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方法論記事

培養HL-1心房筋細胞単層の電圧とカルシウムデュアルチャネル光学マッピング

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DOI:

10.3791/52542

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2015年3月23日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell and Molecular Physiology, Loyola University Chicago, 2Department of Biomedical Engineering, University of Alabama at Birmingham, 3Department of Bioengineering, Clemson University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

この記事では、培養HL-1心房細胞単層でデュアルチャネル光学マッピングを行うために使用される技術について説明します。この独自のプロトコルにより、同じ領域のカルシウム(Ca)活性と電圧(Vm)活性の両方を同時に可視化し、培養単分子膜の電気生理学的特性を詳細に検出および分析することができます。

要約

光学的マッピングは、心臓をエクスビボ無傷で培養筋細胞単層の心臓の電気的活動を検出するための有益な手法であることが証明された。 HL-1細胞は、広く、心臓生理機能の多様な側面を研究するための2次元細胞モデルとして使用されてきた。しかし、それは培養されたHL-1心房細胞単層において同じ視野から同時に光学的にマップカルシウム（Ca）過渡と活動電位に大きな課題となっている。特別な取り扱いや注意が電気的捕獲および光学マッピングすることができる健康な細胞を調製するために必要とされるためである。したがって、我々は、デュアルチャネル光学マッピングのための最適な作業プロトコルを開発した。この原稿では、デュアルチャネル光学マッピング実験を実行する方法を詳細に説明してきた。このプロトコルは、不整脈の開発における活動電位の伝播およびCa動態の理解を高めるための便利なツールです。

概要

ユニークなカルシウム（Ca）と電圧（V m）のデュアルチャネル光マッピング技術1-5は、同時に完全な心と、培養細胞単層の両方でV mとCaの信号を記録するための効率的なツールとして浮上している。この技術は、より良好な心不整脈の基礎となる電気生理学的メカニズムを理解するために、カルシウムトランジェントと活動電位との間の関係についての強力な情報を得ることができる。

培養された細胞単層は、心臓電気生理学および不整脈の基礎となるメカニズムを研究するための有用な細胞モデルであることが判明している。4,6-8 HL-1細胞を、十分に特徴付けられた心房筋細胞培養株である。 HL-1細胞は、成人の心房筋細胞の形態学、電気生理学的、および薬理学的特性を備えて独自に差別化遺伝子型と表現型を維持する。これらの細胞は、importa含む心臓遺伝子やタンパク質を発現心臓のイオンチャネル（ すなわち 、L-およびT型カルシウムチャネル）9と、通常、他の成人心房筋細胞に見出され、我々が以前に報告したサルコメアの収縮タンパク質の成熟アイソフォームのnt 10〜13に加えて、HL-1細胞とすることができる2次元（2-D）筋細胞の単層を形成するために培養。従って、培養されたHL-1を使用することの利点は、単分子層は、1）比較的低いコストと一次新生筋細胞を単離し、培養するよりも、筋細胞培養株を維持しやすくする。 2）細胞のコンフルエントな単層は、心臓の3次元構造に起因する構造の複雑さを低減する。 3）細胞単層は、無傷の中心部に発生した間質性線維症の干渉を排除することができます。これは、線維芽細胞および間質マトリックスの干渉を受けることなく筋のグループの特定の電気生理学的機能を分析するために使用することができる。 CULにおける薬理学的または遺伝子操作から機能的な結果の4）評価tured細胞単層を効果的に達成することができる。したがって、HL-1細胞は筋細胞生理学の多様な側面だけでなく、ペーシング誘発性の異常な電気的活動を研究するために広く使用されている細胞モデルとなっている。外部に反応する13〜16ただし、特別な取り扱いやケアは文化に必要とされる健康的な細胞単層光学マッピング研究のための電気的ペーシング。また、二重の蛍光色素染色手順は、簡単に培養されたコンフルエント細胞単層の完全性を破損する恐れがあります。このように、培養されたHL-1単層で行うのV M / CAデュアルチャネル光学マッピングは、大きな課題となっている。

