造血細胞の自動定量化 - 脱灰骨の組織学的画像における間質細胞の相互作用

サマリー

骨髄の組織学的データを定量的に分析する戦略が提示されます。組織切片中の蛍光標識細胞の共焦点顕微鏡検査により、2次元画像が得られ、自動的に解析されます。異なる細胞タイプの共局在解析をシミュレーション画像からのデータと比較し、細胞相互作用に関する定量的な情報を提供します。

要約

共焦点顕微鏡は、骨髄のような複雑な組織内の複数の細胞型の局在の分析のために選択される方法である。多くの場合、それは、このように評価者に依存するバイアスを導入し者間信頼性を低下させる危険性を有する、手動カウントに依存しているしかし、細胞局在の分析及び定量化は困難である。また、細胞型は、それらの出現頻度に強く異なる場合は特に、ランダムな位置からの二つのセルの結果の間の共局在するかどうかを判断することはしばしば困難である。ここでは、骨髄中の細胞の共局在の公平な定量化するための方法が導入される。プロトコルは、骨髄を​​含む全マウスの長骨の組織学的切片を得るために使用される試料調製、ならびに染色プロトコルと高解像度画像の取得を記載している。造血細胞および非ヘマトの認識及ぶ分析のワークフローこれらの細胞間の直接的なコンタクトの定量に2次元（2D）骨髄画像におけるopoietic細胞型が提示される。これはまた、特定の細胞型を、周囲の細胞微小環境に関する情報を取得するために、近傍分析を含む。 2つの細胞型の共局在は、ランダムセル測位の単なる結果であるか、または細胞間の優先的な関連性を反映しているかどうかを評価するために、造血ならびに間質細胞の場合には、この仮説をテストするのに適したシミュレーションツールは、ある使用。このアプローチは、骨髄に限定されず、組織学的データの再現性のある、定量的な分析を可能にする他の組織にも拡張することができる。

概要

、光学イメージングを含む顕微鏡における近年の急速な技術開発、に、全組織のコンテキスト内の細胞の解析は、免疫学者のためにますますアクセス可能となっています。懸濁液中の単一細胞の特徴は、細胞および分子の機能を理解するための貴重な不可欠な方法を表す。しかし、それらの（マイクロ）-anatomical環境内の細胞の解析は、免疫応答の発生のような複雑なプロセスに協力種々の細胞型の間の相互作用を理解するために不可欠である。

顕微鏡研究は、画像から定性的な情報を取得することが比較的容易であるが、それは部分的にはこの分野での分析方法は、画像取得が可能であるものと比較して遅れているという事実のために、これらのデータを定量化するための課題である。多くの研究者は、まだ、時間がかかり、その組織学的画像におけるマニュアル細胞計数を頼るしたがって、異なる評価者の間でバイアスを導入し、他のグループによって複製を妨げる。多くの場合、1代表画像は、それがハード読者はこのようなイベントの統計的関連性を判断できるようにすること、出版物における細胞の位置や共局在に関する声明を下線に選択される。

一緒にされた画像データの完全な情報内容はほとんど利用されないという事実と、この組織学的画像を分析するためのより公平な、迅速かつ包括的アプローチの必要性を強調している。

骨髄は、大人の脊椎動物の造血器官として重要な生体機能にかかる複雑な組織である。造血細胞^1,2-ための出生地であるとBリンパ球の発達³に重要な役割を果たしている他に、免疫反応は^4を開始し、成熟した、循環B細胞^5をサポートしているサイトとして作用する。私の維持に加えて、その役割免疫記憶を構成する細胞のいくつかの種類が存在^6-9存在することが判明しているようにmmunologicalメモリは、ますます10年間で明らかになり、理解されている。

骨髄およびその機能の複雑な組織構造との関係は依然としてとらえどころのないままである。そのようなTおよびB細胞のゾーンとしてマクロ区画に編成されて二次リンパ器官とは異なり、骨髄をクリアマクロ区画を欠いている。これまでのところ、骨髄中の個別のコンパートメントは、骨皮質に、または血管系への近接によって定義されています。そのような幹細胞を支持するようなプロセスの数の骨髄中の様々な常駐間質細胞集団の重要性は、そのような長命形質細胞（パソコン）などの免疫記憶細胞集団（CD4 ⁺のB細胞またはメンテナンスの開発およびCD8 ⁺メモリーT細胞）は、明らかに、骨髄中の微小区画のある程度があることを示している。

