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方法論記事

マウスモデルにおける組織工学血管の生成とグラフト

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DOI:

10.3791/52565

⸱

2015年3月18日

 ,  ,  ,  , 
1Cardiovascular Division, King's College London BHF Centre

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、二重播種部分的人工多能性幹細胞がマウスにグラフトするための機能的な組織工学血管移植片を生成するためのプロトコルを提示する（PiPSC）は - 脱細胞化血管足場バイオリアクターに由来内皮細胞 - 平滑筋細胞およびPiPSC由来。

要約

血管導管の建設は、心血管疾患に起因する損傷した血管の外科的修復のための基本的な戦略です。現在のプロトコルは、ヒト線維芽細胞由来の部分人工多能性幹細胞(PiPSC)を使用して機能組織改変血管グラフトを作製できる効率的で再現性の高い戦略を示しています。私たちは、マウスに移植する前にPiPSC内皮細胞または平滑筋細胞を播種するために、天然血管内に存在するマトリックスタンパク質構造と血流を厳密に模倣した脱細胞化血管足場バイオリアクターを設計しました。このアプローチは、PiPSC由来移植片を生着させた免疫不全マウスが、手術後3週間で生存率が著しく増加したため、有利であることが実証されました。このプロトコルは、近い将来、再生医療、組織工学、および患者固有の細胞治療のための貴重なツールとなります。

概要

血管導管の建設は、心血管疾患に起因する破損して負傷した血管の外科的修復のための基本的な戦略である。 、同種移植片、自家組織（心膜または伏在静脈）と移植片1、今日まで、外科手術で使用される移植片材料は、生体適合性の合成ポリマー（ポリエチレンテレフタレート[ダクロン】ポ ​​リテトラフルオロエチレン[テフロン（登録商標）]、延伸ポリテトラフルオロエチレン[ゴアテックスのePTFE]）を含む。人工移植片（ 例えば、ゴアテックスおよびダクロン）が最も一般的に使用されている一方で、これらの材料は、おそらく狭窄症、カルシウム沈着、血栓、塞栓および感染を含む多数の短期および長期の合併症を引き起こす。本生物学的な移植片を有する患者は血栓塞栓事象を減少したが、彼 ​​らはまだ石灰化の劣化2のためにこのような二次移植の失敗と短縮耐久性などの制限が発生した。したがって、外科トンの大幅な改善にもかかわらず年間のechniquesは、研究者や臨床医は、まだ血管疾患のための理想的なコンジットを識別するための必要性を抱えている。さらに最近では、血管組織工学の研究分野は、細胞が正常な移植の1のための機能的血管を具現化するバイオミメティック環境を作ることを目的に、生分解性足場に組み込まれている概念を生成した。基本的に、血管の構築体の成功は3必須成分に依存。足場を含む細胞、 すなわち、内皮細胞の内層と、平滑筋細胞層、天然の血管系に匹敵する機械的特性を提供するために適切な細胞外マトリックスを含有する足場、および開始/調節するために必要とされる分子/細胞シグナル修理。

長期グラフト開存とネオ·組織の持続的な発展は、番目の足場の効果的な細胞播種に大きく依存しているereby決定的な重要性の細胞型の決定をレンダリングする。いくつかの報告は、小径導管3-6を開発するためにさまざまなソースから成熟内皮および平滑筋細胞の使用を実証する。有望であるが、成熟した内皮細胞および平滑筋細胞を得るのに十分な自家血管の欠如は、大きな負担残る。より最近では、様々な供給源からの幹細胞は、血管組織工学用途のために開発されてきた。実際には、胚性幹細胞7を含む幹細胞型の多様な、誘導多能性幹細胞（iPS細胞）8,9、PiPSC 10,11、骨髄由来単核球12、間葉系幹細胞13、内皮前駆細胞および成体血管壁14,15は 、定義されたすべてのメディアに対応して機能的な内皮細胞または平滑筋細胞のいずれかに分化できることが実証されている細胞抗原-1（のSca-1）+幹/前駆細胞を幹細胞由来と培養条件。さらに、幹細胞の無制限の自己再生能力が彼らにのみ増殖停止および老化を受ける前に有限回数に分割することができる成熟内皮および平滑筋細胞とは異なり、より良い候補者を作る。