この方法の目的は、成功して培養されたHL-1単層においてデュアルチャネル光学マッピングを実行するための重要なステップを提供することです。ここでは、HL-1細胞単層の調製、培養細胞単層のデュアルチャネル光学マッピング、マッピングデータ処理のために最適化されたプロトコルに広範囲の詳細を提供している。

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プロトコル

1.溶液の調製

  1. ノルエピネフリン（NP）溶液
    1. 精製されたミリQ（MQ）の水25ミリリットルで30 mMのアスコルビン酸（0.1475グラムのアスコルビン酸の25ミリリットルにNPの40 mgの溶かす。ノルエピネフリン（NP）は、光に敏感であるため、この解決策の準備中に直接光暴露を避ける。
    2. 0.22μmのシリンジフィルターとNPソリューションをフィルタリングします。 -20℃で1ミリリットルの滅菌マイクロチューブやストアにソリューションをアリコート。凍結したら、NPは1ヶ月安定である。
  2. 増補ウォッシュと決勝Claycombメディア
    1. 最終補充しClaycomb培地50mlを作るために100希釈L-グルタミン：ウシ胎児血清（FBS）を5 mlのClaycomb培地および補充43.5 mlのペニシリン/ストレプトマイシン、0.5 mlのNP 1を0.5mlを開始する。 Claycomb媒体は光に敏感であるため、この解決策の準備中に直接光暴露を避ける。
    2. SUPと同じレシピを使用しウォッシュClaycomb媒体を準備除くplemented Claycomb培地は、5％FBSを追加し、NPおよびL-グルタミンのコンポーネントを省略します。
      注：直接光露出せずに4℃で保存した場合補足決勝とウォッシュClaycombメディアは二週間のために良いです。
  3. 大豆トリプシン抑制性ソリューション
    1. カルシウムフリー及びMgフリーのDulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）100ml中の大豆トリプシン阻害剤25mgを溶解する。
    2. 0.22μmのシリンジフィルターを用いて溶液を濾過する。
      注：4℃で保存したときに滅菌溶液1ヶ月間安定である。
  4. ゼラチン/フィブロネクチンディッシュコーティング溶液
    1. 0.02％ゼラチンを作るためにMQ水500ml中にゼラチンを0.1g溶解する。
    2. オートクレーブを、その後0.02％ゼラチン199ミリリットルにフィブロネクチンの1ミリリットルを希釈し、穏やかに混合する。
    3. アリコートを-20℃でゼラチン別々のチューブへの溶液と店の6ミリリットル。
  5. ハンクス塩溶液
    1. 波紋を使用してプレート、MQ水（ミリモル/ L）で、次の塩を溶解、塩化ナトリウム（136.9）、塩化カリウム（5.366）、KH 2 PO 4（0.4409）、のNaH 2 PO 4（0.4000）し、MgSO 4（0.8142）、D-Glcを（5.051）、 炭酸水素ナトリウム（4.162）、HEPES（5.042）、 塩化カルシウム（1.261）。
  6. カルシウム感受性色素（Rhod2）ソリューション
    1. -20℃でRhod2色素ストック溶液およびストアを作るために、DMSO中の20％プルロニックF-127400μlのRhod2乾燥粉末1mgを希釈する。
    2. 実験を開始する前に、最後の作業溶液を作るためにハンクス塩溶液で千：この原液1を希釈する。
  7. 電位感受性色素（Rh237）ソリューション
    1. -20℃のストック溶液およびストアを作成するDMSO 2mlのRh237 5mgを希釈する。実験を開始する前に、最後の作業溶液を作るために千ハンクス塩溶液：原液1を希釈する。