これらの観​​察は、骨髄中の（様々な段階での細胞の維持、B細胞の発達の幹、および免疫記憶の維持）特定の機能に特化して別個の微細解剖ニッチの概念をもたらした。異なる機能を果たすニッチ間の異質性のある程度があるように思われるが、そのようなCXCケモカインリガンド12（CXCL12）またはインターロイキン7（IL-7）、などの間質細胞によって産生される因子のいくつかはのための決定的な要素であるこれらのニッチ¹⁰のいくつか。骨髄間質細胞の可視化および特徴付けにより、細長い樹状骨髄全体ネットワークを形成する拡張機能、および間質亜集団を区別するための適切なマーカーの欠如との形態学的特徴のために困難である。

これらのニッチは、それらの細胞および分子は複合に対する共通の特徴を共有してどの程度としてはまだ明らかではないn、および要素は、特定のニッチが一意レンダリング。間質細胞に加えて、造血細胞型は、ニッチのいくつかについて、少なくとも特定の信号を提供することによって、重要な役割を果たすことが示されている。明らかに、ニッチ組成の複雑さは、 その場でそれらの分析を必要とし、免疫学者や血液学者がその細胞成分間の空間的関係を分析することによって、例えば 、骨髄マイクロアーキテクチャにズームインすることがますます重要になってきた。

ここでは、自動化された公平な方法で、骨髄における細胞の共局在及び近隣関係を定量化するための戦略が提示されている。蛍光性の間質細胞及び非蛍光造血細胞を保有するキメラマウスの生成を含むワークフローの詳細、脱灰骨からの組織切片の調製、骨全体を覆って共焦点画像の取得、並びに携帯cは自動画像解析O-ローカライズおよびシミュレーションツールによってランダムポジショニングからの検証/差別が（ 図8）が設けられている。

プロトコル

動物実験は動物福祉（LandesamtエリーゼGesundheitウントSoziales、ベルリン）のための適切な状態委員会によって承認された、現在のガイドラインと規則（動物実験のライセンスG0194 / 11）に従って行った。

蛍光骨髄キメラマウスの1世代

注^：9の前に説明したように、骨髄間質細胞を可視化する蛍光骨髄キメラマウスの作製が行われる。

1. デル-Creリコンビナーゼを治療開始照射のためにそれらを準備する（マウスは^11-13遍在タンデム赤色蛍光タンパク質（tdRFP）を発現する）ROSA-tdRFPマウスxは。また、蛍光タンパク質の遍在的な発現を持つ他の菌株を使用しています。二日照射前の飲料水を介してネオマイシン1mg / mlのビタミンの1 mg / mlの（A、D3、E、C）を投与する。
2. セシウム137ガンマ照射wiは3.8グレイで二回マウスに照射3時間の間隔薄い。このために、それぞれの照射に適した照射パイケージにマウスを置く。
   注：マウスの​​照射には、私たちの研究所は麻酔を必要としません。照射のための麻酔に関する現地機関の方針に従ってください。痛みの兆候がある場合、照射後の一日あたりのカルプロフェン皮下（SC）の5 mg / kgを持つ動物を扱う。
3. 翌日、転送バッファ⁹におけるC57BL / 6ドナーマウスの長骨から調製した3×10 ⁶個の骨髄細胞を静脈内注射によりマウスを再構成する。最大2週間ネオマイシン上のマウスとビタミンを維持し、この時間の間に彼らの幸福と重量を監視します。特定の実験的治療（ 例えば 、予防接種^）9を開始する前に、免疫系の再構成を可能にするために、少なくとも4週間待つ。
4. マウスを犠牲にし、解剖ボードの上に置き、70％エタノールで足を殺菌する。 Euthaniz現地機関の方針に従って、電子マウス。私たちの研究所は頸椎脱臼を行います。
5. 太ももから皮膚を除去するために鉗子とハサミを使用してください。大腿骨を露出させるために筋肉組織を削除します。鉗子やハサミを使って、股関節と膝関節から大腿骨をLuxate。骨を壊すか切らないように注意してください。
6. 慎重にはさみを使用して骨から筋肉組織および軟骨の残りの大部分を削除する。実験室のティッシュペーパーで骨を擦ることによって、残りの筋肉組織を削除します。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いてペトリ皿中で洗浄骨を集める。
7. 6時間 - 4 4％パラホルムアルデヒド（PFA、電子顕微鏡グレード）で全体の大腿骨を固定してください。
8. PFAを捨て、PBS O / Nが10％スクロース中骨をインキュベートする。次の日は、20％のスクロースO / Nで骨をインキュベートする。翌日は、30％ショ糖のO / Nで骨をインキュベートする。