移植のために成功した組織工学血管を生成するための足場材料の選択は、生体適合性、生体力学的特性、および生分解速度のようないくつかの要因に依存する。基本的には、移植片のための足場を作成するために使用される材料は、生分解性であるべきであり、不必要な受信者の免疫応答をマウントしません。加えて、細胞付着およびその後の生存に適し多孔性およびミクロ組織を包含する必要があります。現在までに、血管組織工学における足場のために使用される最も一般的な材料は、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリεカプロラクトン16のポリマーが挙げられる。さらに最近では、脱細胞化生物学的材料が持っているまた、ある程度の成功を収めて適用されて。いくつかの研究室は、自己細胞で脱細胞化ヒト、イヌ又はブタ血管を播種すると、凝固し、内膜肥厚17-19抵抗し、生物学的移植片を提供したことが示されている。血管組織工学における他の戦略は、フィブリンゲル13中に細胞を播種し、足場支持体20、21せずに細胞シートを生成し、例えば 、細胞外マトリックスタンパク質ベースの血管移植片が含まれる。

現在のプロトコルは、SCID（重症複合免疫不全に官能内皮細胞および平滑筋細胞、機能的なPiPSC由来の血管細胞を港に脱細胞化血管足場から成るバイオリアクターの生成、および組織工学血管のグラフトへのヒトPiPSCの分化を実証）マウス。 PiPSCは、これらの細胞がマウスにおいて腫瘍を形成するか、または倫理的な発生させないので、血管移植片の組織工学に使用する最適な細胞型であると同種免疫応答。さらに、我々は、PIPS内皮細胞およびPIPS平滑筋細胞を生成するための戦略は、10,11、効率的かつ再現可能であることを示している。その後、我々はこのようにグラフトと生存効果を増強する、密接にネイティブ血管内に存在するマトリックスタンパク質を模倣するPiPSC由来の血管細胞の播種のための脱細胞化容器を設計しました。さらに、従来PiPSC播種に血管の脱細胞はマクロファージなどの免疫細胞の種類によってマウント炎症反応の発生を防止する。さらに重要なことに、このプロトコルは、ヒトへの翻訳のための有望な血管の導管を生成する方法を表すだけでなく、マウスモデルを介して、血管組織再生を支配する分子メカニズムを研究し、理解する貴重な手段を提供しないだけでなく。

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プロトコル

実験動物の使用とケアのための制度委員会によって承認されたプロトコルに従って、すべての動物実験を行う。

文化メディアの調製

  1. F-12K培地、10％ウシ胎児血清（FBS）および100 U / mlペニシリンおよびストレプトマイシン：ヒト線維芽細胞株CCL-153のための培地を加える。
  2. PiPSC生成のためのリプログラミングメディアを行いますノックアウトダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）20％のノックアウト血清代替、0.1​​ mMのβメルカプトエタノールを含む、0.1 mMの最小必須培地（MEM）非必須アミノ酸、10ng / mlの塩基性線維芽細胞増殖因子2（のbFGF-2）、および100 U / mlペニシリンおよびストレプトマイシン。メディアを使用する前のbFGF-2をたてたびに追加します。
  3. 10％FBSを含むα-MEMを媒体、0.1mMのβメルカプトエタノール、100 U / mlペニシリン及びストレプトマイシン及び25 / mlの血小板由来成長因子：平滑筋細胞（SMC）の分化を誘導する分化培地（DM）を作る（PDGF-ββ）。
  4. 確認内皮分化メディア内皮細胞（EC）の分化を誘導する（EC-DM）：内皮増殖培地-2（EGM-2）の50ngを含有する培地/ mlの血管内皮増殖因子（VEGF）および100 U / mlペニシリンおよびストレプトマイシン。