＆＃160。 NOTE：1-4溶液はわずかな変更とClaycomb HL-1細胞培養プロトコルに基づいている。

2.継代培養HL-1心房筋細胞カバースリップ上に

注：HL-1細胞は、Dr Claycomb（ルイジアナ州立大学）から入手することができます。

  1. T25フラスコ中のHL-1細胞を増殖し、毎日補充しClaycomb培地5mlを養う。継代T25中の細胞（後述）Claycomb HL-1細胞培養プロトコール10に従って5日毎フラスコ。
  2. T25フラスコ中の細胞を前に12ウェル培養プレートに置き、ラウンドカバースリップ（直径20mm）の24時間は完全にコンフルエントで継代される準備ができて、その後37℃で一晩、ゼラチン/フィブロネクチンでカバースリップをカバーする。
  3. 翌日、吸引と培養プレートからゼラチン/フィブロネクチンを破棄して、各ウェルの補足最終Claycomb培地の1.5ミリリットルと交換してください。
  4. T25のculturからセルの分割コンフルエント文化を含むT25フラスコから5日目を吸引除去で培地を完全合流に達した後、37℃でPBSで簡単に文化をすすぎ、電子フラスコ。
  5. PBSを吸引除去し、細胞との直接接触を避けるために、T25フラスコの底部に、トリプシン/ EDTAをピペッティングすることにより、37℃で、0.05％トリプシン/ EDTAを3mlを加える。 1分間37℃でインキュベートする。
  6. 吸引により、トリプシン/ EDTAを外し、T25フラスコあたりのトリプシン/ EDTAの別の1.3ミリリットルを追加。 1分間、室温でインキュベートする。顕微鏡下で調べ、細胞がまだフラスコに接続されている場合、完全に残っている細胞を取り除くために、タップします。
  7. 15mlの遠心管にフラスコからの細胞を、転送細胞に大豆トリプシンインヒビター1.3 mlを加え。ウォッシュClaycomb培地5mlで空のフラスコをすすぐ。を15ml遠心管中の細胞にリンスを追加する。 5分間500×gで遠心分離する。
  8. 遠心分離後、上清を静かに再懸濁細胞ペレットを吸引補充した最終Claycomb培地6mlの中。
  9. 細胞継代からの細胞懸濁液0.5mlを12ウェルプレートの各ウェルに播種する。毎日新鮮な増補最終Claycomb培地で細胞を養う。
    注：密接細胞の成長を監視する、一般的に、細胞単層を、4日目にコンフルエント状態に達し、自発的な活動が表示されたまま。その後、培養された単分子層は、一日4-5に光学マッピングのための準備が整います。

細胞へ3.ローディングカルシウムと電位感受性色素

  1. 光学的マッピング研究のために、穏やかに12ウェル細胞培養プレートからカバースリップを除去し、ハンクス塩溶液ですすぐ。
  2. カルシウム感受性色素Rhod2で細胞を染色し、3mlのカバースリップ上の細胞単層をインキュベート酸素で30分間水浴中で37℃でRhod2ワーキング溶液（5％CO 2/95％O 2ガスでバブリング） 。
  3. V mの感受性色素で細胞を染色するために、Rh237は、さらに15分間、水浴中で37℃で酸素Rh237ワーキング溶液3mlにRhod2負荷細胞単層を浸す。