骨の2.凍結切片化

注：1の後6 - 30％スクロース中24時間、骨を凍結し、川本のテープ法^14,15に応じて、それらを凍結切片。

1. ドライアイスとアセトンとの大きなビーカー（2000ミリリットルの体積）を調製し（約2：1の体積比が、 例えば、ドライアイスを400mlとアセトン200ml）ヒュームフードの下で。 （ - 約50ミリリットル30）内部のヘキサンで - （250mlのボリューム150）小さなビーカーを置きます。 （霜が大きなビーカーの外側に表示されるまで、約10分）を冷却するためにミックスのを待ちます。
2. スーパーCryoembeddingミディアム（SCEM）で標識クリオモールドの3/4を埋める。彼らは完全に彼らは金型のエッジに触れないように注意しながら、浸漬されるまで、慎重に内部の骨を置く。大鉗子でちょうどヘキサンの表面に接触型の底とビーカーにクリオモールドを保持する。
   1. SCEM凍結の外縁をしましょう​​（不透明で示され、これは約15秒かかります）。その後、完全にヘキサン中に金型をドロップし、FRE、それを聞かせて2分 - 1エズ。凍結試料を取り出し、セロハンに包んで、その後アルミ箔（乾燥からサンプルを保護し、光への暴露をさけるため）。凍結切片まで-80℃で保存。
3. 大腿骨の凍結切片のための硬組織のための標準的なミクロトームとミクロトームの刃を使用しています。
4. -24°Cにミクロトームのサンプルとブレードの温度を設定します。サンプルは切断前の約15分間ミクロトームの内側に座ってみましょう。
   1. SCEMまたは最適な切削温度（OCT）中で金属試料ホルダーにサンプルブロックを修正。必要に応じてブロックの向きを調整します。骨が完全に開放され、骨髄が表示されるまで、サンプルをトリミング。 7μmの切片厚を（最初のセクションを破棄）を調整します。
   2. 鹿革で覆われた木製のヘラを使ってサンプルブロックの上に粘着面と川本テープの一部を修正しました。その後、サンプルを切断し、部分になるようにテープを回し上側に位置する。鉗子を用いてスライドガラスにテープを転送します。スコッチテープでスライドガラスにテープを固定します。
5. の項では、少なくとも30分間乾燥させますと使用まで-80℃で保管してください。彼らは一緒に固執することを避けるために、単一のスライド間のスペーサーを有するプラスチック製のスライドボックス内の未染色とアンマウントさスライドを保管してください。染色し、マウントされたスライドを4℃で一週間までの段ボールスライドフォルダを保存することができる。