部分的に人工多能性幹細胞へのリプログラミング2.ヒト線維芽細胞（PiPSC）

  1. 培養液中の0.04％ゼラチン溶液コーティングしたフラスコに培養ヒト線維芽細胞株CCL-153。
  2. 継代細胞1の比率で3日毎：6。 PiPSC生成の最適な効率のための通路9の前に細胞を使用してください。 90％の集密度 - セルが80に到達すると、トランスフェクションのために準備ができている。
  3. 八量体結合転写因子4（OCT4）、SOX2、クルッペル様因子4（KLF4）とC-MYC（のpCAG-OSKM）4再プログラミング因子を含むポリシストロンプラスミドpCAG2LMKOSimOを線形化する。 37℃で3時間のPvuI制限酵素5ユニットの5μgのプラスミドを消化する。浄化する製造業者のプロトコルに従って、市販のキットを有するプラスミド。
  4. 製造業者のプロトコルに従って、ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF）ヌクレオキットでエレクトロポレーションにより線状のpCAG-OSKMプラスミドの4μgのトランスフェクション2×10 6個のヒト線維芽細胞。穏やかに予め温め書き換えメディアを5 mlを含有するプレ0.04％ゼラチンコーティングしたT25フラスコにトランスフェクトされた細胞を播種する。
  5. 24時間後、トランスフェクションされた細胞の純粋な集団を選択するために25 / mlのネオマイシンのサプリメントを含む培地に変更。
  6. 4日目まで一日おきに培地を変更します。
    注：ヒト線維芽細胞は、再プログラミングの4日後にPiPSCになる。

内皮細胞および平滑筋細胞にPiPSC 3.分化

  1. 平滑筋細胞への分化を誘導するために4日間DMを含むコラーゲンIV予め被覆した皿上にシードPiPSC。 4日目まで一日おきに培地を変更します。
  2. コラーゲンIVのプレコーティング皿c上のシードPiPSC内皮細胞への分化を誘導するために6日間、内皮-DMをontaining。 6日目まで一日おきに培地を変更します。

4.脱細胞化大動脈移植の準備

注：すべてのソリューションおよび機器は、無菌であるべきである。

  1. 頚椎脱臼によりマウスを犠牲にし、解剖顕微鏡下での仰臥位でマウスを修正する。
  2. 胸腔を開くには、胸骨を通って、胸郭の周りにカット。大動脈を露出させ、心臓、肺や食道を削除します。静かに鉗子でペリ大動脈脂肪を取り除く。
  3. ハサミで前端から大動脈を切断し、優しく鈍ピンセットで終わりを開催しています。鈍的切開によって背後にある背骨列から大動脈を切り離します。慎重にはさみとのライゲーションの遠端からバイポーラelectrocoagulatorとカッティングで連結することにより大動脈からすべての分岐動脈を閉じます。
  4. 3メートルで大動脈内腔をフラッシュするの5ml注射器を使用血栓の形成を防ぐために、ヘパリンの100 Uを含む食塩水のリットル。
  5. 腎臓にそれ支店前に大動脈の後端をカット。大動脈の整合性を保つことは全体の手順の間に非常に重要です。
  6. リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中に希釈した0.075％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）水溶液5mlで大動脈内腔を洗い流す。
  7. 10センチメートルペトリ皿中0.075％SDS溶液中の胸部大動脈を浸す。 RTで150rpmで2時間オービタルシェーカー上でペトリ皿を置きます。
  8. PBS 5mlの大動脈内腔を洗い流す。
  9. 10センチメートルペトリ皿にPBSに大動脈を浸す。 RTで150rpmで2時間オービタルシェーカー上のペトリ皿を置きます。 PBSを20分毎に更新します。
  10. PBS 5mlの大動脈内腔を洗い流す。
  11. 最大1週間4℃でPBS中に脱細胞化大動脈移植片を保管してください。

