関連するエクソン情報が提供されます。
- シード配列または非シード配列のいずれかに<2 Mmの部位のPCRプライマーを設計します。
- 以下の条件で選択した陽性ヒトiPS細胞クローンのPCRを、98°Cで2分間、98°Cで20秒間、59°Cで20秒間、72°Cで1分間、最後に72°Cで5分間延長します
注:ここで説明するPCRパラメータは、私たちの研究室で試験されたいくつかの遺伝子に対して特異的な産物をもたらします。ただし、これらの条件は、ユーザーが選択した目的の遺伝子に依存します。ゲノムDNAをテンプレートとして使用するPCRは、多くの場合、余分なバンドが現れないように最適化する必要があります。 - PCR産物のシーケンシング、シーケンシング結果を予測された配列にアラインメントし、変異を検索します。突然変異が存在する場合は、オフターゲットイベントが特定されます。
6. 神経系統レポーターを作るためのhiPSCのエレクトロポレーション
- Geltrexコーティング皿上のTeSR-E8培地でのhiPSCの培養。エレクトロポレーションの2日前に培地をMEF-CM(Mouse embryonic fibroblasts conditioned medium)培地に変更します。2 mLのAccutaseで5分間インキュベートし、細胞を回収します。
- 1 x 107 hiPSC、2.5 μgのsgRNA、2.5 μgのsgRNA、2.5 μgのCas9、50 μgのターゲティングベクターを同時トランスフェクションし、線形化されたターゲティングベクター、Cas9-003発現ベクター、およびsgRNAベクターを用いて、iPS細胞をエレクトロポレートします。ダブルニッカーゼ戦略では、50 μgのターゲティングベクター、各sgRNAの2.5 μg(Cas9nがベクターによって共発現)を追加します。
- 24,25で説明されているように、正と負の選択によってクローンを選択します。
- サザンブロット解析または長距離ゲノムPCR24,25により、陽性クローンを同定します。
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結果
ホモロジーアーム、レポーターカセット、正および負の選択カセットを含む、必要なすべての構成要素を備えたターゲティングベクターを構築します(Figure 1)。内因性のゲノム遺伝子座に基づき、複数の（2〜3種類の）sgRNA（Cas9システムを使用する場合）またはsgRNAペア（Cas9nダブルニッカーゼ戦略を使用する場合）を設計し、ヒトgRNA発現ベクターMLM3636またはpX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n (D10A) バックボーンに構築します(Figure 2)。hiPSCにトランスフェクションする前に、293FT細胞を用いてT7E1アッセイによりsgRNAの評価を行います(Figure 3)。オフターゲット部位の予測を行います。in silico手順（ステップ5）で予測されたオフターゲット部位が少なく、切断効率が中程度（indel%が10-30%）であるsgRNAを用いて、エレクトロポレーションによりhiPSCにトランスフェクションします。トランスフェクションと選択に成功した後、ポ...
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ディスカッション
遺伝子ターゲティングは、遺伝子機能を特徴付ける上で不可欠なツールです。しかし、効率が比較的低いため、労働集約的で時間のかかる作業が必要です。近年、CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas(CRISPR-associated)システムなどのゲノム編集ツールの開発により、ターゲティング効率が大幅に向上しました。この原稿では、CRISPR/Casシステム支援相同組換えを使用して系統特異的ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)レポーターを生成するためのプロトコルについて説明します。Cas9およびCas9nダブルニッカーゼ系の両方のターゲティングベクターとシングルガイドRNAの構築に焦点を当てて、CRISPR/Casシステムを介したゲノム編集を使用して神経系統レポーターラインを作成するために必要なコンポーネントを取得する手順について説明します。
CRISPR/Cas9システムは、hiPS細胞におけるさまざまな遺伝子工学のニーズに応えることができます。ノックアウトおよびノックイン(レポーターなど)系統、誘導性プラットフォーム...