3.画像コレクション

1. 一般的な免疫蛍光プロトコル⁹に応じて解凍し、染色凍結切片。核染色を含み、 例えば、4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸（DAPI）組織の完全性を視覚化する。
   注：染色は、例えば、RFP用の間質細胞（抗RFPビオチン抗体およびストレプトアビジン - アレクサフルオロ555）、ラット抗主要塩基性タンパク質（MBP）抗体および抗ラットアレクサフルオロ647抗体による染色、好酸球を可視化する、B細胞ラット抗B220-アレクサフルオロ594抗体および抗κ軽鎖、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）および抗λ1軽鎖-FITC抗体でのPCで（染色手順の詳細は⁹に記載されている）。
2. 染色した切片をマウントします。セクションにfluoromountの一滴を配置し、慎重に、気泡の形成を回避しながら、＃1ガラスカバースリップでカバーしています。その後、染色に適したレーザーラインを装備した機器とレーザー走査共焦点顕微鏡を行う。
3. Wimasisツールを使用して、間質細胞と骨髄の造血細胞の自動化された共局在化分析のための画像を記録するために、以下の設定を適用する。
   1. 20X対物レンズと708.15 X 708.15程度の視野を使用してください。自動分析のために、比較可能な結果を​​維持するために2048のx 2048ピクセル（ピクセル）で整合性のすべての画像のサイズを維持する。
   2. 間質構造のためのレコードの1チャネル（ 例えば、 561 nmのレーザーライン）、1原子核のためのチャネル（ 例えば、DAPI、405 nm）であり、追加の関心の造血細胞のためのチャネル（ 例えば、3チャネル、好酸球、B細胞およびPC用488/594/633 nm）を。
   3. 4 ^16を平均ラインを使用して、レコードの画像が。理想的には、単一の隣接する画像を撮影することにより全体の大腿骨部分をカバーしています。代替的に、骨髄（骨幹部ならびに骨端）の様々な領域からの非隣接の写真を撮る。
      注：（重なる領域内のセルの繰り返し分析を避けるために）隣接した画像間のオーバーラップを生成しないように注意してください。
4. 顕微鏡画像のファイル形式で画像を保存します。確認し、必要に応じて、画像ビューア/解析ソフトウェアの全チャネルのコントラストを調整。
5. 画像ファイルごとにエクスポート3 .jpgファイル：DAPIチャンネル（赤/緑/青（RGB）形式、黄色でコード化された偽色）のための1 .jpgファイル、間質チャネル（グレースケール）のための1 .jpgファイルと1 .JPG含むファイル造血細胞のためのチャネル（3チャネルの最大、RGBフォーマット、 例えば、FITC（パソコン、偽色：緑）/アレクサフルオロ594（B細胞、偽色：青）/アレクサフルオロ647（好酸球、偽色：赤）） 。

4.自動画像解析

1. 画像分割、共局在し、近傍分析（説明を参照）の定量化を行うために画像解析ツールを使用します。
2. Wimasisツールを使用している場合は、以下の手順に従ってください
   1. 下線と画像の種類を示す番号が続き、同じファイル名で画像あたり3 .jpgファイルのセットをアップロードします。
   2. 造血細胞との.jpgファイル用_1を使用して、間質チャネルのための.jpgファイルのためのDAPIチャネル、_3ための.jpgファイル用_2。たとえば、次のようにImage1_1.jpg（造血細胞）、Image1_2.jpg（DAPIチャネル）、およびImage1_3.jpg（間質チャネル）。顧客口座を経由して画像をアップロードします。
   3. セルコンタクト定量化のためにそれぞれのフィールドをクリックして、セルコンタクトツールを選択します。細胞周辺の定量化のために、細胞周辺ツールを選択し、（細胞のエッジから測定される）程度で優先近傍半径を入力してください。
   4. 結果をダウンロードします。
      注：検出された物体の境界と造血細胞と間質チャネルを示す.jpgファイルが強調されているような結果が提供され、同様にその要約.csvファイルに加えて、すべての画像のための測定を含む単一の.csvファイル、すべてのアップロードされた画像のデータが含まれています。
3. 接触測定から例は代表的な結果に示されている（間質細胞と接触して造血細胞（赤色、緑色、または青色細胞）の頻度を決定する、または、赤色、緑色、または青色の細胞の頻度は、他の造血細胞型を接触させること図4）。周波数を決定するために、することにより、画像当たりの所定の接触数を分割総細胞は、画像ごとにカウントします。
   1. 個々のマウスを用いた実験のために、単一のマウスのすべての画像の全接触数を合計し、全ての画像の総細胞数の和でそれらを分割する。
4. 近傍の測定値から、ステップ4.3に記載のように（他の造血細胞型への間質細胞および/または好適な近傍に、赤色、緑色または青色細胞の周波数から選択された距離内に赤、緑、青の細胞の頻度を決定する代表的な結果、 図4）も参照。