PiPSCバイオリアクターコンディショニング5.デュアル播種

注：すべてのソリューションsおよび機器は、無菌であるべきである。組織培養フード内のすべての操作を実行します。

  1. 図1に示すように、バイオリアクターの流れ回路を組み立てるチューブをインキュベーションチャンバー、媒体リザーバ、蠕動ポンプ、コンプライアンス室を接続する。循環のために必要な媒体の最小体積を40mlである。
  2. 事前条件10センチメートルシャーレにDM培地における大動脈を浸漬することによって培養培地で脱細胞化容器。 RTで50 rpmで1時間オービタルシェーカー上のペトリ皿を置きます。
  3. 顕微鏡下で脱細胞化容器の両端に1センチメートル長ナイロンチューブ（OD 0.9ミリメートル、ID 0.75ミリメートル）を挿入します。 8-0絹縫合糸で容器とチューブを接続します。
  4. チャンバ壁の入口および出口ポート（1/32 "のチューブ）とナイロンチューブを接続することにより、インキュベーションチャンバー内の脱細胞化された大動脈ステントグラフトを組み立てる。培地の5mlのたびにとのインキュベーション室を維持します。
  5. トリプシン処理PiPSC予め温めを追加することで10回培養皿をカバーし、優しく料理を岩にトリプシン。トリプシンを破棄し、2インキュベーター中で料理を残す - 3分。皿に予め温めた培地を加え、細胞と培地を混合する。
  6. 血球計数器を用いて細胞数を数えます。 300×gで5分間、5×10 5個の細胞をそれぞれ含有する細胞懸濁液の遠心つのアリコート。完全に上清を吸引除去する。
  7. 完全に上清を吸引した後、DM50μlのPIPS細胞ペレットの1ペレットを再懸濁。脱細胞化された血管内腔に、この細胞懸濁液を注入する。
  8. 次に、マトリゲル100μlの他のPIPSの細胞ペレットを再懸濁します。脱細胞化大動脈移植片の上に物を慎重にピペット。
  9. 混合物はゲル状の状態になり、均等に容器外表面をラップするまで15分 - 10のを待ちます。 DMとのインキュベーション室を埋める。
  10. 37℃、5％CO 2インキュベーター内で全体バイオリアクターの設定を配置。手動で最初の2時間ですべての縦軸の周りに半時間を脱細胞化移植片を90°回転させます。
  11. 細胞接着を可能にするために12時間静置培養してください。
  12. 平滑筋細胞の分化を誘導するために蠕動ポンプにより内腔を通ってDMを配信。 5ml /分で24時間かけて20ml /分の段階的増加の初期流量を開始する。
  13. 24時間、20ml /分の循環媒体の流量を維持する。
  14. 媒体流を停止し、培養器の外に設定するバイオリアクターを移動します。
  15. 再シードPiPSCグラフトの内腔。 5.6 -トリプシン処理は、ステップ5.5のように数えると遠心分離機1×10 6 PiPSC。 50ng / mlのVEGFを含むEGM-2培地50μlの細胞を再懸濁。移植片の内腔に細胞混合物を注入。
  16. 内皮分化を誘導する50ng / mlのVEGFを含むEGM-2培地にインキュベーションチャンバー中の培地と全体の循環を変更します。
  17. 目に戻って設定するバイオリアクターを移動Eインキュベーター。手動で移植片を最初2時間で90度30分ごとに回転した後、12時間静置培養を続ける。
  18. 5ml /分で35 ml /分まで段階的増加からの流れを循環開始。 5日後、35 ml /分での流速を維持する。一日おきに循環し、チャンバ中に変更します。
  19. マウスへのさらなる移植のための設計移植片を収穫。

