オートファジーの解析で<em&gt;ペニシリウム·クリソゲヌム</em&gt;蛍光顕微鏡と組み合わせて飢餓パッドを使用した

サマリー

>jove_content<ここでは、飢餓パッド(中央の空洞を含む顕微鏡スライドにアガロースと水道水の混合物をアガロースと水道水の混合物)を使用してPenicillium chrysogenumのオートファジーを研究するための便利で強力な方法を紹介します。

要約

細胞品質管理システムの研究は、現代の研究において非常にダイナミックで関連性のある分野として浮上しています。細胞は、核酸、脂質、タンパク質などの生物学的に関連する分子への損傷に対して、いくつかの防御線を持っていることが明らかになりました。オルガネラダイナミクス(融合/分裂/運動性/遺伝)と厳密に制御されたプロテアーゼ活性に加えて、オートファジー(細胞の「自己摂食」)による余剰、損傷、または損傷したオルガネラの分解は、科学界から大きな注目を集めています。オートファジーの制御は非常に複雑で、遺伝的要因や環境要因に左右されますが、その多くがこれまで解明されていません。ここでは、糸状菌Penicillium chrysogenumのオートファジーを簡便に研究できる新しい方法を紹介します。これは、いわゆる「飢餓パッド」での真菌の増殖に基づいており、再現性のある方法でオートファジーを刺激するものです。サンプルは顕微鏡で直接アッセイされ、オートファジーの誘導/進行について評価されます。ここで提示するプロトコールは、P. chrysogenumとの使用に限定されず、他の糸状菌類での使用に容易に適合させることができます。

概要

糸状菌は、発達過程の研究のための優れたモデル系である。彼らは安い栽培、子孫と遺伝のアクセシビリティの高い番号のようないくつかの実験的な利点を提供します。最後の点は、様々な細胞メカニズムのそれまで未同定の遺伝子の重要性を調査できるように、形質転換体の構築のために特に重要である。糸状菌は、剰余金の除去および/または機能不全の細胞成分のための維持のためにミトコンドリアの完全性およびオートファジーを維持するため、異常なタンパク質の分解のためのプロテアーゼ活性のような細胞の品質管理経路のいくつかの要素とメカニズムの解明のためにミトコンドリアのダイナミクス尽力されてきた飢餓^1,2,3の時代に、細胞生存率。

糸状菌²におけるオートファジーの研究のために利用可能ないくつかの実験技術があります：液胞の（I）の調査私がプロテアーゼは、透過型電子顕微鏡⁴によって阻害されたときfはそれらが密なオートファジー体を含むこと、（ii）蛍光色素モノダンシルカダベリを使用して、蛍光顕微鏡^5,6酸性化オートファゴソーム構造の（iii）の検出によりGFP-Atg8病巣を監視することによりオートファゴソームの可視化^7。

ここで、オートファジー研究のために、ペニシリウム·クリソゲヌムを成長させる新規な方法が提示される。主な要素は、単にア....

プロトコル

P.の調製飢餓実験用クリソゲヌム

1. P.の場合関心のクリソゲヌム株は米（「緑米'）に保管され、1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに菌糸体を胞子形成に覆わ2-3米粒を配置。 500μlのYGG（10g / lのKClを、20g / lのグルコース、10g / lの酵母窒素塩基、5グラム/リットルのK ₂ HPO _4、20g / lの酵母エキス）で塗りつぶす。
   1. 胞子が効率的にお米から切り離すことができるように、30秒間チューブをボルテックス。
   2. 室温で1日（ 例えば 、20〜25℃）のためにチューブをインキュベートする。
   3. 無菌水道水におけるこの胞子懸濁液の1/50希釈液を調製、よく混ぜる。
2. P.の場合関心のクリソゲナム菌株は、400μlの滅菌水道水及び約100mgのglのを含む1.5 mlのマイクロ遠心チューブに菌糸体の小片を移送、寒天プレート（ 例えば 、YGG寒天プレート）上に保持されている無菌の歯のピックまたはピペットチップを使用して、お尻のビーズ。
   1. 2分間ボルテックスチューブを菌糸体が断片化になるように。すぐにチューブの内容を使用してください。

結果

Pにペルオキシソームの劣化の上に詳細なプロトコルの有用性を実証するために、 クリソゲナム菌株 Ws54-1255（GFP-SKL）を分析した。この株ではGFP-SKLは通常、ペルオキシソーム⁹にインポートされます。サンプルは、蛍光顕微鏡によって分析されている場合に、複数の球状の外観をもたらす。オートファジーが発生した場合は、空胞を拡大。 GFP-SKLは、オートファジー（pexophagy）によって液胞に取り込まれる。によるGFPは液胞プロテアーゼによる分解に対して耐性であるという事実は、これらの細胞小器官^10を標識する。したがって液胞にこの株、液胞の拡大とGFP-SKLの局在におけるオートファジー（pexophagy）を観察するための2つのパラメータは、便利に蛍光顕微鏡で監視されている。

インキュベーションの20時間で、GFPは液胞（ 図1）で観察されることはありません。また、液胞の拡大が行われていません。しかし、成長GFP標識液胞の40時間で（ 図.......

ディスカッション

ここで紹介する方法はPにオートファジーの便利で再現可能な研究を可能にするクリソゲヌム 。例えば、それらはこの菌かのオートファジー応答を調節することができるかどうかを、種々の化合物の有効性をスクリーニングするために使用することができる。ラパマイシンを用いた結果は、TORシグナル伝達の阻害は、Pにおけるオートファジーの顕著な誘導を導くことを証明しているクリソゲヌムまた他の生物¹¹のために実証されている。

これは、より洗練された顕微鏡（ 例えば 、共焦点レーザー走査顕微鏡）での分析のため飢餓パッド上に成長した菌糸体を使用することが可能である。これは、サンプルが目的（倒立顕微鏡）の上の目的の下に置かれているかどうかは問題ではありません。さまざまな特定のコンパートメントをターゲットに蛍光タンパク質はオートファジーの間に異なるオルガネラの運命を監視するために使用することができる（ 例えば、ミトコンドリア- > mitophagy、小Reticulum - &g.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
中央空洞付き顕微鏡スライド	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	H884.1	これらは、洗浄後に複数回使用できます。
ガラスビーズ	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	A553.1	直径: 0.25 - 0.50 mm