4.デュアルチャネル光マッピング

  1. 倒立蛍光顕微鏡上で循環チャンバ内に、V mおよびカルシウム色素を用いて二重染色で細胞単層を配置する。 35±1℃で細胞チャンバの温度を維持するために加熱された循環システムを使用する。注意深くチャンバーを横切って0.3°Cの勾配を避けるために、チャンバを通って循環流の速度を調整することにより、灌流液の温度を制御する。
    1. V mは / Caの信号を記録する前に、前の染色工程から残存する色素を除去し、約5分間、新鮮なハンクス溶液で細胞単層を洗浄する。
  2. ハンクス塩溶液とSILVを充填したガラスピペットで構成される双極電極を使用してペース健全な細胞単層以前に12,17を説明したように、ピペットチップの周りにコイル状のERワイヤー。
  3. 約1 Mvでペーシング閾値を期待して2ミリ秒の200〜500ミリ秒とパルス幅のサイクル長でのペース健全な細胞単層、。
    注：単層培養の各バッチについて、少なくとも2つの非処理単層細胞バッチの状態をテストするために使用されるべきである。健常対照単層は200〜500ミリ秒のサイクル長で電気的ペーシングによって捕獲することができるはずです。コントロール単層を電気的にペーシングすることができない場合、これは、セル全体のバッチは、光学マッピング実験には適していないことを示唆している。
  4. V m及びカルシウム感受性色素の両方を励起するため、励起フィルター（510ナノメートル/ 40）と、ダイクロイックミラー（561 nm）を用いて結合されたLED光源（波長520nm）を使用する。
    1. VのM成分とCa成分にダイクロイックミラー（594 nm）を持つ40Xの目的とスプリットを介して細胞によって放出される蛍光シグナルを収集します。バンドパスフィルタ（40分の585 nm）を用いてCaチャネルでロングパスフィルター（700 nm）で放出された光とV mのチャネルで放射された光をフィルタリングする。
    2. 2台のCCDカメラ使用して濾過した蛍光光を集める（80×80ピクセル、千FPSを、留年選手イメージング）。
    3. 色素の光退色を避けるために、露光時間を制限するために各視野で2秒未満のための記録を行う。ここでは、典型的には、画像各単層のための4つの異なる領域。

5. V mのデータ処理またはCaレコーディング

  1. V mとCaの信号（80×80ピクセル）の両方について25枚（5×5）の強度値は、バックグラウンドノイズを低減するために、異なる記録時点に一つの強度値に画素を隣接平均。
    NOTE：データ平均化した後、個々の活動電位またはカルシウムトランジェントの各記録時点が16×16を含むデータ行列は強度値を平均化し得（平均化50μmの空間分解能を持つデータ·チャネル）。
  2. 記録されたV mまたはCaの信号の活性化時間（AT）を定義する。
    1. 前述のように、個々の活動電位またはカルシウムトランジェントの起動時間（AT）を定義するために、V mまたはカスタムメイドのMATLABベースのアルゴリズムを使用してCaの信号のピーク振幅の50％の時間を決定する。12
    2. 手動でプログラム解析中に発生する可能性のあるエラーを排除するために分析のATを校正。
    3. マトリックスATに定義店は使用されるソフトウェアで、それぞれ記録活動電位およびカルシウムトランジェントの（16×16は、データチャネルの平均）。
  3. 以前に軽微な変更12,18で説明したようにベクトル場解析法を用いたAT行列に活動電位またはカルシウムトランジェント伝導速度（CV）のベクトルを計算する。
    1. そのデータポイントAT周囲のデータチャネルに対するCVベクトルを算出する（5×。 5隣接）は、MATLABプログラム12,18内で、最小二乗アルゴリズムを使用して）表面AT（活性化時間の滑らかな多項式表面をシミュレートするために、データ·チャネルを平均した。
    2. 以下の式を使用して伝導ベクトルを計算する
      式1：
      figure-protocol-1
      式2：
      θ=逆正接[（dyは/ dTの）/（dxの/ dTの）]
      NOTE：Veのは、x軸とy軸に投影されたCVベクトルである。 dxは/ dTが、x軸におけるCVベクトルの投影である。 dyは/ dTがy軸におけるCVベクトルの投影である。 Tは、AT面である。 xは、yが2-D座標を指す。 T X =∂T/∂Xxに関するTの部分的な誘導体である。 TのY =∂T/∂Yはyに関するTの部分的な誘導体である。 θは、CVベクトルの最後の方向である。
    3. グループコンパス上の10度のセクターをカバーしてそれぞれが36の経路にAT行列のすべてのベクトル、。
    4. 36伝導経路間のCVベクトルの最大の人口を含む経路を選択します。単分子層のCVを表すために、この経路の平均CVを計算します。