ダブルシードPiPSC移植片の6.移植マウスに

  1. 使用NOD.CB17-PRKDC血管移植片レシピエントとしてSCID / NcrCrl雄マウス。 35グラム、および良好な健康状態である - 常にマウスは、約10週齢で約25の重量を量ることを確認してください。
  2. 腹腔Hypnorm（25ミリグラム/ kg）およびHypnovel（25mg / kgの）の組合せを投与することにより、レシピエントマウスを麻酔。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目にワセリン眼軟膏を適用します。マウスはリラックスした筋肉を持っていると着実に呼吸していることを確実にすることにより、効率的な麻酔を確認してください。
    1. その首を剃毛し、延長に仰臥位でマウスを修正。マウス気道が透明なままであることを確実にするために麻酔薬と組み合わせて、硫酸アトロピン（1.7ミリグラム/ kg）を管理します。
  3. マウスの胸骨に下顎から正中切開を準備します。 5〜10倍の増幅と解剖顕微鏡下では、横方向に右の唾液腺を持ち上げ、右総頸動脈を露出させ、右cleidomastoid筋肉を取り除く。
  4. 静かに、近位端に向かって先端から右総頸動脈を動員する添付組織を取り除く。 8-0絹縫合糸で二回総頸動脈の中間部分を連結する二つの関係の間に解剖。
  5. 各容器の最後でオートクレーブ可能ナイロンチューブで作られたカフを通過してmicrohemostatクランプとのそれぞれの端を固定します。
  6. 一方の端部に縫合糸ネクタイを外し、ヘパリンのドロップ（100 U / ml）を適用する。直後に、目の遠位端を反転電子動脈全体カフ本体をカバーし、カフの8-0絹縫合糸で反転容器を固定する。
    1. 動脈の他の部分に同じ手順を繰り返します。食塩水でフラッシュ動脈が血餅を除去する。
  7. 動脈カフの上の脱細胞化された血管の端部を摺動し、8-0絹縫合糸でそれを固定することにより、頸動脈の両端間に脱細胞化された血管移植片を移植する。移植片の脈動を評価する前に、いずれかの端から血管クランプを取り外します。
  8. 元の位置に右の唾液腺を置きます。 6-0ポリグラクチン縫合糸を使用して中断した縫合糸で外科場所に皮膚を閉じます。
  9. 手続きが完了した後にそれが意識を再開するまで一貫して、マウスのバイタルサインを観察する。頸椎脱臼や収穫血管移植片による犠牲レシピエントマウスさらなる分析のために24時間または3週間後のどちらか。

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結果

PiPSCの成功した世代は、4転写因子、OCT4、SOX2、KLF4およびc-MYC（OSKM）を運ぶ線形化さpCAG2LMKOSimOプラスミドでヒト線維芽細胞をnucleofectingた後、4日確認された。 PiPSCは、線維芽細胞（ 図2A）と比較した場合に顕著に異なる表現型を表示し、mRNA（ 図2B）およびタンパク質（ 図2C）レベル10で4の再プログラミング因子を発現した。 PiPSCベースの血管移植片の有効性は、両方の内皮細胞および平滑筋系統に分化するPiPSCの能力に大きく依存する。それは、血管移植片を生成するためにそれらを利用する前に、規定された培地中で細胞を分化することによって、インビトロで PiPSCのこれらの特性を確認することが重要である。 図3は PiPSCの容量は、遺伝子（ 図3A）およびタンパク質（両方で機能的内皮細胞に分化することを示し図3B-D）レフELS、内...

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ディスカッション

現在のプロトコルは、サウンド、機能的な組織工学血管がヒト線維芽細胞からPiPSCを使用して生成することができる、高速で簡単、効率的かつ再現可能な戦略を示している。この技術は、近い将来、再生医療、組織工学および潜在的に患者特異的細胞治療のための貴重なツールを表す。プロトコルの有効性を確保するための重要なステップは、PiPSCの準備、無菌であり、完全に脱細胞化大動脈移植片の準備、足場でPiPSCの成功播種と分化や血管のバイオリアクター中で大動脈移植片の無菌性を維持することが含まれる。

組織工学移植片の成功生成を開始するためには、PiPSCの準備が効果的に行われることを保証するために最も重要である。プロトコルが正常pCAG2LMKOSimO OSKMプラスミドとクレオ経由PiPSCへのヒト線維芽細胞株を「再プログラム」している。 surviv線維芽細胞ヌクレオは、このような高品質のOSKMのプラスミドの使用など、いくつかの重要なポイントに依存していた後、500との間の範囲の濃度のプラスミドのアル - 細胞は導入後特に敏感であるように千ng /μLでは、すぐにヌクレオ後に線維芽細胞の播種の...