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この研究は、脳神経外科、メモリアル・ヘルマン財団、スタマン・オギルビー基金、ヒューストンのテキサス大学健康科学センターのベンツェン脳卒中センター、ミッションコネクトTIRR財団の支援を受けました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| pStart-K | Addgene | 20346 | |
| pWS-TK6 | Addgene | 20350 | |
| pKD3 | Addgene | 45604 | |
| pKD46 | The Coli Genetic Stock Center, CGSC | 7634 | |
| PGK-neo-bpA sequence | Addgene | 13442 | |
| 標的遺伝子のヒトBACクローン | |||
| JDS246 (Cas9-003)、哺乳類コドン最適化化膿連鎖球菌 Cas9-3X Flag | Addgene | 43861 | |
| MLM3636、U6 プロモーターを含む Human-gRNA-ExpressionVector | Addgene | 43860 | |
| pX335-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9n(D10A) | Addgene | 42335 | |
| sgRNAデザイン、ZiFit | http://zifit.partners.org/ZiFiT/ | ||
| オフターゲット予測ツール CasOT | http://eendb.zfgenetics.org/casot/download.php | ||
| Perl | http://www.perl.org/get.html | ||
| NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ | ||
| BLAT | https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start | ||
| sgRNAプライマー合成 | シグマ | ||
| ワンショット Top10 Electrocomp 大腸菌 コンピテントセル | ライフテクノロジー | ズ C4040-50 | |
| AccuPrime Pfx SupperMix | ライフテクノロジー | ズ 12344-040 | |
| 制限酵素 | NEB and Life Technologies | ||
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Researech | D4007 | |
| DNA Quick Extraction Buffer | 震源地 | QE0905T | |
| Herculase II Fusion DNA ポリメラーゼ | Agilent Technologies | 600675 | |
| Digestion buffer 2 | New England Biolab | ||
| 6X DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R0611 | |
| TeSR-E8 Kit for hESC/hiPSC Maintenance | Stem Cell Technologies | 05940 | |
| UltraPure Agarose | ライフテクノロジーズ | 16500-100 | |
| 50xTAE | ライフテクノロジー | ズ B49 | |
| エッセンシャル 8 ミディアム | ライフテクノロジー | A1517001 | |
| ダルベッコカルシウムとマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水 | ライフテクノロジー | A12856-01 | |
| D-MEM/F12 with Glutamax | ライフテクノロジー | 10565018 | |
| D-MEM with Glutamax | Life Technologies | 10566040 | |
| ウシ胎児血清-ES細胞認定 | ライフテクノロジーズ | 10439 | |
| ノックアウトセラム交換 | ライフテクノロジー | 10828010 | |
| 2-メルカプトエタノール 1000X | ライフテクノロジー | 21985023 | |
| 非必須アミノ酸 | ライフテクノロジー | 11140050 | |
| Stempro Accutase | ライフテクノロジー | ズA1110501 | |
| ディスパーゼ | ライフテクノロジー | ズ 17105-041 | |
| 0.25% トリプシン - EDTA溶液 | ライフテクノロジー | 25200-056 | |
| ゲルトレックス | ライフテクノロジーズ | 12760-013 | |
| ROCK阻害剤Y-27632 | ミリポア | SCM075 | |
| SMC4試薬 | BD | 354357 | |
| ネオマイシン耐性 MEF | ミリポア | PMEF-NL | |
| ハイグロマイシン耐性MEF | ミリポア | PMEF-HL | |
| G418(遺伝学) | LifeTechnologies | 11811 | |
| グロマイシンB | FIAU 10687010 | ライフテクノロジー | |
| (フィアルリジン、1-2-デオキシ-2-フルオロ-ß-D-アラビノフラノシル-5-ヨードウラシル | モラベック生化学品および放射性化学品 | M251 | |
| エレクトロポレーター Gene Pulser Xcell | バイオ・ラッド | ||
| 0.4 cm エレクトロポレーションキュベット | バイオ・ラッド | 165-2088 | |
| DIG-High プライム DNA ラベリングおよび検出スターターキット II | ロシュ | 11585614910 | |
| ハイブリダイゼーション変性ソリューション | VWR | 82021-478 | |
| PCR DIGプローブ合成キット | ロシュ | 11636090910 | |
| DIGウォッシュセット | ロシュ | 11585762001 | |
| 抗ジゴキシゲニン (DIG-AP) | ロシュ | 11093274910 | |
| CSPD 化学発光システム | ロシュ | 11755633001 | |
| DIG洗浄およびブロックバッファーセット | ロシュ | 11585762001 | |
| 50X TAEバッファ | Life Technologies | 24710030 | |
| Blotting buffer (25 mM Tris pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.1% Tween20) | |||
| Hoefer Ultraviolet Crosslinker | フィッシャーサイエンティフィック | 03-500-308 | |
| スペルミジン | フィッシャー | AC13274-0010 | |
| トリスHCl 2M(pH 7.5) | VWR | 200064-506 | |
| デンビルサイエンティフィックブルーバイオフィルム8x10 | フィッシャー | nc9550782 | |
| DNA 分子量マーカー II ( DIG 標識) | ロシュ | 11218590910 | |
| アマシャムブロッティングメンブレン Hybond-N+ | ロシュ | 95038-400 | |
| パイレックスガラス乾燥トレイ | フィ | ッシャー15-242A | |
| キンバリークラークC折りペーパータオル | フィッシャー | 06-666-32B | |
| ワットマン 3MMペーパー(26X41) | フィッシャー | 05-713-336 | |
| ハイブリダイゼーションバッグ | ロシュ | 11666649001 | |
| ハイブリダイゼーションチューブ | フィ | ッシャー13-247-300 | |
| ブリダイゼーションオーブンロティサリーシェイク&スタック | フィッシャー | HBMSOV14110 |
参考文献
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature. 31, 227-229 (2013).
- Friedland, A. E., et al. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system. Nat Methods. , (2013).
- DiCarlo, J. E., et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Res. 41, 4336-4343 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819-823 (2013).
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