ランダム骨髄ポジショニング5.シミュレーション

1. 分析した骨髄組織学的画像にランダムセルの位置のシミュレーションを実行する前に、事前に以下のファイルを準備します。セルコンタクトツール、DAPIチャネル用のオリジナルの.jpgファイルとオリジナルの.jpgファイルによって提供される単一の.csvファイルを間質チャンネルに対する。
2. 実行するために一連の画像上のバッチシミュレーションは（ 例えば、1大腿部からのすべての画像）は、1フォルダ内のすべての元の.jpgファイル（_1、_2と_3）と対応する単一の.csvファイルを収集。
   注：ランダム骨髄細胞の位置決めのためのシミュレーションツールは、リクエストに応じて入手可能です。
3. 、シミュレーションツールを起動]チェックボックスを「自動ロード·画像データ」。
   注：プログラムは、.csvファイルから細胞数と平均セルサイズを自動的に読み込みます。これらの値は、「セル番号」と「セルサイズAVG」（ 図5A）のチェックボックスに表示される。
4. .CSVファイル、 すなわち、名前に共通因子に共通のタグを入力します。バッチモードのシミュレーションに使用されるべき画像セットの数を入力する。
5. （ファイル名のエンディング_3付き）間質チャネルから生成された.jpgファイルをロードします。
6. DAPIチャンネルからマスクを生成するための設定を入力します。
   1. "チェックボックスをオンにしますマスクの適用」10（範囲0から255）にバイナリマスクにDAPI画像を変換するためのしきい値を設定します？。
   2. ボックスにチェックを入れ「膨らませる？」「？8ビットの「ボックスをチェックし、5 PXに拡張のグレードを設定。 「浸食/ wの？」チェックボックスをオンにします。
   3. シミュレートされた画像の解析に使用する周辺半径（近傍半径）のために必要な値を入力します。 2048 X 2048、PX（ピクセルスケーリングXY：0.346ミクロン）のサイズが708.15 X 708.15以下の画像の場合は、29 PXは、10μmに相当する。
7. ボックスにチェックを入れ「大津を使用しますか？ "間質構造の自動検出のために大津のアルゴリズム^17を使用する。
   注：これは、接触および周辺ツールで使用されているのと同じアルゴリズムです。記録された画像とシミュレートされた画像の自動解析に同じ画像分割アルゴリズムを使用すると、比較可能なデータを維持するために重要である。
8. 造血細胞のための設定を入力し、そのAReは、円形としてシミュレート。
   注：赤、緑、青のセルのセル番号を直接CSVファイルからロードされる（また、5.6のステップを参照）。
   1. 赤、緑、青のセルのピクセルの平均直径を計算するシミュレーションツールを使用する。画像あたりの総細胞数で割ったPXにおける画像の各細胞型の総面積として単一のセルの平均面積を決定します。式を使用して、ディスクの半径を計算するために平均的な領域を使用します。平均直径を決定するために半径を倍増。
9. オブジェクトセグメンテーション機能を含む任意の画像解析ソフトウェアを使用して分析した細胞型のセルサイズ分布を測定する。すべての造血細胞型^（18及び図5B）のためのσを決定します。
   注：記録された細胞の細胞サイズ分布は、自動画像解析により決定されていないので、実際の分布の近似としてガウス分布を使用する。 Tの幅彼分布曲線は、σによって記述され、種々の細胞型のために非常に異なることができる。 （詳細は、 図5（b）参照 ）。
   1. 静止画像解析ツールによって完全な細胞として認識され、最小のオブジェクトを記述するピクセルの直径：これらの測定から、「セルサイズカットオフ」を決定する。
10. グラフィカル·ユーザ·インタフェース（ 図5（a））上のそれぞれのボックスにパラメータを入力します。
    1. PXで直径として、セルサイズカットオフ、 すなわち、シミュレーションで許容される最小セルサイズを入力します。
    2. （ステップ5.9）から、赤、緑、青のセルのセルサイズ分布のシミュレーションのためのピクセルでσを入力する。
    3. サブセクション「マスク内の細胞」の「削除」チェックボックスをオンにします。それはマスクの無行くエリアで少なくとも一つの画素と重なっている場合は、この設定では、プログラムは、セルの新しい位置を選択しましたします。セルオーバーラップを避ける」チェックボックスをオンにします？̶1;サブセクションの「セルの除外」。
    4. PXで2つのセルの中心間の最小許容距離を入力します。
       注：最小距離が記録された画像から決定される必要がある。誤って測定された最小距離が記録され、シミュレートされた画像の比較のための偏った/人工結果につながる。
    5. オーバーラップは中心から中心までの最小距離によって定義されている場合は100％にオーバーラップの最大面積を設定します。
    6. 千回繰り返しシミュレーションツールを設定します。
    7. ボックス「自動保存細胞を？」チェック.rectファイル（テキスト形式）などのバッチの各画像のすべての繰り返しのためにシミュレートされたオブジェクトの座標を保存します。ボックス「自動保存·イメージ？」それぞれのシミュレートされた画像のための.TIFFファイルを保存するを確認してください。保存されたファイルのための共通のタグを入力します。
       注： "自動保存細胞」オプションは、実際のシミュレートされたimaのを保存する場合に比べて、シミュレーション実行時間と全体のデータサイズを削減GES。 .rectファイルが長方形としてシミュレートされたセルの座標を保存し、必要に応じてこのようにシミュレーション画像に変換することができる。
11. 「ファイル名を指定して実行シミュレーション」をクリックしてシミュレーションを開始します。
    注：シミュレーションツールは、自動的に繰り返しシミュレーションのあらゆるセットについて、赤、緑、青、および間質細胞と、赤色、緑色および青色の細胞について平均接触回数付近数を含むすべての画像1000のシミュレーションのためのCSVファイルを生成する。さらに、すべてのこれらの値、標準偏差（STD）及び平均の標準誤差（SEM）1,000シミュレーションの平均値が提供される。
12. 千シミュレーション画像の1セットの平均接触頻度付近の周波数を決定する。このために、画像ごとに記録された細胞数によって平均接触付近のカウントを分割します。記録画像の自動化された共局在解析の結果に周波数を比較してください。
13. 適切なstatiが適用解析¹⁹に応じてstical方法は（ 図7のために、我々は、両側ウィルコクソンの順位検定を締結し使用した）。