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開示事項

著者は、競合する経済的利益を持っていない。

謝辞

この作業は、The British Heart FoundationとThe Oak Foundationの支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ヒト線維芽細胞 CCL-153ATCCCCL-153出生前ヒト胚性線維芽細胞
ATCC F-12K 培地 (ハムのF-12培地のKaighn改変)ATCC30-2004
ウシ胎児血清ATCC30-2020
胚性幹細胞に最適化されたノックアウトDMEM培地Life technologies (Gibco)12660-012
ノックアウト血清補充生命技術(Invitrogen)10828-028
ヒト基礎FGF-2 Miltenyi Biotech130-093-837
alpha-MEM mediumLife technologies (Invitrogen)32571093
Human PDGFR&Dシステム120-HD-001
ゼラチン溶液 2%SigmaG1393
プラスミド 20866: pCAG2LMKOSimO (SOX2, OCT4, KLF4, C-MYC)Addgene20866
 PvuI RestrictionEnzyme New England BiolabsRO150S
SureClean PlusBiolineBIO-37047
Nucelofection Kit (NHDF Kit)LONZAVPD-1001
NeomycinSIGMAG418
KL 1500 LCD, Illumination for Stereo MicroscopySCHOTTKL 1500 LCDCold Light Illumination for stereo microscopy
ニコンズーム胸像顕微鏡SMZ800ニコンSMZ800
パリンナトリウム塩シグマH3393
10%SDSストックソリューション分子生物学試薬セバーンバイオテクノロジーCAS151-21-3
ベッコのリン酸塩緩衝生理食塩水シグマD8537
マトリゲル(10mg / ml)BDA6661
シェーカー IKA Vibrax 振動台 VX 7 ジェプソンボルトンの、ジャンケ&KunkelS32-102
Masterflex L / SデジタルポンプドライブコールパーマーWZ-07523-80
Masterflex L / S 6チャンネル、6ローラーカートリッジポンプヘッドコールパーマーEW-07519-15
Masterflex L / Sポンプヘッド用大型カートリッジコールパーマーEW-07519-75
Masterflexプラチナ硬化シリコーンポンプチューブ、L / S 14、25フィートコールパーマー WZ-96410-14蠕動ポンプを通過し
0.5mmID、0.8mmODシリコンチューブSILEXN / Aチューブはインキュベーションチャンバー、メディアリザーバー、コンプライアンスチャンバーを接続します 
フィッティングレデューサー0.5〜1.6、天然ポリプロピレンイビディ10829アダプターは、2種類のチューブ
1/32インチチューブ、ID 0.01インチ(250µm) 材質: PEEKLabSmithT-132-010P移植片を外部チューブと接続するインキュベーションチャンバー壁を通るチューブ
ワンピースフィッティング LabSmithT-132-100上記のチューブをインキュベーションチャンバーの壁に通して固定
ナイロンチューブ(外径0.9mm、内径0.75mm) スミスメディカルN/Aチューブは、大動脈グラフトNODの両端に挿入します
。CB17-Prkdcscid/NcrCrl マウスCharles River
Surgical sutures, 8-0  silkETHICONW819
HypnormVetapharmVm21757/4000マウス用神経レプタナゲシック
Hypnovel (Midazolam)Roche59467-70-8麻酔導入
解剖顕微鏡Carl Zeissステミ 2000
ナイロン チューブPortex Ltd800/200/100/200直径 0.65 mm、長さ 1 mm; 動脈カフ電気
凝固器Martin SN 54.131動脈の動脈枝の結紮
バイポーラマイクロ止血鉗子Martin80-91-12-04血管端部の固定
血管拡張器S&TJFX-7
ベッセルディレーターS&TJFL-3dZ
ベッセルディレーターS&TD-5aZ
ミニアップライヤ AESCULAPFE572K
マイクロ止血剤クリップAESCULAPFE720K
外科用縫合糸、6-0 VICRYLETHICONV489
ヘダルチューブはますします 大

参考文献

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