ウェーブフロント伝播の6.可視化

  1. MATLABソフトウェアを使用して、そのピーク値に対して異なる記録の時点で、個々の活動電位またはカルシウムトランジェントの信号強度を正規化する。
  2. 一時的に使用MATLABソフトウェアでは16×16強度マトリックスにすべての記録された時点の正規化強度データを格納します。
  3. surf.m関数を使用して各記録時点の記憶された強度マトリックスからの色分けされた強度マップを構築する。
    NOTE：強度マップでは、赤V mまたはCaの信号の高強度を表し、そして青色の蛍光信号の低強度を反映する。
  4. avifile.m機能を使用して.aviファイルを作成します。
  5. すべてのIを保存するaddframe.m関数を使用して活動電位またはカルシウムトランジェントの異なる記録の時点でntensityマップ。
    注：この時点で、V m及びCaの伝播の二つの別々のAVIファイルが生成される。

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結果

ムービー1で示したように培養し、コンフルエントな単層は、通常の本質的なリズムを発揮する。私たちは、その後、完全にコンフルエントHL-1単層でのV M / Caのデュアルチャネル光学マッピングを行った。 図1（a）は、記録されたシングルからV mとCaの信号の例のトレースを示しているビート。デュアルチャネル光学マッピングシステムを使用して均一に伝播V mとCaの信号の代表的な等時性マップは、 図1Bおよび1Cに示されている。均一に伝播活動電位およびカルシウムトランジェントの代表的な時系列画像は、同一のHL-1培養単層から得た。最後に、 映画2と3は、HL-1融合性単層で均一に伝播する活動電位（ 動画2）、カルシウムトランジェント（ 動画3）のアニメーション例を提供する。

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ディスカッション

この記事では、カルシウムや電位感受性蛍光色素で染色した培養されたHL-1心房筋細胞の単層で光学マッピングの重要な側面を説明しています。これは、最適なHL-1細胞単層、マッピング装置のセットアップを培養し、培養単層をマッピングし、データ分析を含む。

成功した培養細胞をマップするには、キーが均一に分布細胞単層を準備することです。カバーガラスの上に細胞を播種すると、細胞を均一に分散させるようにしてください。これらは最高の電気的ペーシングに応答する、いつものように、完全に成長し、完全にコンフルエント細胞単層をマップ。これは、染料のロード中に酸素化細胞を維持することも重要ですが、酸素の泡が、これはカバースリップからそれらを殺すか、外れるおそれがあり、細胞に直接接触しないようにしてください。色素concentratiを増加させながら、色素濃度を低下させ、信号の大きさを減少させ、信号対雑音比を低下させる光の強度を低減オン信号の大きさを増加させるだけでなく、ノイズを増加させる光の強度を高める。したがって、蛍光色素濃度と励起光強度の最適なバランスは、記録信号の信号対雑音比を向上させるために決定されな...

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開示事項

利益相反は宣言されていません。

謝辞

私たちは、HL-1細胞および詳細な保守プロトコルを提供するための博士Claycombに感謝したいと思います。また、当社のデュアルチャネル光学マッピングシステムのためにいくつかのアクセサリーを作るとの彼の援助のための細胞の映画氏とピートキャロンを生成するとの支援のため女史エレナカリージョと博士セスRobiaに感謝したいと思います。

この作品は、（XAに10GRNT3770030＆12GRNT12050478）米国心臓協会、国立衛生研究所（XAにHL113640）、及び（XA）のロヨラ大学の研究開発基金によってサポートされていました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Rhod2 乾燥粉末AAT Bioquest21062
多元的AAT Bioquest20050
DMSOSigma276855
Rh237InvitrogenS-1109
NaClSigmaS7653
KClSigmaP3911
KH2PO4シグマP0662
NaH<サブ>2PO<サブ>4シグマS9638
MgSO<サブ>4シグマM7506
D-グルコースシグマG8270
NaHCO<サブ>3シグマS6014
CaCl<サブ>2シグマC3881
HEPEsSigmaH3375

参考文献

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