結果

カワモトテープ法で脱灰骨の凍結切片を切断し骨幹ならびにそれらと骨端領域の両方で、まだ石灰化した骨に取り付けられた内膜領域の骨髄を、骨全体が完全な部分として切断することができ骨梁の高密度（ 図1）。切片の核染色は、調製物中の小さな亀裂を完全に回避することはできないが、正弦波と動脈の構造ならびに実質の網状ネットワークがそのままとどまることがわかる。

赤色蛍光キメラ骨髄およびその後の分析の免疫蛍光染色の例としては、好酸球（主要塩基性タンパク質、MBP）、パソコン（κおよびλ軽鎖）およびB細胞（B220）の染色が示されている。マウスは、ミョウバンIPでチキンγグロブリン（NP-CGG）に結合された100μgの4-ヒドロキシ-3-ニトロフェニルハプテン、4週間後で免疫化した再構成は、21日後に、PBS IVにNP-CGG50μgのでブーストとブーストの後30日目に分析した。自動画像解析には、網状のプロセスの非常に小さな断片を含む、間質構造の非常に正確な認識をもたらした。間質細胞の細胞数は、ここで提示システムを用いて決定することができないので、画像中のすべての...

ディスカッション

現代の光学イメージング法の進歩にもかかわらず、組織学的データの分析は、依然として多くの場合、適切な定量化ツールおよび方法の欠如によって、または関心対象の小領域に集中偏った分析によって妨げられる。ここに提示相乗的なアプローチは、全体の骨髄領域を覆う画像解析を組み合わせた自動セグメンテーションおよび様々な造血細胞および間質細胞型、共局在化分析、新しいお客が提供する非ランダムに発生コンタクトの最後に検証ツールの物体認識設計されたシミュレーションソフトウェア。

骨髄を含む全体の骨の組織学に起因つのセクションに存在する様々な組織の密度に実行することが困難であった - 一方では非常に難しい、石灰化した骨、一方で簡単にカット中断されます非常に壊れやすい骨髄、一緒に骨と。代替的に、骨切片のプリアンプを切断するためのテープ法として取得済みのは、ここ^14,15は 、それによって無傷（ 図1）内膜領域を残して、組織を安定化させるという利点を有する。骨芽細胞が豊富であることに加えて、これらの領域は、幹細胞の維持²⁰において役割を...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ネオマイシン	Sigma	N6386 SIGMA	ネオマイシン三硫酸塩水和物、EUハザードコード:GHS08
Ursovit AD3EC	Serumwerke Bernburg		1 mlに含まれるもの:50.000 I.E.パルミチン酸レチニル、5.000 I.E.コレカルシフェロール、30 mg酢酸トコフェロール、100 mgアスコルビン酸、1 mgソルビン酸、200 mgポリオキシル35ヒマシ油、0.5 mg没食子酸プロピル
転写バッファー (100 ml PBS、1 ml 1 M HEPES、50 U/ml ペニシリン/ストレプトマイシン)	Sigma	P4333, H3375
4-ヒドロキシ-3-ニトロフェニルアセチルハプテンをチキンガンマグロブリン
チキンガンマグロブリン (CGG) 100 mg	Rockland	D602-0100
20% パラホルムアルデヒド溶液 (EM グレード)	Science Services	15713	EU ハザード コード: GHS02、GHS05、GHS07、GHS08
D(+)-sucrose	Carl Roth	4621.1
ドライアイス
アセトン	シグマ・アルドリッチ	179124 SIGMA-ALDRICH	EU危険コード:GHS02、GHS07
Hexane	Sigma-Aldrich	208752 SIGMA-ALDRICH	EU危険コード:GHS02、GHS07、GHS08、GHS09
Tissue-Tekクライオモールド(標準)	さくら	4557	25 x 20 x 5 mm
ティッシュテック O.C.T.	さくら	4583
川本先生のSCEM埋め込み媒体	Section-Lab, JP
川本先生のクライオ切片調製キット	Section-Lab, JP
川本 クライオフィルム 2C(9)	Section-Lab, JP
Microtome blade MX35 premier plus, low profile	Thermo Scientific	3052835	L x W: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13"), 厚さ: 0.25 mm (0.01")
ポリクローナルウサギ抗RFP抗体、ビオチン化	Rockland	600-406-379
Alexa Fluor 555 streptavidin	Life技術	S-32355
抗MBP	J.とN.リー		から入手可能:J.とN.リー、メイヨークリニック、スコッツデール、アリゾナ州、米国、クローンMT-14.7
ヤギ反ラット-アレクサフロー647	ライフテクノロジー	ズA-21247
ラット抗B220 - アレクサフロー594			自社で製造および結合された(DRFZ)、クローンRA3.6B2、Life TechnologiesのAlexa Fluor 594
抗l1軽鎖-FITC			製造および結合社内(DRFZ)、クローンLS136
Rat抗k軽鎖-FITC			製造および結合社内(DRFZ)、クローン187.1
DAPI(4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩)	シグマ	D9542 SIGMA
蛍光封入媒体	DAKO	S3023
カバースリップ (24 x 24 x 0.13-0.16 mm)	Carl Roth	H875.2
Superfrost スライドグラス (75 x 25 mm)	VWR	48311-703
レーザー走査型共焦点顕微鏡			。Zeiss LSM710とZen 2010バージョン6.0のソフトウェアを使用しました。
	の自動画像解析ツール		接触ツールと細胞近傍ツールは、ご要望に応じてWimasisから提供されます。
VC2012 ランタイム	Microsoft		無料ダウンロード
シミュレーション ランダム セル ポジショニング			に応じて、
画像セグメンテーション機能を備えた			画像解析ソフトウェア骨髄中の造血細胞型の細胞サイズ分布を測定するために、Volocity(Perkin Elmer)を使用しました(図5)。代替案は、Definiens Image Analysis(Definiens)またはCell Profiler(無料ダウンロード)
フィジー画像解析ソフトウェア			無料ダウンロード.フィジーは、手動細胞カウント(図3)のために訓練を受けた評価者によって使用されました。